森林啮齿动物病毒多样性的宏基因组分析及一种新型星状病毒

背景

啮齿动物是重要的病毒宿主和多种病毒的天然宿主。它们是对人类病毒传播具有极大威胁的野生动物之一。因此，研究携带病毒的啮齿动物，识别啮齿动物携带的新病毒，对预防和控制病毒性疾病具有重要意义。

方法

本研究利用宏基因组技术对东北6种森林啮齿动物粪便样本进行测序，获得了丰富的病毒组信息。选择重要的人畜共患动物在个别啮齿动物进一步序列和进化分析。

结果

在数量最多的10个病毒科中，RNA病毒包括正粘病毒科、小核糖核酸病毒科、布尼亚病毒科和沙粒病毒科，DNA病毒包括疱疹病毒科，昆虫病毒包括诺达病毒科和杆状病毒科，植物病毒tombusvirus科和噬菌体(肌状病毒科)。除肌病毒科外，各鼠种粪便中病毒科的丰度无显著差异。此外，还发现了一株新的星状病毒，其ORF和基因组排列与其他啮齿动物星状病毒相当。新鉴定的星状病毒与啮齿动物星状病毒分离物CHN/100的相似性最高。

结论

本研究获得的数据概述了这些啮齿动物粪便样本中存在的病毒群落，揭示了一些与已知人类或动物病原体密切相关的啮齿动物相关病毒。加强我们对自然环境中存在的啮齿动物携带的未分类病毒的了解，可以为预防和控制可通过啮齿动物传播的新型病毒暴发提供科学指导。

新出现的传染病严重影响全球公共卫生[1］．世界上新出现的传染病大多源自野生动物[2］．病毒的传播可能受到许多因素的影响，其中包括动物的密度和与人类接触的程度等因素[3.］．啮齿动物是与人类接触密切的动物之一，分布密度高。因此，啮齿类动物是重要的病毒宿主，是多种病毒的天然宿主，是对人类威胁极大的野生动物之一[4，5］．许多病毒在啮齿动物中不会引起明显的临床症状，但当病毒传播到人类宿主时，可能会引起严重的疾病。例如，汉坦病毒和沙粒病毒对人类是极其有害的病毒，但对啮齿动物却不是。

随着DNA测序技术的不断发展，近年来发现了许多新的病毒[2，4]，包括一些自然存在于宿主体内的致病性和非致病性病毒。随着全球对啮齿动物携带病毒的研究不断深入，[6，7，8，9]，人们开始深入了解啮齿动物携带的病毒。研究发现，大多数与公共卫生相关的病毒在啮齿动物中都有类似的病毒。这些研究也极大地丰富了关于病毒多样性的知识[6，8，9，10]并为今后可能发生的人畜共患疾病和追踪传播源头提供理论依据。不断有新的病毒报告，说明还有大量的病毒有待发现。因此，不同地理区域啮齿动物的病毒组成和新病毒挖掘对于预防和控制新型传染病具有重要意义。

在这项研究中，粪便颗粒是从myod rufocanus（先生)，Apodemus peninsulae（美联社)，Apodemus防治（AA)，Tamias sibiricus（TS)，北美寻常的（SV),Cricetulus卫（CT)，是黑龙江省海林市横道河子镇鼠林区的野生代表。这些物种的粪便被用来评估森林啮齿动物携带的病毒的种类。进行了宏基因组下一代测序分析，以筛选样本的病毒组。在此，我们概述了这些小鼠样本中的病毒谱，并发现了一种新的星状病毒。这些数据为追踪可导致人类和动物疾病的重要病毒病原体的来源提供了新的线索。

样品处理

选择黑龙江省海林市横道河子镇(A, N 44°48′44″，E 129°02′04″)森林地区于2020年5月21日至8月22日(夏季节)捕获鼠类82只，作为研究样本。共采集样品22份软性肌病(MR)，16大鼠半岛(AP)，15黑线姬鼠，11西伯利亚Tamias sibiricus (TS)，10Sciurus vulgaris (SV)和8大仓鼠(CT)。共有六个来自同一物种的样本被混合。

