定量蛋白质组学分析显示p38 MAPK通路参与牛副流感病毒3型复制

背景

牛副流感病毒3型(BPIV3)感染常引起呼吸道组织损伤和免疫抑制，进而引起牛呼吸道疾病复合体(BRDC)，是奶牛的主要疾病之一，每年造成巨大的经济损失。然而，BPIV3感染过程中涉及的发病机制和免疫调节机制尚不清楚。然而，BPIV3感染过程中涉及的发病机制和免疫调节机制尚不清楚。蛋白质组学是高通量蛋白质鉴定的有力工具，已被广泛用于了解病毒与宿主细胞的相互作用。

方法

在本研究中，我们报告了一项蛋白质组学分析，以研究BPIV3感染MDBK细胞的全细胞蛋白改变。为了研究BPIV3的感染过程和MDBK细胞的免疫应答机制，采用等压相对和绝对定量分析(iTRAQ)和基于Q-Exactive质谱的蛋白质组学方法。鉴定、标记和定量了MDBK细胞中参与BPIV3侵袭过程的差异表达蛋白(DEPs)。

结果

在bpiv3感染组和模拟感染组中，共鉴定出116个蛋白为DEPs，其中上调蛋白74个，下调蛋白42个。这些DEPs包括与炎症反应、免疫反应和脂质代谢相关的相应蛋白。这些结果可能为了解BPIV3的发病机制提供一些见解。荧光定量PCR和western blotting分析结果与iTRAQ鉴定结果一致。有趣的是，上调的蛋白MKK3与p38 MAPK信号通路相关。

结论

蛋白质组学分析结果表明，BPIV3感染可激活p38 MAPK通路，促进病毒复制。

牛副流感病毒3型(BPIV3)是一种包膜单链负链RNA病毒，属于副粘病毒科、呼吸病毒属[1］．BPIV3感染可导致牛肺炎和非典型性间质性肺炎，并引起严重继发细菌感染等相关临床症状。BPIV3感染和其他病毒或细菌感染常引起牛呼吸道疾病复合体[2］．牛的BRDC死亡率高达35%，给养牛业造成了巨大的经济损失[3.］．BPIV3的基因组大小约为15 kb，编码6种结构蛋白和3种非结构蛋白[4，5］．结构蛋白包括核蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)、基质蛋白(M)、血凝素-神经氨酸酶(HN)和同源三聚体融合蛋白(F)，辅助非结构蛋白包括C、V和D蛋白。研究了结构蛋白和辅助蛋白的多种功能和活性。例如，糖蛋白HN与宿主细胞表面的受体蛋白结合，随后融合蛋白F诱导膜融合[6，7］．保守的非糖化基质蛋白(M)是受感染细胞中最丰富的病毒蛋白。非结构蛋白包括V蛋白和C蛋白也由P基因编码。V、C和N蛋白共同调节病毒复制[5］．虽然对BPIV3蛋白的认识已经取得了很大进展，但BPIV3感染过程中涉及的发病和免疫调节机制仍不清楚。为了研究病毒入侵过程中宿主生理系统的变化，采用等压标签相对和绝对定量分析(iTRAQ)质谱(MS)技术进行了全局蛋白质组学分析。

iTRAQ定量蛋白质组学技术以其较高的灵敏度和定量精度被广泛应用于病毒与宿主相互作用的研究[8］．利用iTRAQ检测传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)感染的pk15细胞的差异表达蛋白(DEPs)，发现TGEV感染过程中有60个蛋白表达上调，102个蛋白表达下调。他们的分析显示，许多上调的蛋白与干扰素信号通路有关，TGEV感染可以激活JAK-STAT1信号通路[9］．为了为猪流行性腹泻病毒(PEDV)的发病机制提供科学依据，应用iTRAQ定量蛋白质组学技术鉴定了猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染相关蛋白[10］．等压相对和绝对定量标记(iTRAQ)结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法已被用于提供宿主细胞对各种病毒(包括经典猪瘟病毒)感染反应的蛋白质组学表达谱[11]、猪三角洲冠状病毒[12]、甲型流感(H1N1)病毒[13]，以及猪轮状病毒[14］．iTRAQ结合LC-MS/MS分析是一种用于差异表达蛋白(DEPs)综合分析的可靠定量蛋白质组学技术。在本研究中，首次通过基于itraq的蛋白质组学方法鉴定并定量分析了bpiv3感染MDBK细胞中的DEPs。MDBK细胞已被选择用于许多研究[15，16］．通常MDBK细胞不仅用于BPIV3的分离、繁殖和基础研究，而且还用作许多其他牛病原体的宿主，如牛呼吸道合胞病毒(BRSV)和牛疱疹病毒1型[17，18］．

