病毒学杂志gydF4y2Ba体积gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，文章号:gydF4y2Ba55gydF4y2Ba（gydF4y2Ba2022gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
环GMP-AMP合成酶(cGAS)是一种重要的DNA传感器，在宿主抗病毒先天免疫应答中起着重要作用。在乙型肝炎病毒(HBV)感染过程中，cGAS信号通路可抑制HBV复制。乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)是HBV的重要调控蛋白，可能对cGAS/STING信号通路起拮抗作用。本研究旨在探讨HBx在cGAS/STING信号通路中的功能作用。gydF4y2Ba
HBx对IFN-β启动子活性的影响采用双荧光素酶报告法测定。用Western-blot和免疫共沉淀法分析泛素化和自噬。gydF4y2Ba
我们的研究结果表明，HBx通过直接促进cGAS的泛素化和自噬降解来下调IFN-I的产生。gydF4y2Ba
HBV可以拮抗宿主cGAS DNA传感，促进HBV复制，为开发对抗HBV感染的新方法提供了新的见解。gydF4y2Ba
先天免疫系统是宿主抵御病原体入侵的第一道防线，通过与各种病原体识别受体(PRRs)相互作用，识别病原体相关分子模式，进而触发I型干扰素(IFN-I)、肿瘤坏死因子等抗病毒因子的产生[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．cGAS是属于PRR的细胞质DNA传感器，催化cGAMP的合成，诱导转录因子干扰素调节因子-3 (IRF-3)的激活，进而促进IFN- i的释放和IFN刺激基因(ISGs)的表达，如ISG15, ISG56 [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．此外，cGAS对一系列DNA和RNA病毒，如单纯疱疹病毒1 (HSV-1)、登革病毒(DENV)和艾滋病毒(HIV)均有抗病毒活性[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．因此，cGAS参与HBV的识别被广泛接受。重要的是，越来越多的证据表明cgas介导的信号通路促进了针对HBV的先天免疫应答。gydF4y2Ba
此外，一些研究小组报告说，cGAS可以抑制HBV的复制。简而言之，cGAS被证明可以识别HBV DNA，并且是启动抗病毒先天免疫以抑制HBV复制所必需的[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．由于cGAS的激活引发了强有力的抗病毒反应，HBV可能通过采取策略削弱cGAS- sting信号级联来维持其在受感染的肝细胞中的维持。gydF4y2Ba
研究表明，HSV-1被膜蛋白VP24、UL41、UL24、UL46、UL36、US3和VP22可逃避cGAS/ sting介导的信号通路[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．另一方面，卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV) ORF52通过cGAS结合和DNA结合直接抑制cGAS酶活性，从而抑制细胞质DNA感测[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．KSHV的延迟相关核抗原(LANA) n端结构域直接与cGAS相互作用，从而拮抗cGAS并抑制随后的2 ' 3' cGAMP和IFN-I的产生[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．然而，HBV逃避先天免疫反应的潜在机制仍然知之甚少。cGAS在HBV感染过程中可以检测到裸露的放松环状HBV DNA，但不能检测到核酸，因为基因组很可能被包装在病毒衣壳中。然而，据报道HBV感染抑制cGAS的表达和功能[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．然而，还需要研究来阐明HBV抑制cGAS的潜在机制。gydF4y2Ba
HBV是一种嗜肝、非细胞病变、包膜和部分双链DNA (dsDNA) (3.2 kb)病毒，属于肝病毒科[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]，可被cGAS/STING信号通路感知并激活宿主抗病毒反应。HBx是HBV特有的非结构蛋白，由HBV的四个开放阅读框之一编码。众所周知，它是HBV复制和HBV相关肝细胞癌发生的重要辅激活剂[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．HBV也被认为是一种隐形病毒，因为它可以通过逃离宿主的固有抗病毒免疫而有效地入侵和复制人类肝脏。最近，一种新的病毒策略被报道，HBV通过抑制cGAS的表达和功能来逃避由cGAS/STING信号通路激活的先天免疫反应[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．然而，HBV抑制cGAS表达和功能的具体机制尚未完全阐明。我们在此报道，HBx作为hbv特异性成分蛋白，通过促进cGAS的泛素化和自噬，下调cGAS表达的积累，从而逃避由cGAS/STING信号通路激活的先天免疫反应，建立有效的感染。gydF4y2Ba