将粪便颗粒样品均质，用PBS按1:10的比例稀释，制成悬浮液，并进行涡流充分混合。然后，样品在4°C下以2000 rpm离心10分钟。随后，将上清液转移到新鲜试管中，离心10分钟，以完全去除细胞碎片、细菌细胞和其他杂质。上清液经0.22 μm注射器过滤器(Jet, Guangzhou, China)过滤浓缩。滤液在SW55Ti转子中用Beckman超离心机以45000 rpm的转速离心2小时。沉淀物在PBS中重新悬浮，通过0.22 μm注射器过滤器。然后将样品保存在- 80℃下，直到后续分析。

病毒宏基因组学分析

按照制造商的建议，使用NEBNext®Ultra™DNA文库准备试剂盒for Illumina (NEB, USA)生成测序文库。在每个样本的属性序列中添加索引码。简单地说，通过超声将DNA样本破碎至300 bp大小，然后对DNA片段进行末端抛光，a尾，并与全长适配器连接，用于Illumina测序，以帮助进一步的PCR扩增。

最后，纯化PCR产物(AMPure XP系统)，使用Agilent2100生物分析仪分析文库的大小分布，并使用实时PCR定量。根据制造商的说明，使用cBot聚类生成系统对索引编码样本进行聚类。聚类生成后，在Illumina HiSeq2500平台上对文库制剂进行测序，并生成配对端读。

物种注释和丰度分析

采用Prinseq软件(版本0.20.4)评估样本数据质量，筛选低质量和重复序列，以啮齿动物基因组作为参考基因组。使用Bowtie2软件去除宿主DNA序列，使用Mira (v4.0.2)软件进行序列拼接和组装。使用BLAST +软件包中的BLASTX和BLASTN工具在本地NCBI病毒数据库中搜索组装和未组装序列，获得病毒注释。采用2019.2.1遗传版本对新标注病毒的ORF进行预测。

粪便上清在BHK-21细胞中的传代

BHK-21用于繁殖野生小鼠的粪便悬浮液，并根据先前发表的方法检测病毒[11，12］．简单地说，将均质粪便颗粒的上清液通过0.22 μ m注射器过滤器过滤，并接种到BHK21细胞上，然后孵育2小时以允许病毒吸附。加入新鲜培养基后，每天在37℃下孵育细胞，直到感染后7天发生CPE。感染细胞盲传3 ~ 6次，直至出现CPE。cpe阳性BHK-21细胞的上清进一步接种于BHK-21细胞以检测感染性病毒的存在。

星状病毒在cpe阳性细胞中的检测

cpe阳性细胞上清接种BHK-21细胞，培养36 h，采用实时荧光定量反转录PCR (RT-qPCR)、免疫荧光检测(IFA)分析接种细胞中星状病毒的存在情况。在RT-qPCR分析中，根据组装的contig序列设计了特异性扩增星状病毒靶基因的引物。

系统发育分析

与本研究病毒相似度较高的参考毒株序列从NCBI下载。基于近邻连接最大复合似然法，利用MEGA软件构建了1000个自举重复的系统发育树，分析了系统发育关系。

统计分析

利用MetaStat软件对3个样品中丰度最高的10个分类序列标签进行分析。这些差异被认为具有统计学意义P-value小于0.05。

排序和质量控制

对黑龙江省海林市横道河子镇林区采集的82份森林鼠类肠道内容物粪便样本进行DNA和RNA测序。插入长度为350 bp。显示重叠信息和低质量的碱基，以及未测量的碱基被排除在外。从六个样本中获得的干净数据总数为:2,384.93 (先生)， 2,090.33 (美联社)， 1,994.32 (AA)， 2,391.77 (TS)， 2,007.30 (SV)，以及2,148.70 (CT)．测序数据质量分布在质量评分Q20中，以保证后续进阶分析的正常顺序。使用Mothur软件对干净的序列标签进行冗余处理，以获得唯一的序列标签。6个样品有效序列百分比为:95.242%(先生)， 93.561% (美联社)， 97.509% (AA), 97.258% (TS)、93.121% (SV)及94.622% (CT)．(表1)．

粪便样本中的病毒群落，基于家庭级别的分类

利用BLAST +软件包中的BLASTX和BLASTN工具，将所有样本的预处理干净数据和组装序列与NCBI数据库中的病毒参考基因组进行比较，得到病毒注释结果。共分析了82科哺乳动物病毒、植物病毒、噬菌体、昆虫病毒和真菌病毒。每个样本中前35个病毒科的reads概述如图所示。1．此外，图中显示了每个样本科、属和种分类的概述可视化表示。2得了。