在BPIV3感染24 h后，116个蛋白的表达水平发生了显著变化。根据生物信息学分析，这些细胞dep被分配到几个生物过程中。这些改变激活了p38 MAPK通路，促进了BPIV3的复制，提供了对BPIV3感染的宿主作用的全面了解。

病毒感染MDBK细胞

MDBK细胞在含10%胎牛血清(FBS)、100 g /ml青霉素和100 g /ml链霉素的DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基中培养。细胞培养条件:37°C, 5% CO₂BPIV3 DQ菌株(GenBank登录号:;HQ462571)经黑龙江八一农业大学预防兽医实验室分离鉴定。MDBK细胞以多重感染(MOI = 1)感染BPIV3。未感染细胞作为模拟感染组。每个试验设3个重复。观察细胞病变效应(CPE)，测定BPIV3的生长曲线。TCID₅₀采用Reed-Muench法测定。

用iTRAQ试剂分离、消化和标记蛋白质

所有细胞样本，包括bpiv3感染组和对照组，用冷PBS清洗2次，4℃1000g离心10 min，收获细胞。然后用300 μL SDT (1 mM PMSF, 2 mM EDTA和10 mM DTT)裂解细胞提取蛋白。溶解的蛋白质样品在4°C下以1 4000 g离心40 min收集。采用BCA蛋白法测定蛋白上清浓度。蛋白100 μg用测序级修饰的胰蛋白酶在37℃下消化8 h。蛋白质样品根据iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit instruction (AB SCIEX)使用不同的iTRAQ标签进行标记。3个模拟感染样品分别用iTRAQ 113、iTRAQ 114和iTRAQ 115进行标记;3份bpiv3感染样本分别用iTRAQ 116、iTRAQ 117和iTRAQ 118进行标记。然后用真空浓缩器将标记好的样品混合干燥。

质/ MS分析

用AKTA纯化系统对标记的肽样品进行纯化和分离。操作方法及溶液配制基本如前所述[19］．在214 nm下监测整个洗脱过程，每分钟采集一次。收集30个馏分物，在10个池中中和，并在C18墨盒中脱盐。各馏分真空离心后，用40 μL 0.1%三氟乙酸溶解，- 80℃冷冻，进行质谱分析。采用毛细管高效液相色谱(Thermo scientific EASY柱(2 cm, 100 μm 5 μm, C18)对样品进行分离。色谱条件:以0.1%甲酸的水(A)和0.1%甲酸的乙腈(B)为流动相。流速为300nl / min，流动相梯度程序:0 - 33 min，从0到40%(B);33-34分钟，从40到100%(B);34-35分钟保持100%，然后恢复到40%。然后，在正离子模式下使用Q-Exactive质谱(Thermo Finnigan)分析蛋白质(参数:质量范围:300-1800 m/z; Dynamic exclusion: 40.0 s, MS2 Activation Type: HCD, Normalized collision energy: 30 eV).

