韩国代表性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分离株的全基因组测序和遗传特征

背景

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种嗜巨噬细胞动脉病毒，具有极高的遗传和致病异质性，在全球养猪业造成重大经济损失。PRRSV可分为两个物种[PRRSV1(欧洲)和PRRSV2(北美)]，通常根据仅占全基因组5%的ORF5基因进行诊断和遗传分化为几个谱系。本研究基于简化的序列独立、单引物扩增(SISPA)技术和下一代测序(NGS)实现非选择性扩增和全基因组测序(WGS)，并在全基因组水平上对韩国PRRSV场分离株进行基因表征。

方法

采用SISPA-NGS方法结合生物信息学管道，对19株具有代表性的韩国PRRSV株进行从头组装，获得PRRSV全基因组。进行系统发育分析、非结构蛋白2 (NSP2)的插入缺失(INDEL)模式分析和重组分析。

结果

通过SISPA-NGS方法获得了19个覆盖深度较高的完整PRRSV基因组。韩国PRRSV1属于韩国特异性1A亚型和疫苗相关亚型1C谱系，没有证据显示重组和发散性遗传异质性与保守的NSP2缺失模式。在韩国PRRSV2分离株中，可以鉴定出与改良活疫苗(MLV)相关的谱系5病毒、谱系1病毒和韩国国家特异性谱系(KOR A、B和C)。朝鲜族谱系的NSP2缺失模式与MN-184株(谱系1)的NSP2缺失模式一致，表明朝鲜族谱系具有共同的祖先和独立的进化。从2010年代分离的韩国株中检测到多种重组信号，提示流行的KOR C株与MLV株之间存在自然的谱系间重组。有趣的是，韩国株GGYC45被鉴定为含有KOR B ORF5基因的重组KOR C和MLV株，可能是目前流行的KOR B株的祖先。此外，还检测到nadc30样病毒和nadc34样病毒的两种新的谱系1重组。

结论

通过SISPA-NGS方法和从头组装对韩国PRRSV分离株进行全基因组分析，发现该领域存在复杂的进化和重组。因此，应在全基因组水平上对PRRSV进行持续监测，并需要新的疫苗策略来更有效地控制病毒。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是影响全球养猪业的最重要的流行病之一，于1987年在美国首次被发现[1］．美国的养猪业约占全球生猪产量的60%，这种疾病对美国的经济影响估计为每年6.64亿美元[2，3.］．病原体是猪繁殖和呼吸道病毒(PRRSV)，是一种包膜单链阳性RNA病毒，其基因组长约15 kb，编码一个5 '非翻译区(UTR)，至少11个开放阅读框(orf)，一个3 ' UTR和一个3 ' -poly(a)尾巴[4，5］．PRRSV分为两种基因型，即PRRSV1 (eu型，原型株莱利斯塔病毒)和PRRSV2 (na型，原型株VR-2332病毒)，它们在核苷酸水平上只有大约60%的相似性[6，7］．

由于RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)缺乏3 ' -5 '外切酶校对能力，RNA病毒的突变率很高，而PRRSV中计算出的核苷酸取代率是报道的RNA病毒中最高的[8，9］．在PRRSV的结构基因中，ORF5基因编码主要的病毒包膜蛋白GP5，在病毒组装、感染性和中和抗体诱导中发挥重要作用[10，11，12］．由于ORF5具有较高的遗传多样性，被广泛用于系统发育分析[13］．根据ORF5序列之间的遗传关系，PRRSV2分为9个谱系，谱系1至谱系9 (L1至L9)， PRRSV1分为亚型1至亚型4 (sub1至sub4) [14，15，16］．

在韩国，PRRSV2首次在20世纪80年代中期被发现[17]，而PRRSV1在2005年首次被发现，此后迅速传播[18，19］．PRRSV1被认为在韩国非常流行，并被分为亚型1(泛欧洲PRRSV1)的A (sub1A)、B (sub1B)和C (sub1C)亚组，大多数分离株属于sub1A [14，20.］．PRRSV2已在全国范围内传播数十年，其遗传多样性通过独立进化不断增加，形成了独特的国家特异性支系K和A (LKA)、B (LKB)或C (LKC)，与全球流行的PRRSV毒株和商业改良活疫苗(MLV)毒株不同[14，21］．

