胰腺癌组织中METTL3表达增加与患者生存差相关

背景

甲基转移酶样3 (METTL3)在各种正常和癌变组织中均有表达。截至目前，METTL3在人胰腺癌(PC)组织中表达的临床意义尚不清楚。本研究旨在探讨PC组织中METTL3表达的预后价值和临床意义。

方法

利用TCGA、GTEx和GEO公共数据库研究m的mRNA表达水平⁶胰腺组织与正常胰腺组织的家族成员及其关系。采用免疫组化方法分析METTL3在癌组织与邻近正常组织中的表达差异。采用Log-rank生存分析和Cox模型分析评估预后价值。利用TCGA和GEO数据库中的PAAD样本，对与METTL3高度相关的基因进行免疫浸润分析和基因集富集分析。

结果

通过对TCGA、GTEx和GEO公共数据库的分析，我们发现m⁶A家族成员在PC组织中与正常胰腺组织相比具有较高的相关性，与m⁶一个家族成员PC组织与邻近正常组织有显著差异。此外，scRNA-seq数据显示METTL3在恶性上皮细胞中表达水平较高。我们的免疫组化结果也证实了PC组织中METTL3免疫染色强度明显高于相邻正常组织(P= 0.015)。METTL3蛋白高表达的PC患者总生存期(OS)明显低于METTL3蛋白低表达的PC患者(HR = 1.788, 95% CI 1.071-2.984，P= 0.026)。进一步分析来自数据库的PC数据显示，METTL3表达与多种肿瘤浸润免疫细胞相关，并参与m⁶PC组织中的修饰和代谢。

结论

在PC组织中发现METTL3蛋白水平表达增高，提示METTL3表达参与了PC的进展，可作为预测该恶性肿瘤预后的重要标志物。

胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，预后较差[1,2］．在世界范围内，前列腺癌是男性第12大常见癌症，女性第11大常见癌症，是癌症相关死亡的第7大主要原因[3.］．PC的发生与生活方式密切相关，吸烟、饮酒、饮食也是危险因素[4］．PC患者通常诊断为晚期，无特异性症状，或缺乏敏感、特异性肿瘤标志物，5年生存率小于10% [2,5,6,7］．因此，迫切需要开发新的生物标志物和治疗策略来治疗PC [8］．

米⁶A是高等真核生物中聚腺苷化mrna和长链非编码rna (lncrna)中最普遍的内部修饰[9］．一般为3 ~ 5米⁶在保守序列RRACH的每个mRNA上都有A位点(R = G或A, H = A, C或U)，它富集分布在长外显子、终止密码子和3'端非编码区(3 ' utr)附近[10,11］．mettl13和甲基转移酶like-14 (METTL14)是m的核心蛋白⁶甲基转移酶[12］．众所周知，METTL3在促进乳腺癌、结直肠癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌等几种人类癌症的癌细胞增殖中起重要作用[13,14,15,16,17］．

METTL3，也称为MT-A70，有两个关键结构域，用于结合s -腺苷甲硫氨酸(SAM)和催化m⁶A，分别为[18,19METTL3与METTL14可形成稳定的异源二聚体核心复合物，在细胞m中起作用⁶哺乳动物核rna的沉积[9］．METTL3已被证明是促进肿瘤进展的重要基因。如上调METTL3可通过miR-1246/SPRED2/MAPK信号通路促进结直肠癌细胞转移[20.］．在胃癌中，METTL3水平上调，METTL3水平升高是患者预后不良的重要预测因素[21］．也有证据表明，METTL3可通过抑制抑瘤剂let-7 g加速乳腺癌细胞增殖，METTL3可增加HBXIP的表达，形成HBXIP/let-7 g/METTL3/HBXIP的正反馈环路[13］．METTL3也可促进某些致癌mrna的翻译，METTL3缺失可使肺癌细胞对BRD4抑制敏感并抑制致瘤性[22］．此外，我们还发现METTL3与m的其他成员显著相关⁶与正常组织相比，PC组织中的一个系统。这些结果表明，METTL3可能是一个促进癌症进展的关键致癌基因。截至目前，METTL3在PC中的表达模式及临床意义尚未见报道。

截至目前，人类PC组织中METTL3表达的临床意义仍未得到很大程度的探索。在本研究中，我们检测了METTL3在人PC组织和邻近正常胰腺组织中的表达，并进一步回顾性研究了METTL3在PC中的表达的预后价值和临床意义。此外，我们还通过生物信息学分析揭示了METTL3在人PC组织功能调节中的重要作用。