数据库检索和生物信息分析

在UniProt数据库(2016年3月22日发布，包含32 015个序列)的牛亚群数据库中搜索MS/MS数据，并用Mascot 2.3.02进行蛋白质鉴定。通过Paragon™算法自动选择定量肽，计算报告峰面积、误差因子(EF)和p值。计算bpiv3感染细胞中的蛋白表达水平，并与模拟感染细胞进行比较。折叠变化> 1.5和p值< 0.05的蛋白被认为是显著差异表达。执行自动偏置校正以减少人为误差。通过基因本体论(GO)和途径富集分析(http://www.geneontology.org)．

RNA提取和实时PCR分析

real-time PCR检测差异表达蛋白的mRNA水平。BPIV3感染组和对照组MDBK细胞总RNA按照厂家方案用TRIzol试剂(Takara)提取。RNA浓度用nanodrop -1000测定。琼脂糖凝胶电泳检测到总RNA 1 μL。这些样本的cdna是通过逆转录获得的。在含有12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM II、2 μL引物、2 μL cDNA样品和8.5 μL水的25 μL体系中进行实时荧光定量PCR。反应条件为95°C 10 min，然后依次为95°C 30 s、57°C 30 s和72°C 30 s，循环40次。得到了熔点曲线。以GADPH基因作为内参基因。所有引物均用于表中所示的PCR试验1．数据统计是基于三个独立的实验。

免疫印迹

用PBS清洗感染的MDBK细胞两次，并用裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl和1% Triton X-100，每50 ml缓冲液补充1片完全迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒)破坏细胞。细胞裂解液在12000 × g下离心10分钟，获得上清液。所有上清液均采用Bradford法进行蛋白测定。Western blot分析全细胞裂解物时，每个样品含有25-30 μg蛋白质当量，在SDS-PAGE加载缓冲液中解离，用12%梯度SDS-PAGE分离。然后将蛋白质转移到Immobilon-FL膜(Millipore)。一次抗体包括MKK3 (rabbit, Cell Signal Technology5674, Danvers, MA)， p38磷酸化(p-38) 1:1000 (mouse, Cell Signal Technology9216, Danvers, MA)， p-38 1:1000 (rabbit, Cell Signal Technology41666, Danvers, MA)， β-actin 1:10 000 (mouse, Sigma)，在4℃的膜上孵育过夜。山羊抗兔免疫球蛋白G和山羊抗小鼠免疫球蛋白G(1:1000，圣克鲁斯生物科技有限公司)作为二抗，室温作用1小时，进一步洗涤后，ECL检测试剂盒(北京生物海生物科技有限公司)增强化学发光显示免疫复合物。

统计分析

用Microsoft Excel进行统计分析，进行双尾Student 's t检验或单向方差分析(ANOVA)。p值< 0.05为有统计学意义。

MDBK细胞bpiv3活性的检测

为了确定BPIV3感染后进行蛋白质组学分析的最佳采样时间点，我们将MDBK细胞单层培养并接种BPIV3。在接种后0、6、12、18、24、36、48 h的不同时间点，收获细胞-病毒悬液，观察CPE(图2)。1A) TCID₅₀测量。根据TCID结果绘制BPIV3的生长曲线₅₀结果显示，BPIV3在感染后24至36小时内迅速增殖，表明病毒在细胞内复制活跃(图2)。1B)。

以1个感染倍数(MOI = 1)的剂量接种MDBK细胞，在感染后不同时间点观察CPE。结果显示，BPIV3感染细胞后12 h，病变开始明显，随着时间的推移，病变加重(图2)。1A).病毒滴度在36 h时达到约5.7的峰值，随后逐渐持续下降(图。1B).一般来说，进行蛋白质组学分析的最佳时间是病毒复制仍然很高，但没有观察到明显的宿主细胞细胞骨架或膜重排[20.］．根据感染后细胞病变情况结合病毒增殖情况，以24 h感染的细胞为时间点进行蛋白质组学分析。

蛋白质分析和iTRAQ定量

收集bpiv3感染和模拟感染的MDBK细胞的蛋白质样本，用iTRAQ试剂标记3个生物重复。通过整合模拟感染组(对照组)和bpiv3感染组(感染)3个生物重复体的肽段信息，获得两个实验组比例(比[感染/对照])的定量信息。