尽管PRRSV ORF5一直是一个非常有用的工具，为PRRSV的流行病学提供了深刻的见解，但它只占整个基因组的5%。因此，迫切需要全基因组测序(WGS)研究，以提供更完整的病毒图像，并获得鉴定剩余95%的基因组信息，以预测遗传变异[22，23］．事实上，基于PRRSV株的全基因组信息，研究已经确定了两株野生型PRRSV株之间的重组[21，24，25]，在野生型PRRSV和MLV株之间[26，27，28]和MLV毒株之间[29］．实验表明，在体外和体内两种不同的PRRSV毒株中都发生了RNA重组[30.，31］．它不仅导致新的PRRSV基因型的产生，而且还与毒力的增加有关[32］．此外，PRRSV的WGS能够分析基因组内的插入和删除(INDEL)模式。在prrsv中经常观察到缺失。例如，最大的PRRSV蛋白非结构蛋白2 (NSP2)可以耐受氨基酸(aa)缺失和外源基因插入[33]，据报道，它与某些模式有关，例如MN184-或nadc30样PRRSV的NSP2中131-aa不连续缺失[34]， nadc34样PRRSV NSP2连续缺失100-aa [35]，以及中国高致病性PRRSV株NSP2 30 aa的不连续缺失[36］．

自2005年高通量下一代测序(NGS)问世以来(Roche 454 FLX平台)，NGS技术已成为几乎所有生物研究领域的基本工具[37］．然而，NGS尚未被常规用于兽医检测，最近的研究试图基于几种不同的方法和测序平台将NGS技术用于PRRSV WGS [23，38，39］．序列无关，单引物扩增(SISPA)是一种随机引物方法，允许病毒基因组富集仅在几个步骤[40，41］．NGS结合靶标非依赖性基因组扩增的高敏感性价值已在以往的研究中通过对不同样本的新型病毒的鉴定得到证实[42，43，44，45］．然而，据作者所知，使用SISPA方法的NGS (SISPA-NGS)尚未在PRRSV中进行测试或应用。

由于提交给GenBank的PRRSV基因组序列大部分是由美国和中国贡献的[46]，由于韩国是两个主要养猪国家，因此在全基因组水平上鉴定独特韩国猪株的流行特征和遗传变异的需求增加了[47］．因此，本研究的目的是在Illumina iSeq 100平台上建立和评估用于PRRSV WGS的SISPA-NGS方法，并通过对存档的韩国PRRSV株进行测序，在全基因组水平上表征基因组特征。

细胞培养和病毒繁殖

共有19种代表性的韩国PRRSV分离株，它们在过去二十年中最为流行[48]和两个参比菌株vr2332 (GenBank: AY150164)和JA142 (GenBank: AY424271)分别在含10%胎牛血清和1%抗抗生素-抗真菌剂的rmii -1640培养基中，37℃，5% CO湿润环境中培养MARC-145细胞或原代猪肺泡巨噬细胞(PAMs)₂的气氛。当大约90%的感染细胞表现出细胞病变效应(CPE)时，通过对感染细胞进行连续三个冷冻/解冻循环制备病毒原液。含病毒的细胞裂解液在4°C下以4000 rpm离心30分钟澄清。澄清的样品通过0.22微米孔径过滤器过滤，并收集在无菌容器中。收集的病毒保存在−80°C直到使用。