人肝细胞癌细胞株SMMC-7721、LO2、HepG2、HepG2.2.15、HEK293T培养于Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM)中，加入10% FBS (Gibco, USA)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。细胞培养维持在37°C，在含有5% CO2的潮湿环境中。使用Lipofectamine 2000按照制造商的方案进行瞬时转染。gydF4y2Ba
本研究使用的一抗如下:小鼠抗hbx单克隆抗体(Santa Cruz，美国)、兔抗cgas单克隆抗体(CST，美国)、兔抗sting单克隆抗体(CST，美国)、兔抗irf3 (Phospho-Ser382)单克隆抗体(CST，美国)、小鼠抗irf3单克隆抗体(CST，美国)、小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体(Santa Cruz，美国)、小鼠抗gapdh单克隆抗体(Proteintech，美国)、兔抗flag单克隆抗体(Proteintech，美国)、兔抗ha单克隆抗体(Proteintech，美国)、按照制造商说明使用k48连接泛素抗体(Billerica, MA, USA)、DAPI (Santa Cruz, USA)和Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA)。gydF4y2Ba
用Lipofectamine 2000瞬时转染200 ng荧光素酶报告质粒和总共600 ng各种表达质粒和/或空载体对照，将HEK293T细胞播撒在24孔板上。作为内部对照，同时转染50 ng pRL-TK (Renilla luciferase)。根据Promega双荧光素酶报告试验方案，在转染后24小时进行荧光素酶测定。相对荧光素酶活性通过将萤火虫荧光素酶活性归一化以任意单位表示。gydF4y2Ba
细胞转染24小时，然后用Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)裂解。通过逆转录从总RNA合成互补单链DNA (TaKaRa，日本)。cDNA靶点的定量在CFX96TM Real-Time-PCR检测系统(Bio-Rad, USA)上进行。引物由Invitrogen公司合成，列于表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
western blotting检测细胞cGAS、STING、HBx、IRF3水平。简单地说，含有等量蛋白质的样品被SDS-PAGE分离，并被吸到PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白阻断膜，并与抗cgas、抗sting、抗hbx、抗irf3、抗flag、抗ha、抗k48 -linked泛素或抗-β-actin抗体孵育，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗体孵育。使用SuperSignal West Pico化学发光基质试剂盒(美国赛默飞世尔科学公司)检测感兴趣的蛋白质。Bio-Rad电泳文档(Gel Doc 1000, Bio-Rad, USA)和Quantity One Version 4.5.0记录了结果。gydF4y2Ba
天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)使用readyels (7.5%， Bio-Rad)进行。简而言之，用25 mM Tris和192 mM甘氨酸(pH 8.4)， 1%脱氧胆酸盐(DOC)，在阴极室中40 mA条件下浸泡30分钟。在天然样品缓冲液(10 g蛋白质，62.5 mM Tris-Cl, pH 6.8, 15%甘油，1% DOC)中样品在25 mA下进行电泳分级，并将凝胶转移到硝化纤维膜上进行WB分析。gydF4y2Ba
使用GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad software, CA, USA)进行所有统计分析均采用学生t检验。p值< 0.05为组间差异显著。统计差异显示在不同的水平gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05 (gydF4y2Ba∗gydF4y2Ba),gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001 (gydF4y2Ba∗gydF4y2Ba∗gydF4y2Ba∗gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
目前，大量证据表明cGAS识别细胞质DNA，导致IFN-I的产生。HBx是一种神秘的分子，因为它在调节IFN-I产生方面具有多效性[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．为了评估HBx在DNA病毒感染过程中对cGAS/STING信号通路的影响，我们进行了双荧光素酶报告(DLR)试验来检测干扰素β (IFN-β)启动子活性。在HEK293T细胞中，仅转染cGAS或少量STING不能激活IFN-β启动子，而共转染cGAS和STING质粒则显著激活IFN-β启动子(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).然后，在HBx存在或不存在的情况下，用cGAS、STING和IFN-β荧光素酶报告基因共转染HEK293T细胞。结果表明，HBx能以剂量依赖的方式显著抑制IFN-β启动子活性(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab, c)。我们进一步检测了IFN-β的mRNA表达水平，得到了相似的结果(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba
乙型肝炎病毒X蛋白是cgas诱导的IFN-I-β信号的负调控因子。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba) HEK293T细胞转染IFN-I-β荧光素酶报告基因和表达质粒，转染24 h后检测荧光素酶活性。通过将萤火虫荧光素酶活性归一化为Renilla荧光素酶活性，将相对荧光素酶活性表示为任意单位。（gydF4y2BadgydF4y2Ba) HEK293T细胞按指示转染表达质粒，转染24 h后采集细胞进行qRT-PCR分析。（gydF4y2BaegydF4y2BaWestern blot (WB)分析几种人肝细胞系cGAS、STING的表达。（gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba) HEK293T细胞共转染cGAS和STING，同时转染空载体或HBx-Flag质粒，Western blot检测IRF3二聚和磷酸化情况gydF4y2Ba
接下来，在HepG2、HepG2.2.15、L02和SMMC-7721等肝细胞系中检测cGAS和STING的表达水平。结果表明，STING在所有细胞系中均有高表达。然而，我们仅在L02和SMMC-7721细胞中检测到cGAS的表达(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba
据报道，cGAS感知细胞质DNA并催化cGAMP的合成，cGAMP随后与STING结合，导致IRF3二聚化和磷酸化，最终产生IFN-β [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．既往研究报道HBx可通过作用于MAVS抑制IFN-β的表达来抑制病毒触发的IRF3激活[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．二聚和磷酸化是IRF3的激活状态，我们验证了HBx可以抑制cgas触发的IRF3二聚和磷酸化抑制IFN-β(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf, g)。gydF4y2Ba
为了阐明什么水平的HBx作用于cGAS-STING途径以阻断IFN-β的产生，我们将HEK293T细胞与空载体或HBx质粒，以及IFN-β- luc报告基因和表达途径中的重要接头蛋白结合，包括STING的活性形式，罐结合激酶1 (TBK1)和IRF3 (IRF3/ 5d)。我们发现，HBx的异位表达并不影响STING、TBK1或IRF3/5D驱动的IFN-β启动子的激活(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这些结果表明HBx可抑制STING上游IFN-I-β的表达。gydF4y2Ba
HBx抑制STING上游水平的IFN-I-β信号通路。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2BaHEK293T细胞按指示共转染表达质粒，转染24 h后收获细胞，进行DLR实验。通过WB分析STING、IRF3/5D、TBK1、HBx的表达。这些数据代表了其中一个重复实验的结果。误差条表示三个独立实验的标准差gydF4y2Ba
上述数据使我们推测HBx可能主要直接作用于cGAS。KSHV病毒粒子蛋白ORF52抑制cGAS酶活性[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．HSV-1被膜蛋白UL41下调cGAS的表达，VP22与cGAS直接相互作用干扰其DNA传感[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．既往研究表明HBV感染可抑制cGAS及其相关基因的表达[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．以HEK293T细胞系为细胞模型，探讨HBx的作用是否与HBV一致，HBx是否是直接靶向cGAS的活性成分。在HEK293T中异位表达cGAS，以检测HBx是否能降低cGAS的表达水平。HEK293T细胞体外表达cGAS，收获，Western blot分析。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa, HBx以剂量依赖的方式下调cGAS的表达(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).先前的实验表明SMMC-7721细胞含有内源性cGAS。用HBx质粒转染SMMC-7721细胞，收获后进行Western blot (WB)分析。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab, HBx显著下调内源性cGAS的表达(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).有趣的是，当HBx表达增加时，cGAS蛋白水平明显下降。然而，cGAS mRNA的丰度并没有随着HBx表达的增加而改变(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).值得注意的是，我们观察到HBx不影响cGAS的转录水平。HBx作用于cGAS的调控机制有待进一步研究。gydF4y2Ba
