中国广东省HIV/ hcv合并感染患者丙型肝炎病毒的传播网络

背景

丙型肝炎病毒(HCV)合并感染在人类免疫缺陷病毒(HIV)/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者中很常见，因为他们有共同的传播途径。本研究旨在了解广东地区HIV/HCV合并感染患者的HCV亚基因型特征，探讨HCV分子传播网络及相关危险因素。

方法

从356例HIV/HCV合并感染患者中获得HCV血浆样本NS5B区域测序。构建邻居连接系统进化树，鉴定HCV亚基因型。基于最大似然系统发生树的传播网络由Cluster Picker确定，并使用Cytoscape 3.2.1进行可视化。

结果

从356份血浆样本中成功扩增出302条HCV NS5B序列。基于302个NS5B序列的邻居连接系统进化树揭示了广东地区HIV/HCV合并感染患者中HCV亚基因型的流行情况。其中优势菌株为6a(58.28%， 176/302)和1b(18.54%， 56/302)，其次为3a(10.93%， 33/302)、3b(6.95%， 21/302)、1a(3.64%， 11/302)、2a(0.99%， 3/302)和6n(0.66%， 2/302)。构建了5个主要HCV基因型的分子传播网络，聚类率为44.04%。亚基因型1a、3a、3b、1b和6a的聚类率分别为18.18%(2/11)、42.42%、52.38%、48.21%和44.89%。多因素logistic回归分析显示，除婚姻状况外，性别、年龄、传播途径、地理区域、基线CD4 + T细胞计数和亚基因型对患者的预后无显著影响(P > 0.05)。已婚或同居人群(与未婚人群相比)更难形成传播网络。

结论

综上所述，本研究基于HCV NS5B亚基因型，揭示了广东地区HIV/HCV合并感染患者HCV亚型的多样性和分布。婚姻状况可能是影响HCV传播网络形成的因素。

丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球慢性肝病的主要原因，如肝硬化、脂肪变性和肝细胞癌[1］．HCV显示出高度的遗传多样性，并已分化为7个主要基因型和大约100个亚基因型[2］．不同的基因型和亚基因型在临床结果、治疗反应和流行病学方面存在差异。丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)合并感染很常见，因为它们有共同的传播途径，包括受污染的输血、性交和注射吸毒者共用针头。中国hiv阴性患者的HCV患病率(HCV抗体阳性)为0.60%，而hiv感染者的HCV患病率显著高于hiv感染者。Data from the China National Free Antiretroviral Treatment Program from 2010 to 2011 showed that 18.2% of 33,861 HIV-infected patients were co-infected with HCV [3.］．在中国hiv感染者中，HCV的总体患病率估计为25.5-29.1%，其中静脉吸毒者和既往献血者的HCV合并感染率最高，超过80% [4］．艾滋病毒感染加速了丙型肝炎病毒感染的自然进展;因此，HCV合并感染已成为抗逆转录病毒治疗艾滋病毒/艾滋病患者最常见的死亡原因[5］．

病毒序列数据，如HIV-1的病毒序列数据，可用于重建分子传播网络，逼近传播网络，反映病毒在人与人之间的传播途径[6］．了解病毒的传播网络对于成功实施治疗和预防战略至关重要[7，8，9］．基于HCV全基因组的传播网络能更好地反映真实的传播关联。然而，由于HCV的多样性和二级结构，在实际工作中很难获得大样本的全基因组序列。丙型肝炎病毒基因组的聚类分析通常使用短序列[10]，以及非结构5B病毒区(NS5B)被认为是HCV基因型和亚基因型鉴定的重要靶点[11，12，13]并已应用于丙肝病毒传播网络的分析[14，15，16，17］．

系统发育分析已成功用于识别和解剖HIV-1传播簇。了解传播群的结构和特征有助于识别潜在的传播伙伴，揭示不同人群之间的联系，对设计干预方案很重要[18］．近年来，许多HCV分子传播网络已使用先前开发的HIV序列数据方法重建[16］．广东是中国经济最发达的省份之一，也是中国人口最多、密度最高的省份之一。广东省自2005年起每年呈报的丙型肝炎个案数目持续上升[19］．在这项研究中，我们描述了中国广东省HIV/HCV合并感染患者中HCV分子传播网络的传播模式和影响因素。