病毒浓度和RNA制备

在将NGS应用于韩国PRRSV株之前，我们使用细胞培养的参考株(VR-2332)比较了PRRSV cDNA制备过程[见附加文件]1］．共试验了8种cDNA制备方法(指定方法1 -方法8)，用病毒培养细胞上清液(方法1 ~方法4)和浓缩上清液(方法5 -方法8)测定PRRSV浓缩法的效果。病毒浓度/超滤用15 ml澄清样品进行，离心4000rpm和4°C，直到所有样品过滤使用VivaSpin®20单元与30万Da分子量截止(MWCO) (Vivascience)如上所述[49］．根据制造商的说明，使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen)提取病毒RNA。提取的RNA用DNase Max Kit (Qiagen)处理，并按照制造商的说明用agcourt RNA Clean XP珠(Beckman Coulter)纯化。使用NanoDrop分光光度计和Qubit 2.0荧光计检测纯化的RNA，使用Qubit RNA BR检测试剂盒。采用Prime-Q PCV2 PRRSV检测试剂盒(Genet Bio, Daejeon, South Korea)进行实时逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)，定量病毒RNA。将制备好的rna保存在−80°C下直到使用。

cDNA制备和下一代测序

测试了简单随机六聚体cDNA合成(RH)、RNA片段(RF)和SISPA技术用于生成双链(ds) cDNA的不同组合:方法1和5,RH;方法2和6,RF + RH;方法3和方法7,SISPA;方法4和方法8;RF + SISPA[参见附加文件1] [38，40，43，50］．对于RF，使用NEBNext镁RNA碎片模块(NEB)进行100ng制备的RNA碎片化，孵卵时间为2分钟，并按照制造商的说明使用GeneJet RNA清理和浓缩微试剂盒纯化RNA碎片。使用试剂盒中提供的随机六聚体(方法1、2、5和6)或SISPA引物(K-6 N)(方法3、4、7和8)，使用100 ng碎片化或非碎片化RNA样本进行反转录(SuperScript IV First-Stand Synthesis System, Invitrogen)。随后用1µl RNase H在37℃下处理合成的第一链cDNA 30分钟。对于RH和RF + RH方法，21 μ l的第一链cDNA在室温(RT)下孵育30分钟，1µl的10 mM dNTPs, 1µl的Klenow片段，1µl的大肠杆菌DNA连接酶(NEB)， 5µl 10 ×大肠杆菌连接缓冲液(NEB)和21µl depc处理过的水(最终体积50µl)。SISPA和射频+ SISPA方法,21µl第一链cDNA、1µl 100 pmol SISPA底漆(K-6N), 1µl 10毫米的核苷酸,1µl大片段,5 10µl×克莱诺反应缓冲区(内)和21µl DEPC-treated水(最后一卷50µl)涨跌互现,孵化后30分钟。在RT转换到ds cDNA克莱诺反应,产品纯化使用Agencourt AMPure XP珠子(贝克曼库尔特)。方法包括SISPA 5µl ds cDNA作为模板的PCR扩增反应在最后一卷50µl,含有1×铂SuperFi II绿色PCR反应混合液(热费希尔)和10µM SISPA底漆(K)。PCR循环执行如下:98°C 30年代,紧随其后的是35周期98°C的10年代,60°C 10年代,30年代和72°C,最终在72°C扩展5分钟。PCR产物纯化了Agencourt AMPure XP珠子(贝克曼库尔特)。最终的ds cDNA产物使用Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen)进行定量。

使用100纳克制备的ds-cDNA和Nextera DNA Flex Library Prep Kit，根据制造商的说明生成多路复用配对端测序文库。用生物分析仪(Agilent Technologies)上的高灵敏度DNA芯片分析所制备的测序文库。在Illumina iSeq 100平台(2 × 150 bp)上对含有3% PhiX(阳性对照)的条形码多路复用文库进行测序。

生物信息学

对读取的适配器和索引序列进行修剪，使用AfterQC版本0.9.6过滤低质量序列[51］．利用Minimap2将过滤后的reads定位到VR-2332参考基因组(AY150564)和宿主基因组(AQIB01) [52-k 7表示病毒，-k 14表示主机。读取覆盖率使用QualiMap 2.2.1版本计算[53］．使用SAMtools提取主机未映射的读[54然后在SPAdes 3.14.1版本中使用-meta命令[55］．对生成的contig进行BLAST分析，以确定最长的prrsv匹配contig。使用Quast version 5.0.2对接近VR-2332基因组大小的最长contigs (15451 bp)进行基因组组装质量评估[56］．使用Lasergene软件(DNASTAR Inc.)对参考序列和组装的contigs进行比对，以评估5 '和3 ' utr的测序能力。