HBx下调cGAS的表达和功能。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba) HEK293T细胞转染cGAS表达质粒，感染24 h后取细胞进行WB分析。（gydF4y2BabgydF4y2Ba) SMMC-7721细胞转染18 h后按指示转染表达质粒，收集细胞进行qRT-PCR分析。这些数据代表了其中一个重复实验的结果。误差条表示三个独立实验的SDsgydF4y2Ba
已知DNA与cGAS的N端结合促进cGAS的活化[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．在γ疱疹病毒中，ORF52部分通过它们的相互作用来阻断cGAS的活性。ORF52对cGAS的特异性抑制促使我们研究cGAS与HBx相互作用的可能性。先前的报道揭示HBx通过降低cGAS的表达和功能来抑制IFN-β信号通路。为进一步探讨HBx通过下调cGAS表达在IFN-β产生中的作用，用HBx质粒转染SMMC-7721和LO2细胞，转染24 h后裂解细胞，进行免疫共沉淀实验。用抗flag抗体和抗cgas抗体免疫印迹法分析转染蛋白的表达。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa, HBx结合并与cGAS相互作用，但不与STING相互作用。gydF4y2Ba
HBx与cGAS结合并相互作用。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba) SMMC-7721细胞转染空载体或HBx-Flag质粒。转染24小时后，收集细胞，获得总蛋白。我们用IgG和抗hbx或抗cgas抗体拉取蛋白，western blot检测相互作用。（gydF4y2BacgydF4y2Ba)用空载体或HBx-Flag质粒转染SMMC-7721和L02细胞。转染24 h后，按指示用荧光抗体染色，荧光显微镜观察gydF4y2Ba
同时，用HBx下拉cGAS，观察到相似的结果(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).然后荧光显微镜也显示HBx与cGAS在不同类型的细胞中共定位(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).这些结果表明HBx与cGAS结合，可能会阻碍cGAS的DNA识别。gydF4y2Ba
蛋白质的降解主要有两种途径:泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体。已知HBx已被证明在hbv介导的自噬中发挥关键作用。据报道，cGAS的赖氨酸48 (K48)连接的泛素链与微管相关蛋白-轻链3 (LC3)连接，介导cGAS的自噬降解[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．采用药理学方法研究哪些通路参与调控cGAS的表达。我们观察到自噬增强剂雷帕霉素和HBx下调了cGAS的蛋白水平。此外，自噬抑制剂3-甲基ladenine (3-MA)和蛋白酶体抑制剂MG132均能上调cGAS的蛋白水平(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa、b)。gydF4y2Ba
HBx促进cGAS的泛素化和自噬降解。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BabgydF4y2Ba) SMMC-7721细胞转染空载体或HBx-Flag质粒。转染后12小时，用雷帕霉素或3-MA或MG132 (10 mM)处理12小时，对照组使用二甲基亚砜(DMSO)。收集细胞并进行WB分析。（gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba) SMMC-7721细胞转染pGFP-LC3和空载体或HBx- Flag质粒。转染后12小时，用雷帕霉素或3MA或MG132 (10 mM)处理12小时，对照组使用二甲基亚砜(DMSO)。在荧光显微镜下观察自噬点。SMMC-7721中自噬细胞的定量。具有三个以上荧光颗粒的细胞被认为是自噬激活细胞。同时，采集细胞进行WB分析。（gydF4y2BaegydF4y2Ba) SMMC-7721细胞转染空载体或HBx- Flag质粒。转染后12小时，收集细胞并进行WB分析。（gydF4y2Baf-hgydF4y2Ba) L02转染ISD、空载体或HBV1.3质粒，转染后12 h qRT-PCR检测IFNβ、ISG54和isg56, WB检测HBV核心蛋白。（gydF4y2Ba我gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BakgydF4y2Ba)转染HepG2和HepG2.2.15细胞后12 h采用qRT-PCR法检测ISD、IFNβ、ISG54和ISG 56, WB法检测HBV核心蛋白gydF4y2Ba