• (1)单链RNA病毒(正粘病毒科、小核糖核酸病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科)

  正黏病毒科的成员可在世界各地的各种物种中引起周期性大流行[13］．在本研究中，它们被划分为甲型流感病毒属和甲型流感病毒种。与正粘病毒科相关的reads在病毒中所占比例最大。该家族病毒在各样本中的比例为:45.04% (先生)、51.57% (美联社)， 41.08% (AA)， 41.9% (TS)， 27.59% (SV)及22.1% (CT)(图。2一个)。

  Picobirnaviridae家族成员可引起多种粘膜皮肤、脑、心脏、肝脏、神经和呼吸系统疾病[14］．在所有6个样本中都发现了Picorbirnaviridae家族病毒。这些病毒被归为皮比纳病毒属、人皮比纳病毒种、鼠皮比纳病毒V-111_USA_2008和狐狸皮比纳病毒。值得一提的是，人体小核糖核酸病毒在病毒中所占比例较大SV样本(2.64%)2C)。

  布尼亚病毒科传染性强、分布广、致死率高，可引起人畜严重传染病[15)，该家族的大多数成员，如裂谷热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、拉克罗斯脑炎病毒和汉坦病毒，在人类中引起致命疾病。汉坦病毒的自然宿主是啮齿动物，它能引起出血性肾热。这种病毒存在于6种森林啮齿动物的所有样本中。其中，粪便中的丰富SV(3.49%)高于其他样本。这个科的病毒被划分为正布尼亚病毒属和Shamonda病毒种(图2)。2B,C)．

  沙粒病毒科是一种存在于世界各地的包膜RNA病毒。拉沙热病毒、朱宁病毒和马丘波病毒可引起死亡率高的严重疾病[16］．因此，传染病的流行与当地啮齿动物的动态分布密切相关。在这项研究中，在所有六种小鼠的粪便中都检测到了这种病毒。本科病毒属于哺乳病毒属和拉沙哺乳病毒种。

• (2) DNA病毒(疱疹病毒科)

  疱疹病毒科的病毒是包膜的双链DNA病毒，根据系统发育聚类分为三个属:α疱疹病毒,β疱疹病毒,ɣ疱疹病毒(17］．在所有六种啮齿动物的粪便样本中都检测到该家族。该家族的病毒分别属于巨细胞病毒属、水痘病毒属、Mardivirus属和Cercopithecine herpesvirus 5和Gallid herpesvirus 2。2B,C)．

• (3)其他稀有病毒(诺达病毒科、杆状病毒科、tombusvirus科、肌病毒科)

  在粪便样本中鉴定出昆虫病毒(诺达病毒科、杆状病毒科)、植物病毒(tombusvirus科)和噬菌体(肌病毒科)。诺达病毒科的病毒属为Alphanodavirus和Betanodavirus，种为Pariacoto病毒和Barfin牙鲆神经坏死病毒。Tombusvirus科的病毒归属于Tombusvirus属，分布最广泛的前10个种中没有Tombusvirus科的病毒。值得一提的是AA而且CT未发现任何tombusvirus科成员。杆状病毒科和肌病毒科的病毒均未归属于该属，分布最广的10个种中均有该种。

• (4)未分类病毒

  目前，关于未分类病毒及其在森林啮齿动物中的进化的信息很少。在我们的数据中，许多reads在所有样本中都被归类为“未分类病毒序列”，很可能是之前未被研究过的未知病毒。对这些未分类病毒的鉴定和特征描述将有助于深入了解其他临床重要病毒的进化历史，以及它们在人类和其他动物中的传染性和毒性背后的遗传基础。这些信息对于未来治疗方案和疫苗研究的发展是重要的(图。2一个)。

人畜共患动物的系统发育分析

• (1)甲型流感病毒

  生物信息学分析结果表明，在6只田鼠中获得了一致的甲型流感病毒序列，拼接后获得了2341 bp的PB1片段，命名为鼠类流感病毒a CHNDB/2019。序列比对结果显示，该菌株与环境或其他生物中发现的病毒株核苷酸序列相似性为96.79 ~ 98.72%;其中，与GQ325637.1甲型流感病毒(A/environment/洞庭湖/湖南/ 3-9/2007 (H10N8))鼠适应毒株相似度最高。PB1片段的系统发育树结果显示，该病毒与A/environment/洞庭湖/Hunan/ 3-9-2007 (H10N8)在同一树枝上，两者的遗传距离最接近(图。3.一个)。