韩国PRRSV分离株WGS

随后，通过建立的SISPA-NGS程序(method_7)对我们实验室分离并存档的20株PRRSV进行测序，每批测序最多6个样品。其中，对JA142 (AY424271)、CBNU0495 (KY434183)和D40 (KY434184)的WGS进行了已知基因组的重测序分析，验证了所建立程序的准确性，对其他韩国PRRSV株进行了新的基因组组装测序。在数据分析中，对原始数据和de novo assembly进行了如上所述的过滤。新获得的韩国PRRSV全基因组序列提交到GenBank，登录号为MW847781和MZ287313-MZ287330。为了确定成功WGS的cutoff Cq值，使用Prime-Q PCV2 PRRSV检测试剂盒(GeNet Bio Inc.， Daejun, Korea)根据制造商的说明提取rna。

系统发育分析

从GenBank数据库中共获得69株具有代表性的PRRSV毒株，包括截至2020年11月数据库中可用的所有韩国毒株[见补充文件]2］．所有序列均使用Clustal Omega进行比对，包括本研究新获得的19条全基因组序列[57］．采用RAxML-NG构建全基因组和ORF5的系统发育树[58]使用1000个自举重复和GTRGAMMA核苷酸替代模型。使用FigTree软件对构建的树进行可视化和编辑[59］．

NSP2多态模式分析

为了识别NSP2的各种INDEL模式，使用Clustal Omega将上面描述的所有完整序列拆分并与Lelystad病毒(PRRSV1)或VR-2332 (PRRSV2)作为参考进行比对。根据参考注释拆分比对得到NSP2序列，使用Clustal Omega对aa序列进行比对。然后用PAL2NAL软件将对齐的aa序列转换为核苷酸比对，以获得前面所述的精确比对[46，60］．NSP2在aa水平的INDEL模式使用NCBI多序列比对(MSA)工具进行可视化。

SimPlot和重组分析

为检测韩国株之间的重组事件，根据时间推断和韩国既往PRRSV流行病学状况报道，筛选出9株具有代表性的株(Amervac、KNU07、CBNU0495、RespPRRS_MLV、NADC30、NADC34、K07-2273、JB15-N-PJ10-GN和KU-N1606) [14，18，19，20.，21，47，61，62］．全基因组序列比对后，将上述代表菌株查询为重组亲本菌株，采用SimPlot 3.5.1版本分析[63]，窗口大小为500 bp，步长为20 bp，以识别潜在的重组事件和断点。随后，使用RDP v4.9.6对序列进行分析[64]，当7种方法(RDP、GENECONV、BootScan、Maxchi、Chimaera、SiScan和3Seq)均报告阳性重组信号时，提示重组事件。在综合考虑SimPlot和RDP结果后，确定最终的重组事件。

cDNA制备方法的比较

所有的方法都导致接近100%的映射到参考文献，但包括SISPA协议的方法显示了100%的覆盖，比其他方法有更大的深度，并且比使用随机六聚体构建ds cDNA的方法产生更少的低质量读取[见附加文件]3.］．虽然所有方法都可以通过从头组装获得完整或接近完整的病毒基因组序列[见附加文件]4]，只有通过method_7(病毒浓度+ SISPA)组装才允许检索病毒的5 '和3 ' utr的完整序列[参见附加文件5］．

用SISPA-NGS法测定PRRSV WGS

为获得所有韩国PRRSV毒株和参考毒株的全基因组序列，采用SISPA-NGS方法(method_7)构建所有病毒株的ds- cdna，并在isisq100平台上进行测序(表7)1)．JA142、D40和CBNU0495菌株的组装序列作为重测序对照，显示出与相应参考序列高度一致的核苷酸同源性(99.87%至99.97%)[见附加文件]6(表S4)。所有病毒株的全基因组序列都成功组装，没有任何缺口，可以恢复完整或接近完整的基因组序列，而平均contig读取深度因株的Cq值不同而不同(表1)．随着Cq值的降低，PRRSV基因组序列的读取深度降低，全基因组组装的近似截断Cq值为18.96。1)．