LC3从弥漫性细胞质分布到点聚集已被用作自噬激活的标志[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．检测GFP-LC3荧光颗粒反映自噬水平。我们观察到HBx和雷帕霉素显著增加了GFP-LC3重分布到聚集点，而3-MA可以抑制这一现象。与对照组相比，HBx诱导的gfp - lc3阳性细胞的百分比增加了近3倍(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).此外，(LC3)在自噬过程中由游离形式(LC3- i)转变为磷脂酰乙醇胺共轭形式(LC3- ii)。LC3-II也可作为自噬的指标[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．我们的研究发现，与对照组相比，HBx和雷帕霉素显著上调了LC3-II的表达，并逆转了LC3-I/LC3-II的比例(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad).先前的研究表明cGAS主要泛素化与K48连锁。我们还检测了cGAS的K48-linked泛素化，发现HBx可以促进cGAS的K48-linked泛素化(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae).为进一步验证HBx是调节HBV感染cGAS/STING通路的主要成分蛋白，采用ISD对cGAS/STING信号通道进行增敏。将HBV1.3倍基因组质粒(pcDNA-HBV1.3)转染到L02细胞系，建立HBV感染细胞模型(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baf-h)， HepG2.2.15是一种稳定转染HBV的组成性产生HBV的细胞系。在HepG2和HepG2.2.15细胞系中检测IFN-β、ISG54和ISG56的mRNA水平(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bai (k)。我们发现HBV阳性细胞中IFN-β、ISG54和ISG56 mRNA水平均明显低于HBx，提示HBx与HBV抑制cGAS/STING信号通路有关。这些结果表明HBx作为HBV的主要成分蛋白可以通过促进自噬和泛素化下调cGAS的蛋白水平，进而抑制cGAS介导的通路，从而抑制IFN- i -β和IFN刺激的基因如ISG56、ISG54的表达。gydF4y2Ba
目前有两种主要的肝炎病毒引起慢性病毒性肝炎，包括HCV和HBV。HCV是一种单链RNA病毒，HCV感染的治疗已经被克服。然而，HBV如此狡猾，以至于HBV感染的治疗仍然有限[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．乙型肝炎病毒是一种嗜肝DNA病毒[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．近十年来，DNA传感器在宿主感知DNA病毒和诱导免疫防御中起桥梁作用已被广泛接受。cGAS的DNA传感器可感知HBV感染，激活cGAS/STING信号通路，诱导先天免疫应答[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．HBV非常狡猾，这促使我们推测HBV可能进化出某种机制来阻断这一信号通路。cGAS抑制HBV被广泛报道，但对HBV的免疫逃避知之甚少。gydF4y2Ba
调控cGAS主要有三种途径:(i)翻译后修饰，包括磷酸化、泛素化、素酰化和谷氨酰化;(ii)与自噬、炎性小体等其他途径的串扰;(iii)病毒蛋白对cGAS的调控[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．越来越多的证据表明，各种病毒通过这些途径调节cGAS，从而调节由cGAS信号轴诱导的先天免疫反应。据报道，卡波西肉瘤相关疱疹病毒ORF52、HSV-1表皮蛋白UL41、VP22和延迟相关核抗原n端结构域直接靶向cGAS。先前的研究表明cGAS通过多种策略抑制HBV。同时，HBV通过降低cGAS及其效应基因的表达来逃避cGAS的感知。然而，很少有人知道HBV是否逃避cGAS-STING信号通路。我们首次报道HBx是一种有效的靶向cGAS的HBV蛋白，因为HBx可以下调cGAS的表达，并进一步抑制cGAS诱导的IFN-β和ISG56的表达。而HBx并没有下调cGAS mRNA的表达，说明HBx并没有调节cGAS的转录水平。gydF4y2Ba
泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体是蛋白质降解的两种主要调控途径。在HSV-1感染中，TRIM14招募USP14在K414位点切割k48连接的cGAS泛素化[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．先前的研究报道HBx靶向SMC5/6通过CRL4 HBx E3连接酶进行泛素化，随后被蛋白酶体降解[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．此外，先前的研究表明HBx通过激活死亡相关蛋白激酶促进自噬，并使细胞对饥饿诱导的自噬敏感[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在此，我们推测HBx与宿主泛素-蛋白酶体系统(UPS)和自噬之间的复杂相互作用可能是cGAS降解的原因，但其潜在机制需要进一步探索。gydF4y2Ba