患者和样本

人胰腺癌组织芯片，包括99个PC组织和71个相应的相邻正常组织，购自上海欧都生物科技有限公司(批号:H-Pan-Ade170Sur-01)。所有患者术前均未接受放化疗或其他辅助抗肿瘤治疗，组织病理诊断为PC。由于抗原提取过程中缺失了4个组织点，4例患者样本的生存信息缺失，最终纳入本研究共91例患者(其中男性55例，女性36例)。详细临床参数见表1．所有癌组织经H&E染色和病理检查均证实为PC。本研究得到了我院伦理委员会的批准。

免疫组织化学(包含IHC)

采用免疫组化法检测METTL3在人PC组织及邻近正常组织中的表达。简单地说，石蜡包埋的组织切片在90°C下干燥4小时，在二甲苯中脱蜡，然后在分级乙醇溶液中再水化。用EDTA溶液(1mm, ph9.0)进行抗原提取。冷却后的组织切片在0.3%过氧化氢溶液中浸泡15分钟以阻断内源性过氧化物酶活性，用PBS冲洗5分钟，用3% BSA溶液在室温下堵塞30分钟。PBS洗涤后，用一抗(兔抗人METTL3单克隆抗体，目录编号:;ab195352，购自Abcam，使用比例1:150)，4℃过夜，然后用酶标二抗在37℃孵育30分钟。以二氨基苯为显色剂，苏木精为核反染剂。然后对切片进行脱水、清除和安装。

免疫组化染色评价

METTL3免疫染色强度根据H评分方法如上文所述[23,24］：H评分=(%未染色肿瘤细胞× 0) +(%弱染色肿瘤细胞× 1) +(%中度染色肿瘤细胞× 2) +(%强染色肿瘤细胞× 3)。的H评分范围从0(100%阴性肿瘤细胞)到300(100%强染色肿瘤细胞)。记录评分结果，用于进一步的统计分析。

m的相关性和不同表达分析⁶一个家庭

TCGA PAAD RNAseq数据从UCSC Xena网站下载(https://xenabrowser.net/)．正常胰腺组织RNAseq数据从GTEx数据库下载。从GEO数据库(GEO: GSE15471)下载包含PC组织和相邻正常组织的阵列的表达谱分析。利用TCGA和GTEx数据库中的RNAseq数据对m进行相关性分析⁶一个家庭。利用GEO数据库中的数据对不同表达基因进行分析⁶一个家庭。相关和差异表达分析可视化采用R包“pheatmap”。

scRNA-seq数据分析

结肠癌和PC scRNA-seq数据从GEO数据库(GEO: GSE146771;地理:GSE155698)。下载的数据由R包“Seurat”进行处理，然后再进行官方流程。

免疫细胞浸润分析

从ImmuCellAI下载24个TCGA PAAD免疫浸润细胞的分数(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/ImmuCellAI#! /)．采用R包“ggpubr”对METTL3与免疫浸润细胞进行相关性分析。

基因集富集分析

利用TCGA PAAD RNAseq数据对与METTL3高度相关的基因进行富集分析(r> 0.5)。采用R软件包“clusterProfiler”进行基因集富集分析。利用“enrichment go”功能实现生物过程、细胞成分、分子功能和KEGG。所有的图都是通过“dotplot”功能实现的。

统计分析

采用Prism 7软件(GraphPad)和RStudio 6.3进行统计分析。采用卡方检验比较人PC组织中METTL3低表达和高表达患者的疾病相关因素。采用Log-rank生存分析预测患者的OS。Cox模型用于评估涉及PC组织中METTL3表达的不同参数的预后价值。P< 0.05为有统计学意义。

METTL3与m中其他分子的相关性⁶酶系统

我们分析了从GTEx和TCGA数据库下载的RNA-seq数据，发现METTL3表达水平与m中其他分子显著相关⁶与正常组织相比，PC组织中的酶系统。1A, B).在PAAD中较高的相关性可能表明m⁶酶系统在肿瘤进展中起着重要作用。为了克服来自TCGA PAAD配对的相邻正常组织的少数样本，我们分析了GEO数据库中的19个PC组织和19个相邻正常组织数据。m⁶酶系统显示PC组织与邻近正常组织有显著差异(图2)。1C).基于以上对不同数据库的分析，我们发现m⁶酶系统与PC进展高度相关。