韩国PRRSV1的系统发育和NSP2 INDEL模式

根据韩国PRRSV株的ORF5、全基因组和NSP2核苷酸序列构建系统进化树，在每个基因或基因组水平上识别遗传特征(图2)。2)．在韩国的7株PRRSV1分离株中，有6株被分为PRRSV1 sub1A，在ORF5和全基因组水平上形成了一个独特的分支，与其他国家的PRRSV1菌株不同。一株韩国PRRSV1分离株在ORF5和全基因组水平上与SHE株和Amervac疫苗株接近，并被纳入PRRSV1亚1c组(图2)。2)．在NSP2水平上，韩国PRRSV1表现出与ORF5和全基因组水平相同的系统发育模式。然而，NSP2 INDEL模式分析显示，所有韩国PRRSV1 sub1A分离株均显示独特的19-aa缺失(在Lelystad病毒中aa位置为361-379)，其中一株CBNU0495显示额外的11-aa缺失(aa位置为280-290)(图2)。3.a和附加文件7)．

韩国PRRSV2的系统发育分析及NSP2 INDEL模式

在PRRSV2方面，所有韩国PRRSV2分离株按ORF5谱系分类可分为谱系5、谱系1和韩国特异性聚类(LKA、LKB和LKC)(图。2a).谱系5的韩国株在ORF5和NSP2水平以及全基因组水平上与RespPRRS_MLV株有亲缘关系，表明它们是mlv样病毒。来自谱系5的两株与其他mlv样株表现出不同的模式。菌株JB15-N-M8出现独特的150-aa缺失(aa位置;615-764 in VR-2332)在NSP2的高变区(HV)。菌株KU-N1202，先前报道为重组菌株[21]，表现出与MLV菌株相似的ORF5系统发育。然而，在全基因组和NSP2水平上，该菌株聚集在韩国血统组(图2)。2，3.b和附加文件8)．

系统发育分析表明，谱系1中的韩国株在ORF5和全基因组水平上可分为两类;一组(JB15-NP31-GB、JB15-N-PJ73-GN和KU-N1702株)与高致病性NADC30株比较接近，另一组(JBNU-19-N01和JBNU-20-N01株)与NADC31或NADC34株比较接近(图2)。2)．NSP2系统发育分析显示，两组韩国1系株均接近NADC30。两组NSP2 aa结构在NSP2 HV区均出现111-aa (VR-2332中aa位置323-433)、1-aa (aa位置485)和19-aa (aa位置501-519)缺失(“111 + 1 + 19”)的缺失模式，这与NADC30菌株的发现一致(图3)。3.b和附加文件8)．

ORF5系统发育分析可以明确划分为3个不同的韩国特异性聚类(LKA、B和C)的韩国株，经全基因组和NSP2系统发育分析合并为一个大分支，两个分支，表明它们具有潜在的共同祖先或出现重组(图2)。2，3.b).有趣的是，全基因组系统发育分析表明，2015年之前分离的菌株形成了一个亚分支，2015年之后分离的菌株形成了另一个亚分支(图。2b).所有韩国系菌株在HV区域均具有共同的“111 + 1 + 19”缺失模式，这与NADC30菌株或K07-2273菌株所观察到的模式完全相同(图7)。3.b和附加文件8)．

韩国PRRSV2基因重组分析

由于一些韩国PRRSV2分离株在ORF5、全基因组和NSP2系统发育分析中显示出重组的可能性，我们利用SimPlot软件根据相应的时间推断和影响，通过查询潜在的亲本菌株来确定潜在的重组事件和断点[见附加文件]9］．选择菌株RespPRRS_MLV (L5)、NADC30 (L1)、NADC34 (L1)、KU-N1606 (LKA)、2015-N-PJ10-GN (LKB)和K07-2273 (LKC)作为其他韩国菌株的潜在亲本。随后在RDP4软件中采用7种方法进行的基因重组分析显示，8株韩国PRRSV菌株中出现了重组信号(表2)2,无花果。4，和附加文件10)．