对两组蛋白表达水平的变化进行统计学分析。LC-MS /MS共检测蛋白2804个。116种蛋白质发生了显著变化P< 0.05(图2)，蛋白质变化比≥1.5。在这些蛋白中，有74个蛋白表达显著上调，42个蛋白表达显著下调。2)．在DEPs中，上调最显著的蛋白是与自噬相关的囊泡相关膜蛋白。最显著的下调蛋白是整合素补体蛋白，这是一种病毒感染的受体蛋白(表。2)．

dep的GO注释

dep的GO注释。这些蛋白被分为三大类:生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)(图。3.)．GO在生物过程中的富集分析表明，DEPs在单生物过程、对刺激的响应、代谢过程、细胞过程和生物调控5个过程中富集显著。参与生物调节过程的蛋白质最多，其次是参与刺激反应过程的蛋白质。在本研究中，刺激反应过程中的蛋白质主要包括酪氨酸磷酸酶、信号转导蛋白1、Rab5 GDP/GTP转换因子1、白细胞介素-13 (IL-13)、丝裂原活化蛋白激酶7 (MAPK7)、FOX转录抑制因子3 (Foxp3)、磷酸钙、蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白受体、MAP3K10、人端粒酶逆转录酶、SSNA1。IL-13是引起气道炎症最重要的炎症因子。它在慢性气道炎症疾病的发生中起关键作用，引起粘液的大量分泌。Foxp3是Fox转录因子家族的一员，在维持机体免疫功能方面起着重要作用[21］．bpiv3感染的MDBK细胞中的DEPs可能引起初始细胞应激反应。这些dep在BPIV3感染过程中的确切作用还有待进一步研究。

京都基因和基因组百科(KEGG)对DEPs的途径分析

KEGG通路数据库是一个基于分子相互作用通路和细胞反应网络的集合图。这些dep被识别并映射到6种KEGG通路，包括代谢、细胞过程、有机体系统、环境信息过程、遗传信息过程和疾病途径。有机体系统和疾病途径为富集途径，分别有37个和43个途径组。

在代谢途径中，DEPs参与了13个与葡萄糖、脂质、氨基酸和核苷酸代谢相关的通路(图。4A).这些途径影响细胞中三种主要营养物质的代谢。细胞过程涉及10个通路(图2)。4B)，包括Focal adhesion pathway和Phagosome pathway，这两种途径都参与了病毒感染过程。整合素蛋白是这两种途径的关键蛋白。溶酶体途径、吞噬体途径和自噬途径都参与了病毒感染的自噬过程。环境信息涉及11条通路，主要集中在病毒感染的通路和信号分子的相互作用(图;4C)。其中pI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路和TNF信号通路已被证实与病毒感染有关。基因信息处理类的注释蛋白在细胞的合成、转运、蛋白水解、剪接体等方面发挥作用(图。4D).在有机体系统类别中标注的蛋白与抗原加工和递呈、nod样受体信号转导、toll样受体信号转导、补体和凝血级联以及Th1和Th2细胞分化通路组相关。这些途径与宿主对病毒感染的免疫反应相关(图。4E).疾病类别标注的dep见图。4F.传染病中有十种途径聚集，其中五种与病毒感染有关。

通过对DEPs的分析，发现与MAPK信号通路相匹配的蛋白较多，包括FGF13、ERK5和MKK3。KEGG通路分析显示MKK3参与了14条通路，表明MKK3是BPIV3感染MDBK细胞过程中的关键调控蛋白(表2)。2)．

通过实时定量PCR (qRT-PCR)对所选蛋白质进行验证

为了验证iTRAQ鉴定的DEPs，采用qRT-PCR检测了8个蛋白的转录水平。本研究随机选取8种蛋白进行qRT-PCR。其中上调的4个蛋白包括AP-2复合亚基β蛋白(AP-2)、FGF13、肉豆蔻酰化富丙氨酸c激酶底物(MARCS)和MKK3蛋白。其他4种下调蛋白包括MHCII类(MHCII)、谷胱甘肽s -转移酶(GSTA1)、硒蛋白P (SepP)和组织因子途径抑制剂(TFPI)。如图所示。5，这些基因的表达水平与iTRAQ结果一致。qRT-PCR结果进一步验证了iTRAQ实验的可靠性。