人类肿瘤组织中METTL3 mRNA表达水平升高

然后我们分析了从GEO数据库下载的PC和结肠癌数据，发现METTL3 mRNA在恶性上皮细胞中的表达水平高于正常上皮细胞。我们发现METTL3 mRNA在结肠癌组织中的表达水平明显高于邻近正常组织(GEO: GSE146771，图。2然后，我们也在人PC组织中证实了这一特征(GEO: GSE155698，图。2C, D)。此外，如图所示。2，我们还发现METTL3除在恶性细胞中表达外，在一些免疫细胞亚群中也有表达。一起，METTL3，作为m的重要成员⁶一种酶系统，可能在癌症进展中起着重要作用。

METTL3在PC组织中的表达和定位

在我们目前的研究中，通过免疫组化检测METTL3在PC组织和正常组织中蛋白水平的表达。METTL3阳性染色主要出现在细胞核，在癌组织中高表达，在邻近正常组织中低表达(图2)。3.而且4A).在PC组织中，当我们选择H得分= 185截止价值，病人用HMETTL3高表达组(54例)评分为>分185例H评分≤185的患者分为METTL3低表达组(37例)。表格1显示METTL3表达增加与年龄显著相关(χ²= 5.927,P= 0.015)，但METTL3的表达与性别、肿瘤大小、TNM分期、血管有无侵犯、生存时间、病理分期均无相关性。

人PC组织中METTL3表达的预后价值

数字4B显示PC组织中METTL3高表达患者的OS明显差于低表达患者(cut-off = 185;Hr = 1.788, 95% ci 1.071-2.984，P= 0.026)。单因素分析显示TNM晚期患者的OS明显低于TNM低分期患者(HR = 1.912, 95% CI 1.149 ~ 3.181，P= 0.013)。METTL3高表达患者的OS明显低于METTL3低表达患者(HR = 1.788, 95% CI 1.071-2.984，P= 0.026)。病理分期晚期患者的OS明显低于病理分期低的患者(HR = 1.852, 95% CI 1.127 ~ 3.043，P= 0.015)。多因素Cox模型分析显示，年龄(HR = 1.836, 95% CI 1.090-3.094，P= 0.022), TNM阶段(HR = 2.407, 95% CI 1.392 - -4.162,P病理分期(HR = 2.271, 95% CI 1.287-4.006，P= 0.005)， METTL3表达水平(HR = 2.243, 95% CI 1.309-3.843，P= 0.003)可作为预测PC患者预后的独立危险因素(表2)．

METTL3与肿瘤浸润免疫细胞的相关性分析

为了进一步探讨METTL3在肿瘤微环境中的作用，我们从TCGA数据库中对PAAD患者的METTL3表达水平与肿瘤浸润免疫细胞评分进行了相关性分析。我们发现METTL3与CD4、CD8、γδT、B细胞呈正相关，与天然Treg (nTreg)细胞呈负相关(图2)。5A, C)，提示METTL3表达增加可能在调节先天性免疫反应和适应性免疫反应中发挥重要作用。我们进一步分析了METTLE3与CD4的关系⁺发现METTLE3与Th1、Tfh细胞呈正相关，与Th2、Th17细胞呈负相关(图2)。5B).关于髓系细胞群体，我们的分析还显示METTL3与dc、巨噬细胞和单核细胞呈负相关(图。5D)。因此，这些结果表明METTL3与多种肿瘤浸润免疫细胞相关，但其在不同免疫细胞亚群中的生物学作用仍有待进一步探讨。

METTL3及其高度相关基因的功能富集分析

然后，我们基于METTL3及其在GO数据库PC数据中鉴定出的高度相关基因进行了功能富集分析:BP富集的前3个过程分别是“RNA剪接”、“RNA剪接，通过膨大腺苷作为亲核试剂的酯交换反应”、“mRNA剪接，通过剪接体”(图3)。6一个);富集前3位的CC突为“核斑点”、“剪接体复合体”、“核外周”(图2)。6B);富的前3个MF过程分别是“甲基转移酶活性”、“组蛋白结合”、“s -腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶活性”(图)。6C). KEGG数据库分析结果发现METTL3与“单纯疱疹病毒1型感染”、“剪接体”、“mRNA监测通路”等过程相关，如图所示。6D. METTL3可能参与PC中的RNA剪接和甲基化修饰。