• (2)沙蒙达病毒

  生物信息学分析结果表明，在6种不同鼠类中获得了完全相同的Shamonda病毒剪接序列。通过拼接得到一个4314 bp的M片段，命名为鼠类Shamonda病毒CHNDB/2019。由于目前NCBI发表的Shamonda病毒序列相对较少，同源比对结果显示与该病毒基因组高度同源的序列非常少。与沙蒙达病毒分离株Ib An 5550核苷酸序列相似度最高(96.38%)，与其他病毒株相似度为86.21% ~ 96.20%。系统进化树分析表明，该病毒的M基因与已知病毒的基因同源性较低(图2)。3.B)。

• (3) Mammarenavirus

  样本AA，TS，SV，CT,美联社对啮齿动物进行测序，获得了一段序列长度为7178 bp的Lassa哺乳病毒片段，命名为啮齿动物哺乳病毒CHNDB/2019/01。另一方面，得到了一个7121 bp的片段先生啮齿动物，测序片段L;命名为啮齿动物哺乳病毒CHNDB/2019/02。序列分析表明，啮齿动物乳状病毒CHNDB/2019/01 L片段与温州乳状病毒分离物MYR-039的核苷酸序列相似性最高，为98.59%;啮齿动物乳状病毒CHNDB/2019/02 L片段与大鼠乳状病毒分离物RnYM3-2016的核苷酸序列相似性最高，为97.89%。L片段的系统发育树分析与序列相似性结果一致。啮齿动物哺乳动物病毒CHNDB/2019/01和温州哺乳动物病毒MYR-039分离株聚集在一个分支上，啮齿动物哺乳动物病毒CHNDB/2019/01和大鼠哺乳动物病毒RnYM3-2016分离株聚集在另一个分支上(图2)。3.C)。

新型星状病毒的基因组特征

利用mNGS，我们从动物粪便中鉴定出一种新的星状病毒myod rufocanus暂定名为啮齿动物星状病毒CHNDB/2019。使用子系统技术的快速注释(RAST，http://rast.nmpdr.org)用于注释完整的基因组序列。结果表明，啮齿动物星状病毒CHNDB/2019基因组由6192个nt组成，包含两个开放阅读框:ORF1编码位于核苷酸(nt) 35-3750位的多蛋白，ORF2编码位于核苷酸(nt) 3719 -6178位的多蛋白myod rufocanus．

系统发育分析

全基因组序列的系统发育分析表明，ORF1(图;4B)， ORF2(图;4C)，和完整的基因组(图。4A)与山东省嘉乡县鼠星形病毒分离物CHN/100相似度最高，两者遗传距离最近。全基因组与CHN/100的nt序列相似度为84.39%，与其他啮齿动物星状病毒的nt序列相似度为78.08% ~ 67.74%。鼠星形病毒分离物CHN/100 ORF1与orf1b核苷酸序列相似性为86.2%，氨基酸相似性为74.45%。鼠星形病毒分离株CHN/100的OFR2与orf2的相似性最高，为81.27%，氨基酸序列相似性最高，为63.61%。因此，很明显，该病毒是一种啮齿动物星状病毒(GenBank提交号，MW927503)。

星状病毒在BHK细胞中的感染性

将含有新型星状病毒的粪便样本接种到BHK-21细胞中，以检测感染性星状病毒的存在。盲传4 ~ 5代后，BHK细胞出现CPE。采用IFA和RT-qPCR分析了接种细胞中星形病毒的存在情况。IFA(无花果。5A)确认了星状病毒衣壳刺突蛋白VP27特异性抗体的存在。另外，接种BHK-21细胞中是否存在星状病毒。采用星状病毒ORF1基因特异性引物ORF1- f (5 ' -CAGTCCTTGGGATTTCTC-3 ')进行RT-qPCR;ORF1-R (5 ' -TATTCTTTCGCACCATTAG-3 ')5B)。