p38 MAPK通路对BPIV3复制的影响

BPIV3感染激活p38 MAPK通路

MAPK通路在细胞内信号网络中起着多种作用。MKK3和MKK6被认为是p38的上游激酶。蛋白组学分析结果显示，BPIV3感染后MKK3水平明显上调(表2。2)．病毒感染被认为是一种细胞外刺激物，可激活p38 MAPK通路[22，23］．应该研究BPIV3感染是否在MKK3激活后激活p38 MAPK通路。

western blotting法检测bpiv3感染细胞中MKK3、p38和phospho-p38的表达。在BPIV3感染后6、12和24小时采集细胞样本。与mock组相比，感染组在不同感染时间点MKK3表达水平升高。BPIV3感染后12 h和24 h，感染组p38蛋白表达水平未见变化，而磷酸化p38蛋白表达水平明显高于模拟组(图。6)．因此，BPIV3感染诱导MKK3激活和p38磷酸化。MKK3的表达水平与之前的蛋白质组学结果一致，进一步验证了蛋白质组学分析的可靠性。

抑制p38 MAPK激活对BPIV3复制的影响

为了研究p38 MAPK通路的激活是否促进BPIV3的增殖，在感染前1小时用p38 MAPK通路抑制剂SB202190处理细胞。分别用浓度为1.25、5和10 μM的SB202190处理MDBK细胞。在感染后24 h采集细胞样本(MOI = 1)。

结果如图所示。7．BPIV3感染诱导p38磷酸化。抑制剂SB202190处理后，p38的表达水平呈剂量依赖性显著降低，说明SB202190抑制了p38的磷酸化(图202190)。7A和B)。BPIV3病毒滴度降低1.8 logTCID₅₀结果表明，p38 MAPK通路参与了BPIV3蛋白的复制(图2)。7C).结果显示SB202190能抑制BPIV3的增殖。因此，BPIV3激活了参与其复制的p38 MAPK信号通路。

iTRAQ LC-MS/MS是一种强大的定量蛋白质组学分析工具，已广泛应用于许多研究[24，25，26，27］．Gray等人使用2D凝胶电泳蛋白质组学研究BPIV3感染期间的体外细胞反应[28］．在本研究中，我们首次应用iTRAQ LC-MS/MS方法测定了BPIV3感染24hpi时MDBK细胞中DEPs的谱。感染后24 h共鉴定出116个dep。在GO分析的基础上，将DEPs分为19类、11类和9类，分别用于生物过程、细胞成分和分子功能(图。3.)．通路分析基于dep的数量来识别通路(图。4)．这些数据可为了解BPIV3感染的发病机制提供依据。

结果表明，PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路在BPIV3感染过程中发挥重要作用。根据这两条信号通路中DEPs的谱，只有ITGB3蛋白下调，其余蛋白上调。有趣的是，MAPK信号通路中匹配的蛋白数量相对较多，包括FGF13、ERK5和MKK3。KEGG通路分析进一步表明，MKK3参与了14条通路，提示MKK3是BPIV3感染过程中的关键调控蛋白。先前的研究表明，MAPK信号通路是呼吸道病毒的靶点，可调节感染过程的各个阶段[29，30.］．

MAPK级联在细胞内信号网络通路中起着多种作用。MKK3和MKK6被认为是p38的上游激酶，可以直接磷酸化酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸残基，激活p38 [31］．病毒感染被认为是激活这一途径的细胞外刺激物。免疫组化检测显示，感染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)感染绵羊肺部p-ERk1/p-p38磷酸化水平较健康绵羊明显升高[22］．在我们的蛋白质组学研究中，与对照组相比，在BPIV3感染后24小时，MKK3水平显著上调。因此，我们检测了BPIV3感染后p38 MAPK通路的蛋白表达水平。

首先，我们研究了BPIV3感染是否激活p38 MAPK通路。结果表明，BPIV3在感染后诱导p38磷酸化。与对照组相比，BPIV3感染6 h后p38磷酸化表达明显升高，说明BPIV3在感染早期可诱导p38 MAPK通路激活。