在本研究中，我们使用TCGA、GTEx和GEO公共数据库来研究m的mRNA表达水平⁶胰腺组织与正常胰腺组织的家族成员及其关系。采用免疫组化方法分析METTL3在癌组织与邻近正常组织中的表达差异。通过对不同数据库的分析，我们发现m⁶酶系统与PC进展高度相关，METTL3 mRNA在PC组织中的表达水平显著高于相邻正常组织。此外，scRNA-seq数据显示METTL3在恶性上皮细胞中表达水平较高。我们的免疫组化结果也证实了PC组织中METTL3免疫染色强度明显高于相邻正常组织。METTL3蛋白高表达的PC患者的OS明显低于METTL3蛋白低表达的PC患者。从数据库进一步分析表明，METTL3表达与多种肿瘤浸润免疫细胞相关，并参与m⁶PC组织中的修饰和代谢。

通过对不同数据库的分析，我们发现m⁶酶系统与PC进展高度相关。首先，我们发现在mRNA水平上，METTL3在癌组织中的表达明显高于邻近正常组织，如PC或结肠癌。其次，我们还通过组织芯片和免疫组化检测了METTL3在蛋白水平上的表达，证实METTL3在癌组织中的表达明显高于相应的邻近正常组织。我们的研究结果显示，人类PC组织中METTL3蛋白的高表达水平与患者的OS较差有关。此外，METTL3蛋白水平与年龄和肿瘤大小显著相关。COX模型分析显示，METTL3表达和肿瘤直径可作为独立危险因素预测PC患者预后。因此，我们在本文中报道了METTL3在PC组织中表达明显增加，METTL3高表达是PC患者预后预测的不良预后因素。与我们的研究结果一致的是，在人类乳腺癌和胃癌中，METTL3在癌组织中表达上调，与相邻的正常组织相比，它也可以作为针对这些恶性肿瘤的个体化治疗的候选靶点[13,25］．

近年来，m的调控已引起人们的广泛关注⁶癌细胞甲基化对免疫检查点阻断治疗癌症疗效的影响[26,27,28］．例如，METTL3和METTL14的缺失可以显著提高抗pd -1治疗结直肠癌和黑色素瘤的疗效[26］．在机制上，METTL3和METTL14缺失后IFN-γ- stat1 - irf1信号通路被激活，导致IFN-γ分泌增加，最终增强CD8⁺肿瘤微环境中T细胞介导的抗肿瘤反应[26］．在此，根据数据库分析，我们还发现PC癌细胞中的METTL3与多种肿瘤浸润免疫细胞相关。因此，在PC细胞中实施METTL3是否能增加该恶性肿瘤对免疫检查点阻断治疗的敏感性仍有待进一步研究。

综上所述，我们的研究表明，METTL3在PC组织中表达显著增加，可作为该恶性肿瘤的重要预后因素。

在本研究过程中产生的分析数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

一个也没有。

国家自然科学基金项目(No.82172689, No.81902386)，中国博士后科学基金项目(No. 2021m700543, No. 2021m700547)，江苏省卫生健康委高层次人才计划项目(No. lgy2020034)，常州国际合作项目(No.82172689, No.81902386)资助。常州市应用基础研究基金项目(CJ20190094、CJ20210089)，常州市高水平医学人才培养计划项目(2016CZBJ001)，常州市卫生健康委重大科技计划项目(cj20210035);常州市卫生健康委员会青年人才发展计划(2020-233)资助项目(ZD202102);CZQM2020044)。

作者指出

1. 黄浩、李元和朱玉兰对这项工作做出了同样的贡献。

作者及隶属关系

1. 苏州大学第三附属医院肿瘤生物治疗科，常州213003

   李元，黄浩，朱玉兰，徐斌，陈俊军，刘颖婷，郑晓，陈鲁军

2. 江苏肿瘤免疫治疗工程研究中心，苏州大学第三附属医院，常州213003

   李元，黄浩，朱玉兰，徐斌，陈俊军，刘颖婷，郑晓，陈鲁军

3. 苏州大学第三附属医院细胞治疗研究所，常州213003

   李元，黄浩，朱玉兰，徐斌，陈俊军，刘颖婷，郑晓，陈鲁军

贡献

(一)构思与设计:陈丽娟、甄小欣。(二)行政支持:LJ Chen。(三)提供研究资料或患者:黄h、李y、朱yl。(四)数据的收集和汇总:黄H、李y、朱yl、刘yt。(五)数据分析与解读:黄宏、李勇、徐博、陈俊杰。(六)稿件撰写:均为作者。(七)稿件最终审定:所有作者。

相应的作者

对应到Lujun陈．

伦理批准并同意参与

本研究由上海欧都生物科技有限公司伦理审查委员会批准。YBM-05-02。所有入组患者均获得书面知情同意。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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