目前已有一些关于啮齿动物携带病毒宏基因组研究的报道。段等采集了99只小鼠的肠道内容物鼠形老鼠和Apodemus防治并通过高通量测序研究其病毒组成。研究还发现，在该地理区域内，多株星状病毒同时在啮齿动物中传播，表明其遗传多样性极其丰富[18］．Vandegrift等人分析了978只散养鸡的血清病毒p . leucopus在宾夕法尼亚州捕获的小鼠中发现了来自26个不同科的多种新病毒，其中有一种高度分化的分段黄病毒[19］．Williams等人在同一年内分析了曼哈顿、皇后区、布鲁克林和纽约市布朗克斯7个居民区的老鼠粪便中的病毒。无偏高通量测序显示了来自18科21属的36种病毒，包括至少6种新病毒和3种新属[8］．本研究利用宏基因组技术对东北森林啮齿动物粪便样本进行测序，获得了丰富的病毒组信息。共检出哺乳动物病毒、植物病毒、昆虫病毒和噬菌体82科。在数量最多的10个科中，有RNA病毒、正粘病毒科、小核糖病毒科、布尼亚病毒科和沙粒病毒科;DNA病毒，疱疹病毒科;昆虫病毒:诺达病毒科和杆状病毒科;植物病毒，tombusvirus科;噬菌体，肌病毒科。

甲型流感病毒、沙蒙达病毒和哺乳动物病毒都是在田鼠体内发现的单链RNA人畜共患病毒[13，14，15］．在本研究中，我们从单个啮齿动物中选择了重要的人畜共患病基因进行测序和进一步的进化分析。随着人类居住地的变化，森林啮齿动物的栖息地往往靠近人类住区，它们的接触频繁。人类与森林啮齿动物的频繁接触大大增加了人畜共患病原体对公共卫生和安全的威胁[4，5］．因此，更好地了解病原体序列特征，对于追踪传播源头、预防人类传染病具有重要意义。本研究选择重要的动物共患病个体进行进一步的序列分析和进化分析。

星状病毒是一种感染哺乳动物和家禽的病毒，寄主范围很广。星状病毒感染人类可引起胃肠道疾病，也有少数病例出现神经系统症状[20.，21，22］．近年来发现了许多新的动物星状病毒[9]，而哺乳动物星状病毒如此丰富的遗传多样性，可能是由野生动物、家畜或人类的跨种传播造成的[20.］．这项研究还发现了新的病毒。通过序列拼接、软件预测、进化树分析和实验验证，鉴定出一种新的星状病毒，并将该病毒序列提交NCBI。样本中可能有比新发现的病毒更多的病毒。由于本研究的样本量有限，这些携带病毒的啮齿动物可能存在偏差。因此，我们将进一步研究，增加样本量，扩大采样点的范围。

本研究利用宏基因组技术对东北6种森林啮齿动物粪便样本进行测序，获得了丰富的病毒组信息。数量最多的前10个科分别是正粘病毒科、小核糖病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、疱疹病毒科、诺达病毒科、杆状病毒科、tombusvirus科、肌病毒科和未分类病毒。此外，选择重要的人畜共患动物在个别啮齿动物进一步序列和进化分析。发现了一株新的星状病毒，其ORF基因组排列与其他啮齿动物星状病毒相当。与啮齿动物星形病毒分离物CHN/100相似度最高。宏基因组学方法可以极大地提高我们对小鼠病毒多样性的理解。本研究利用宏基因组学技术分析了6种啮齿类动物粪便中病毒基因组的组成和丰度。这一策略可以扩展到世界各地的其他野生或家畜样本，最终增加我们对病毒种群和生态群落的了解，这将通过提供有意义的基础数据，帮助最大限度地减少潜在的野生动物相关病毒对公共卫生的影响。

本研究中分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

子:

开式阅读架

BHK21:

小仓鼠肾细胞系

CPE:

细胞病变效应

不适用。

本研究由黑龙江省教育厅基本科研基金资助(UNPYSCT-2020070)。

作者及隶属关系

1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江齐齐哈尔161006

   尹海昌，万德才

2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨哈平路678号，150069

   鸿雁陈

贡献

HY和DW撰写了这篇论文。HY准备了图表和表格。HC审阅并编辑了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到鸿雁陈．

伦理批准并同意参与

该研究得到了哈尔滨兽医研究所的批准，并遵循动物伦理准则和批准的协议进行。动物伦理批准文号为黑龙江SYXK-2006-032。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明，这篇文章的发表不存在利益冲突。

出版商的注意

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