研究人群

血浆样本NS5B测序来自2010年1月至2013年9月在广州市第八人民医院招募的356例HIV/ hcv合并感染患者。纳入标准如下:(1)入组时年龄大于18岁，(2)HIV-1 ELISA阳性(中国北京万泰)，验证性Western blot(新加坡MP生物医药)，(3)抗HCV ELISA阳性(中国中山生物工程)，检测到HCV RNA > 1000 IU/ml(中国广州达安基因有限公司)。排除标准如下:(1)HBV表面抗原(HBsAg) ELISA阳性(中国中山生物工程公司)，(2)有其他病因引起的肝脏疾病的证据，(3)过度饮酒或使用肝毒性药物，(4)以前接受过抗病毒(HIV或HCV)治疗，以及(5)失代偿性肝硬化和肝细胞癌(HCC)、严重细胞减少、怀孕、哺乳状态、肾功能衰竭、心力衰竭或艾滋病定义疾病的个体。在患者登记时获得人口统计学信息，包括性别、年龄、传播途径、婚姻状况、地理区域和基线CD4 + T细胞计数，并通过图表审查提取。

RNA提取、扩增、测序

按照制造商的说明，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Germany)从140µl血浆中提取病毒RNA。丙肝病毒NS5B(H77: 7996-8638 nt)片段用PrimeScript One-Step RT-PCR试剂盒和Premix Taq (Takara Bio, Dalian, China)进行扩增。的NS5B片段用内部简并引物扩增(表1)在以下条件下:95°C持续3分钟，然后第一轮95°C持续30秒，55°C持续40秒，72°C持续60秒，95°C持续2分钟，接着第二轮95°C持续25秒，55°C持续40秒，72°C持续40秒，35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，阳性产物用引物R2送基因组学公司(天翼汇源，中国)测序。

HCV亚基因型的鉴定

利用BioEdit 7.0软件对所获得的序列进行反向补体测定和比对。然后，使用来自Los Alamos HCV序列数据库(https://hcv.lanl.gov/)．所有序列都是手动编辑的。HCV亚基因型的划分基于系统发育分析NS5B地区序列。采用Kimura 2参数替代模型构建邻居连接系统发育树，并采用MEGA 6.06进行1000个重复的bootstrap方法进行评价。

丙型肝炎分子传播网络分析

输电网络分析流程图包括四个步骤[20.］．首先，利用PhyML 3.0构建GTR + G + I核苷酸取代模型的最大似然系统发生树(ML树)。在1000个重复的Shimodaira-Hasegawa (SH)支持下，采用近似似然比检验(aLRT)的分支支持来确定系统发育树的可靠性[21］．第二，聚类选取器[22]用于确定簇内最大成对距离< 4.0%每个位点核苷酸取代的额外传播簇[23]且自举支持值≥0.9。第三，使用Mega 6.0.6计算Tamura-Nei 93成对遗传距离，以定义一个聚类内的联系。最后，利用Cytoscape 3.2.1对网络数据进行可视化处理(http://cytoscape.org)．

统计分析

用Excel建立数据库，使用IBM SPSS V25.0 (SPSS Inc.)进行统计分析。芝加哥,IL)。分类变量比较使用费雪精确检验。采用单因素和多因素logistic回归模型估计与聚类内传播相关的潜在因素。考虑的变量包括性别、年龄、传播途径、婚姻状况、地理区域、基线CD4 + T细胞计数和HCV亚基因型。构建多元逻辑回归模型，选取与聚类内传播独立相关的变量。报告了95%置信区间(95% ci)的比值比(ORs)和调整比值比(aORs)。对于所有统计检验，评价双侧P值的显著性水平设置为0.05。

参与者的特征

356份样本中HCV 302例(84.8%)NS5B序列扩增、纯化、测序成功。参与者的整体特征NS5B序列(n = 302)如表所示2．男性占研究人群的79.47%。80%以上的患者在确诊时年龄小于50岁。最常见的传播途径是注射药物(65.89%)，其次是异性性交(31.46%)。已婚或同居者占一半以上(69.54%)，未婚者占22.52%。表中所述广东的地理区域2如图所示。1，大部分患者来自珠三角地区(56.62%)。共有75.83%的受试者表现出CD4基线⁺T细胞计数< 200个/mm^3.．