K07-2273株(LKC, 2007年分离)是2016年以前分离到的所有重组菌株的主要亲本。所有重组均显示疫苗株RespPRRS_MLV为小亲本，重组热点范围为NSP8和NSP12。此外，这些重组菌株具有不同的ORF5谱系系统发育(GGYC45;LKB GBGJ22;LKA、KU-N1202、JB15-N-PJ4-GN;L5)来自其主要亲本菌株K07-2273 (LKC)。2)，表明KLC谱系可能是2010年代初韩国引入疫苗后，通过与MLV毒株的重组，导致韩国出现民族特异性谱系的原因。

2016年以后，自LKB和LKC菌株出现以来，KNU-1901和KNU-1902菌株出现以KU-N1606 (LKA)为主，K07-2273 (LKC)为辅的重组信号，重组区域为ORF3 ~ ORF7。在1系菌株中，JBNU-19-N01和JBNU-20-N01出现了以NADC30为主、以NADC34为辅的重组信号，重组区域为NSP2和NSP10(表1)2)．在PRRSV1分离株中未检测到潜在的重组事件或断点。

自ORF5谱系分类系统建立以来，PRRSV的流行病学研究主要是通过ORF5基因测序和基于ORF5系统发育分析的病毒谱系分类来进行的[15，16］．然而，由于PRRSV RdRp具有易出错的特性，且在田间株或疫苗株之间频繁重组，近年来迫切需要进行WGS和基于基因组的分析。在韩国，ORF5测序已用于大多数诊断实验室，并已确定PRRSV暴发和韩国特定民族谱系的出现[14，18，19，20.，62，65］．然而，由于现有的全基因组信息有限，这些新世系的起源和遗传特征仍然不清楚，因为GenBank数据库中只有12个PRRSV全基因组序列。此外，韩国最近关于重组菌株的报道表明，ORF5测序不再足以完全鉴定或分类PRRSV分离株[21，47，61，66］．因此，本研究旨在建立一种提取PRRSV全基因组序列的WGS方法，并在全基因组水平上分析韩国PRRSV的遗传多样性。

WGS提供了无与伦比的遗传信息水平。在这项研究中，我们比较了使用随机六聚体和使用或不使用RNA片段的cDNA制备方法，以及使用或不使用RNA片段的SISPA[参见附加文件]1］．SISPA是一种随机引物方法，可以在短短几步内富集病毒基因组，这对于从RNA病毒或复杂的临床样本中获得基因组序列非常有用，因为不需要事先的序列信息[43］．正如预期的那样，使用SISPA方法可以从样本中生成比使用非SISPA方法更多的病毒读取[参见附加文件]3.]，从而获得覆盖深度更高的全基因组序列[见附加文件4和5]。此外，如前所述，我们应用300,000 Da MWCO膜从细胞培养的上清液中浓缩PRRSV颗粒[49]，导致较高的初始病毒滴度，显示为较低的Cq值[见附加文件3.］．这种病毒过滤或浓缩方案是从大量样本(如海水样本)中捕获和测序未知病毒池的常用方法[67，68］．基于上述优势，本研究建立的SISPA-NGS方法结合病毒浓度，在没有预先序列信息的情况下，成功实现了细胞培养PRRSV分离株的WGS(表2)1和附加文件6)．但基于Cq值的检出限(18.96)低于之前使用MiSeq平台的报道(20.6 ~ 23.6)[38(图。1)．这可能是由于iSeq100平台的数据输出减少，该平台允许比高通量测序器(如MiSeq系统)更小的批大小[69]，导致对从头组装的覆盖深度不够。将来有必要用临床样品和其他测序仪对所建立的NGS方法进行测试。