多种细胞外应激激活MKK3-p38 MAPK级联，包括特异性抗原、促炎细胞因子、紫外线、热休克和其他应激反应[32］．根据柯萨奇病毒激活p38 MAPK机制的结果，MKK3-p38 MAPK在感染早期被暂时激活[33］．在我们的研究中也发现了同样的结果，MKK3-p38 MAPK在BPIV3感染后6小时被激活。随着BPIV3感染时间的逐渐延长，p38 MAPK的磷酸化在感染后24 h时明显升高。在感染后期，p38仍持续被激活，推测可能是BPIV3感染诱导促炎细胞因子释放所致。这些释放的与受体结合的促炎细胞因子进一步增强了p38 MAPK通路的激活[34，35］．

许多研究表明，p38是病毒复制所必需的。病毒对MAPK通路的激活，如刺激JNK和p38 MAPK通路，促进病毒粒子的释放[32］．在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染中，抑制JNK和p38通路后，病毒复制受到抑制[36］．在PEDV感染中也发现了同样的结果[37］．为了检测p38 MAPK通路在BPIV3复制中的作用，我们分析了病毒滴度。我们发现抑制剂SB202190以剂量依赖的方式显著抑制BPIV3复制。同时发现SB202190处理后p38表达被抑制。与未处理组相比，抑制剂处理细胞的病毒滴度显著降低。这些结果表明，p38 MAPK通路的激活促进了BPIV3的复制。

本研究通过iTRAQ和lc - ms - s蛋白组学分析，对bpiv3感染的MDBK细胞中的DEPs进行了鉴定和定量分析。大多数DEPs是与炎症反应、免疫反应和脂质代谢相关的蛋白质。虽然许多显著上调或下调的蛋白和通路与BPIV3感染的症状或病理反应密切相关，但需要进一步的功能研究来了解宿主细胞对BPIV3感染的致病机制和分子反应。

本研究结果表明，BPIV3感染激活p38 MAPK通路，这对其复制至关重要。蛋白组学和western blot分析表明，BPIV3感染激活了p38 MAPK信号通路。我们未来的研究将集中在病毒复制的哪一步受到p38激活的影响。

不适用。

BPIV3:

牛副流感病毒3型

BRDC:

牛呼吸道疾病

iTRAQ:

等压标签的相对和绝对定量分析

DEPs:

差异表达蛋白

TGEV:

传染性肠胃炎病毒

PEDV:

猪流行性腹泻病毒

BRSV:

牛呼吸道合胞病毒

DMEM:

杜尔贝科改良的鹰牌中号

的边后卫:

胎牛血清

CPE:

细胞病理效应

走:

基因本体论

IFA:

间接免疫荧光法

我:

感染多重性

IL-13:

Interleukin-13

MAPK7:

丝裂原活化蛋白激酶7

具体:

FOX转录抑制因子3

马克:

豆蔻酰化富丙氨酸c激酶底物

MHCII:

MHC II类

GSTA1:

谷胱甘肽S-transferase

然而:

硒蛋白P

活性:

组织因子途径抑制剂

不适用。

黑龙江省八一农业大学自然科学人才项目(ZRCQC201808)、黑龙江省农业管理局科研项目(HKKYZD190305)、黑龙江省博士后科学基金(LBH-Z20204)、黑龙江省八一农业大学博士研究基金(XDB201816)、黑龙江省八一农业大学科研团队支撑项目(tdjh2011904)资助。大庆市科技项目(zd-2021-69)。

作者指出

1. 李丽阳、李鹏飞:这些作者对这项工作做出了同样的贡献

作者及隶属关系

1. 黑龙江八一农业大学，大庆163319

   李丽阳，陈奥，李汉兵，刘哲，于丽云，侯锡林

2. 黑龙江八一农业大学农业农村部大庆市农村农产品及加工产品检验检测中心，黑龙江大庆163319

   李阳李

3. 哈尔滨医科大学附属第五医院肾内科，黑龙江大庆163319

   Pengfei李

贡献

LL和PL进行蛋白质组学实验，分析实验数据，是撰写稿件的主要贡献者。AC进行细胞培养和TCID₅₀检查。HL进行qRT-PCR检测。ZL进行western-blot检查。LY修改稿。XH设计了所有实验并分析了实验数据。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Liyun余或Xilin侯．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称不存在利益冲突。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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