HCV亚基因型测定

基于302的邻居连接系统发育树NS5B序列揭示了广东地区HIV/HCV合并感染患者中流行的HCV亚基因型(图2)。1)．其中优势菌株为6a(58.28%， 176/302)和1b(18.54%， 56/302)，其次为3a(10.93%， 33/302)、3b(6.95%， 21/302)、1a(3.64%， 11/302)、2a(0.99%， 3/302)和6n(0.66%， 2/302)。2010年与2013年HCV亚基因型分布无明显差异(表2)3.)．

传输网络的识别

1a亚基因型11个，1b亚基因型56个，3a亚基因型33个，3b亚基因型21个，6a亚基因型176个NS5B序列用于2010年至2013年的分子传输网络分析。共鉴定出42个传播聚类，302例HIV/HCV合并感染患者中133例(总聚类率44.04%)。平均集群大小为3.24，最小为2个(19个集群)，最大为11个(1个集群)。亚基因型1a、3a、3b、1b和6a的聚类率分别为18.18%(2/11)、42.42%(14/33)、52.38%(11/21)、48.21%(27/56)和44.89%(79/176)(图)。2)．

在所有42组中，88.10%(37/42)至少有一名受试者来自IDU组，57.14%(24/42)至少有一名受试者来自HET组，只有4.76%(2/42)至少有一名受试者来自MSM组或输血组(图2)。3.)．然而，当我们分析不同危险组的聚类率时，我们发现MSM组的聚类率高于其他组(66.67% vs.约40%)(表4)．在聚集的133例个体中，57.89%(77/133)与不同地区诊断的病例相关。来自东部地区的个体的聚类率高于其他地区的个体(60.00% vs.约40%)(表4)．

根据患者是否属于传播网络，性别、年龄、传播途径、婚姻状况、地理区域、基线CD4进行划分⁺检测T细胞计数和亚基因型。多因素logistic回归分析结果显示，除婚姻状况外，其他因素均无显著影响(P > 0.05)。已婚或同居人群(与未婚人群相比，aOR = 0.496, 95% CI: 0.285-0.863)更难以形成传播网络(表2)4)．

根据住院患者的流行病学研究数据，中国HCV亚基因型以1b(62.78%)和2a(17.39%)为主[24］．HCV亚基因型在地区间存在显著差异。华北地区HCV亚型主要为1b和2a型。而中国西南地区丙型肝炎病毒3b亚型的患病率明显高于其他地区[25]， HCV 6a是华南地区最常见的基因型[19，26，27］．

本研究结果显示，广东省HIV/HCV合并感染患者中HCV亚型以6a(58.28%， 176/302)为主，其次为1b(18.54%， 56/302)、3a(10.93%， 33/302)、3b(6.95%， 21/302)、1a(3.64%， 11/302)、2a(0.99%， 3/302)、6n(0.66%， 2/302)。广东HIV/HCV合并感染者的主要HCV亚基因型与广西相似(6a (46%)， 3a (20%)， 3b (16%)) [27]但与云南不同(3b (37.62%)， 3a (23.76%)， 1b (16.34%)) [28］．丙肝病毒基因型在亚太地区各不相同[29]，丙肝病毒感染和艾滋病毒感染的共同传播途径是共用受污染的注射器具、性传播和血液相关传播[29］．广东和广西在地理上靠近东南亚以及毒品贩运和使用的存在可能解释了HIV/HCV合并感染者中HCV基因型分布的相似性。与越南接壤的广西可能是第一个签订6a合约的地区。基因型6a从越南传入广西，然后通过贩毒路线和IDU网络进一步传播到广东[28，29，30.］．

广东地区HCV单一感染者中以1b型(67.7%)为主，其次为6a型(17.2%)、3a型(6.1%)、2a型(5.0%)、3b型(2.0%)、4a型(1.0%)和5a型(1.0%)[31]，这与在HIV/HCV合并感染患者中发现的截然不同。HCV基因型分布在单一感染和联合感染之间的差异最有可能是由于传播途径的不同，输血是单一感染中更常见的途径，注射药物是联合感染中更常见的途径[19，31］．