本研究新测序的韩国PRRSV毒株按照韩国先前报道的ORF5谱系分类系统被划分为不同的谱系[14，48]:亚型1A，亚型1C，谱系1，谱系5，谱系KOR A (LKA)， KOR B (LKB)， KOR C (LKC)(图。2a).关于PRRSV1 (EU型)，全基因组系统发育分析显示，韩国PRRSV亚型1A病毒与其他国家发现的病毒差异很大，彼此的同一性较低(图。2B)，这与之前的研究是一致的[18，19］．随着PRRSV1继续流行，并在韩国造成巨大的经济负担，两种PRRSV1 mlv [Unistrain PRRS (Amervac)和Porcilis PRRS]于2014年在韩国引进[66］．在本研究中分离到的疫苗样株(亚型1C)(株JB15-E-M17-JB)在全基因组水平上与单株PRRS或SHE株具有> 99%的核苷酸同源性(图2)。2b). 2015年以后韩国分离的PRRSV1亚型1A株(JB15-E-P47-GB、CBNU0495、JBNU-19-E01株)与2015年以前分离的PRRSV1亚型1A株(KNU-07、E38、D40株)在全基因组水平上存在高度差异(图4)。2b). NSP2 INDEL模式分析表明，PRRSV1亚型1A株中19-aa的缺失是一致的。3.a和附加文件7)，且在PRRSV1菌株中未检测到重组信号，怀疑韩国PRRSV1亚型1A的独立进化正在进行中。事实上，韩国最近的一项研究揭示，在实地采用疫苗前后进行比较时，PRRSV1 MLV疫苗接种增加了病毒遗传异质性，并在韩国亚型1A病毒中出现了新的糖基化位点[66］．韩国PRRSV1进化动态的持续监测应进一步在全基因组水平上进行。

关于PRRSV2, Ingelvac MLV (RespPRRS_MLV)的疫苗变体具有高核苷酸同源性(> 95%)和一致的NSP2 INDEL模式，除了JB15-N-M8株在HV区域有一个独特的150-aa缺失(图2)。2b,3.b和附加文件8)．在谱系1中，自2015年以来在韩国出现的nadc30样菌株(亚谱系1.8)[14基于全基因组系统发育分析，在全基因组水平上检测到与ISU30菌株密切相关的非nadc30样菌株(图。2b).这些非nadc30样病毒(JBNU-19-N01毒株和JBNU-20-N01毒株)于2017年在韩国首次分离[48根据ORF5将其划分为1.6亚系(接近菌株NADC31)(图5)。2a).然而，通过RDP和SimPlot分析，这些病毒被确认为NADC30和NADC34的重组体(表2)2和附加文件9)．nadc34样(或RFLP 1 - 7-4)谱系于2014年在美国出现，是一种高致病性的谱系1群集，可导致母猪群中的戏剧性流产“风暴”和仔猪的高死亡率[35］．随后于2017年开始在中国发现[70]，部分中国NADC34样菌株被证实为以NADC34为主要亲本，以NADC30或ISU30为次要亲本的重组体，在NSP2或ORF4-5区域进行重组[71］．同样，本研究中鉴定的1系重组子显示了以NADC34为主要亲本、以NADC30为次要亲本的重组，重组信号出现在NSP2和NSP10区域(表2)2和附加文件9)．虽然尚不清楚观察到的重组是否发生在韩国现场分离株中，或者重组株最初是从国外输入的，但自2017年以来，谱系1病毒已被证实在韩国广泛传播[48］．因此，应进一步评估和监测这些谱系1重组的临床表现和持续监测。

重组是PRRSV分离株中普遍存在的现象，是产生病毒遗传多样性的重要策略，因为其毒性增加和/或产生新的基因型[30.，32，72，73，74］．作为PRRSV2的变体，韩国血统(LKA, B和C)已被发现在韩国猪群中普遍存在，但这些国家特有的血统的起源目前尚不清楚[14，48］．考虑到PRRSV2在韩国的流行病学，我们怀疑LKC和Ingelvac MLV (RespPRRS_MLV)株之间的基因组重组可能参与了LKB的生成(图。5)．继1980年代在韩国首次发现PRRSV2后[17]， 1996年，英格尔瓦茨MLV在韩国上市[75］．LKA和LKC分别于2003年和2005年从韩国猪群中分离出来[62，75］．一项调查了2003年至2016年收集的ORF5序列的研究表明，自2014年以来收集的样本中首次检测到LKB [14］．在本研究中，韩国系中检测到多个重组信号，其中K07-2273 (LKC)为主要亲本，Ingelvac MLV为次要亲本2和无花果。4)．NSP2 INDEL模式的分析表明，朝鲜族谱系起源于同一亲本，因为在NSP2的HV区域发现了相同的不连续131-aa缺失模式(图2)。3.b和附加文件8)，这在nadc30样病毒或mn184样病毒中是一个公认的模式[34，76］．在2010年代初鉴定的重组株中，GGYC45株(2010年分离)被怀疑是当前LKB株的祖先，因为它是LKB株在2014年出现以来最早拥有LKB ORF5基因的菌株。鉴于韩国PRRSV2独立进化，结构蛋白抗原区存在遗传异质性[61]，韩国特异性谱系(LKC)与NSP地区MLV株之间的重组，以及结构蛋白区域的进化导致lkb样ORF5基因的出现，可能诱导了一个新的亚系的出现。尽管应该收集和分析更多的证据，但众所周知，广泛使用减毒活疫苗有助于增加PRRSV在实地的遗传多样性[77，78]，一些研究报道了涉及mlv的PRRSV2重组[79，80］．由于PRRSV2的多种谱系，包括MLV变种，韩国谱系病毒和进口谱系1病毒在韩国流行[48]，不同血统之间存在潜在的重组风险。需要进一步研究PRRSV的进化，然后在韩国进行全基因组水平的持续监测。

总之，我们使用SISPA协议建立了NGS，成功地对PRRSV分离株进行了WGS。基因组序列分析揭示了PRRSV1的持续独立进化，以及PRRSV2 MLV变体与韩国血统之间的多次重组事件的证据，这些事件在韩国流行。此外，本研究还检测到潜在的重组nadc30样和nadc34样菌株。由于韩国是一个边界非常紧密的孤立国家，在韩国观察到的独立进化动态可能有助于对PRRSV进化的一般认识。我们的研究强调了继续监测PRRSV和新的疫苗战略对更有效地控制该病毒的重要性。

在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在本文中(及其补充信息文件)。

PRRSV:

猪繁殖与呼吸综合征病毒

SISPA:

序列无关，单引物扩增

门店:

新一代测序

UTR:

翻译区

RdRp:

依赖RNA的RNA聚合酶

子:

开式阅读架

规划:

非结构蛋白

INDEL:

插入和删除

MLV:

改良活疫苗

WGS:

全基因组测序

帕姆:

猪肺泡巨噬细胞

CPE:

细胞病理效应

RH:

随机的六聚体

射频:

RNA片段

RT:

室温

不适用。

本研究得到了韩国动植物检疫局(QIA)的拨款(Z-1543069-2017-20-1)和韩国国家研究财团生物与医疗技术发展计划(2021M3E5E6019133)的支持。

作者及隶属关系

1. 全北国立大学兽医学院，全北益山五峰路79号，大韩民国，54596

   金承宰，文成贤，郑昌基，朴景徐，赵浩成，金元日

2. 39660金泉市赫新8路177号动植物检疫局

   郑昌基，朴智英，郑慧英，Shin Go-Eun, Ko Mi-Kyeong, Kim Seoung-Hee & Kyoung-Ki Lee

贡献

SCK和WIK构思了这项研究。HYG、GES、MKK、SHK、KKL进行样本采集。SCK、CGJ和GSP进行了实验。SCK、SHM和HSC对数据进行分析。SCK起草了手稿。所有作者都已阅读并批准了最终版本的手稿。

相应的作者

对应到Won-Il金．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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