在中国，直接作用抗病毒药物(DAAs)治疗HCV单感染患者的实际疗效研究表明，在大多数HCV基因型中，持续病毒学应答(SVR)12率大于90% [32，33］．与慢性丙型肝炎(98.15%)和未治疗组(97.69%)相比，有代偿性肝硬化(92.73%)和既往治疗经历的受试者(77.78%)的SVR率显著降低[33］．现有的DAA方案对HIV/HCV合并感染患者的耐受性良好，治疗效率高，与单一HCV感染患者的疗效相似。不同CD4基线患者不良反应无显著性差异⁺接受DAA方案伴或不伴Peg-IFN和RBV患者的t细胞计数[34］．

在本研究中，约44%的HIV/HCV合并感染患者是HCV传播网络的成员，这与中国德宏市HIV/HCV合并感染患者的聚类率一致[17[39.1%， 95/243]，但高于澳大利亚HCV感染患者的聚类率(20.76%，49/236)[9]及加拿大温哥华(31.14%，156/501)[35］．亚型3b和亚型1b容易形成传播聚类，聚类率较高，分别为2.38%和48.21%。这表明，与其他亚基因型相比，这两种亚基因型在某些高危人群中具有持续性传播。多因素logistic回归结果显示，性别、年龄、传播途径、地理区域、基线CD4 + T细胞计数和亚基因型均不是患者是否进入传播网络的影响因素。已婚或同居人群比未婚人群更难形成传播网络4)，这可能是由于已婚人士或同居人士的性伴侣相对固定，他们发生高风险行为的概率较未婚人士低。超过80%的群集至少包含一名来自IDU组的受试者，在最大的群集中，超过60%的节点来自IDU组(图2)。3.)．这些结果提示，在今后的防控工作中，应更加重视注射毒品问题。

我们的研究有几个局限性。首先，我们的观察是基于2010年1月至2013年9月在广东省合并感染HIV/HCV的个体。较短的招聘期限可能会影响广东地区HCV流行率的判断。其次，我们重点研究了以IDU和异性接触为主的合并感染的主体。这些特定人群可能会使推断的促进HCV传播聚类的因素产生偏差。无论如何，我们确实在探索HCV传播网络方面做了一些工作，这可能有助于阻断HCV在HIV个体和普通人群中的传播。

综上所述，本研究利用系统发育分析的特点，概述了中国广东省HIV/HCV合并感染患者的HCV传播网络。总聚类率为44.04%，不同亚基因型在18.18% ~ 52.38%之间。性别、年龄、传播途径、地理区域、基线CD4 + T细胞计数和亚基因型不是影响因素，但婚姻状况是受试者是否进入传播网络的影响因素。在今后的防控工作中，应注意未婚人群和注射毒品感染患者的合并感染。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

艾滋病:

获得性免疫缺陷综合症

优势:

调整优势比

aLRT:

近似似然比检验

DAA:

直接作用抗病毒药物

丙肝病毒:

丙型肝炎病毒

艾滋病毒:

人类免疫缺陷病毒

HET:

异性恋

IDU:

注射吸毒者

男男同性恋者:

和男人做爱的男人

毫升树:

最大似然系统发生树

NS5B:

5 b类型

口服补液盐:

优势比

承宪:

Shimodaira-Hasegawa

SVR:

持续的病毒学反应

95%顺式:

95%置信区间

作者感谢北京市疾病预防控制中心的辛若雷教授和广东省公共卫生研究所的何翔教授对本文的专家指导。作者还感谢国家病毒资源中心(NVRC-PY-04)。

本研究由广州市科技计划项目(202002030028)资助。

作者指出

1. 邓希子、梁志伟和蔡卫平对这项研究也做出了同样的贡献

作者及隶属关系

1. 510440广州市白云区华英路8号，广州医科大学附属广州第八人民医院传染病研究所

   邓西子，梁志伟，蔡卫平，李峰，李俊斌，胡凤玉，兰云

贡献

YL, FH, XD和ZL构思了这项研究，并监督了研究的各个方面。XD和ZL参与实验。JL和WC收集了数据。YL, XD, ZL, WC对数据进行分析并撰写稿件。YL, FH, XD, FL。所有作者阅读并批准最终稿。

相应的作者

对应到Fengyu胡或Yun局域网．

伦理批准并同意参与

本研究由广州市第八人民医院医学伦理委员会(No. 201816107)批准。获得所有患者的书面同意。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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