不同的研究小组已经证明cGAS在许多方面都是一种高效的DNA传感器。纯化后的cGAS蛋白可在生化测试中直接与DNA分子结合[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．蛋白质晶体结构分析表明，cGAS通过蛋白质表面的正键和氢键与带负电荷的DNA磷酸盐骨架结合，不依赖于DNA序列[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．荧光共定位发现cGAS和HBx在细胞内共定位，co-IP证实HBx与cGAS相互作用，而不与STING相互作用。HBx与cGAS结合，可能会干扰cGAS的DNA识别。这一方面证实了HBx是HBV在调节和逃避cgas诱导的先天免疫方面的功勋政治家。另一方面，我们有理由推测HBx可能阻断cGAS的DNA识别。gydF4y2Ba
综上所述，我们的研究表明HBx是HBV调控cGAS的有效分子。目前尚不清楚HBV调控cGAS是否有其他途径或其他蛋白成分参与。此外，我们没有研究GAS与HBx结合的具体位点及其结合所引起的直接效应，也没有阐明自噬与cGAS泛素化调控之间是否存在相关性。因此，还需要进一步的研究来阐明具体的机制。cGAS作为细胞质DNA传感器首次亮相。然而，最近的研究表明，cGAS主要定位于细胞核[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba
此外，cGAS与染色质结合可以作为DNA复制叉的减速器，控制复制动态并抑制复制相关的DNA损伤，这表明cGAS是一个有吸引力的靶点[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．cGAS与染色质结合用于开发癌细胞的基因组不稳定性。染色质结合cGAS是否会与有核HBV病毒相互作用仍有待观察。对这些问题的进一步研究必将为我们对cGAS功能的理解提供新的线索，这也将有助于我们开发对抗HBV感染的新治疗方法(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
综上所述，在本研究中，我们发现HBx是一种有效的HBV调节气体分子。它通过泛素化和自噬负向调控cgas介导的DNA信号。研究cGAS在HBV感染中的作用，为今后提高HBV的治疗水平提供了一些新的思路。gydF4y2Ba
本研究中产生或分析的数据和材料可根据合理要求提供，并可由陈伟贤(300801@cqmu.edu.cn)提供。gydF4y2Ba
Takeuchi O, Akira S.模式识别受体与炎症。细胞。2010;140(6):805 - 20。gydF4y2Ba
Schneider W, Chevillotte M, Rice C.干扰素刺激基因:宿主防御的复杂网络。中华免疫杂志2014;32:513-45。gydF4y2Ba
孙玲，吴娟，杜峰，陈鑫，陈哲。环状GMP-AMP合成酶是一种激活I型干扰素通路的细胞质DNA传感器。科学(纽约，纽约州)。2013, 339(6121): 786 - 91。gydF4y2Ba
加藤K，大村H，石谷R, Nureki O.环GMP-AMP在先天性免疫信号通路中的内源性第二信使。生物化学，2017;86:541-66。gydF4y2Ba
在疱疹病毒感染过程中，病毒DNA传感器IFI16和环GMP-AMP合酶在调节病毒基因表达、免疫防御和凋亡反应方面具有不同的功能。gydF4y2BamBiogydF4y2Ba2016年,7(6)。gydF4y2Ba
高勇，赖敏，于晨。登革热病毒如何绕过先天免疫系统。前沿免疫。2018;9:2860。gydF4y2Ba
高东，吴娟，吴勇，杜峰，阿罗春，闫楠，孙玲，陈铮。环GMP-AMP合成酶是HIV和其他逆转录病毒的先天性免疫传感器。科学(纽约，纽约州)。2013, 341(6148): 903 - 6。gydF4y2Ba
Dansako H, Ueda Y, Okumura N, Satoh S, Sugiyama M, Mizokami M, Ikeda M, Kato N.环GMP-AMP合成- sting信号通路在对抗HBV的先天免疫应答和抑制HBV组装中都是必需的。中华医学杂志，2016;29(1):344 - 344。gydF4y2Ba
何娟，郝瑞，刘东，刘霞，吴松，郭松，王勇，田萍，郭东。激活cGAS-STING途径抑制乙肝病毒复制。中国病毒学杂志，2016;44(12):3368-78。gydF4y2Ba
郭峰，唐磊，舒舒，Sehgal M, Sheraz M，刘波，赵强，程杰，赵霞，周涛等。肝细胞干扰素基因刺激因子的激活抑制乙肝病毒的复制。中国生物医学工程学报，2017,29(10)。gydF4y2Ba
张东，苏晨，郑晨。单纯疱疹病毒1丝氨酸蛋白酶VP24通过取消干扰素调节因子3的激活阻断dna传感信号通路。中国病毒学杂志，2016;90(12):5824-9。gydF4y2Ba
单纯性疱疹病毒1型通过病毒粒子宿主关闭蛋白UL41取消cGAS/ sting介导的胞质dna感应通路。中华病毒学杂志，2017,91(6)。gydF4y2Ba
徐红，苏晨，Pearson A, Mody C，郑晨。单纯疱疹病毒1ul24通过抑制NF-κB激活来消除DNA传感信号通路。中国病毒学杂志，2017,91(7)。gydF4y2Ba
尤红，郑松，黄志，林艳，沈强，郑晨。单纯疱疹病毒1被膜蛋白UL46抑制tank结合激酶1介导的信号通路。生物工程学报，2019,10(3)。gydF4y2Ba
叶瑞，苏晨，徐红，郑晨:单纯疱疹病毒1型泛素特异性蛋白酶UL36抑制NF-κB在DNA敏感信号通路中的激活。中国病毒学杂志，2017;91(5)。gydF4y2Ba
游红，林燕，林峰，杨敏，李娟，张锐，黄铮，沈强，唐锐，郑超:β-Catenin是cGAS/STING信号通路的必需蛋白，但被单纯疱疹病毒1us3蛋白拮抗。中华病毒学杂志，2020,94(5)。gydF4y2Ba
黄娟，尤红，苏超，李艳，陈松，郑晨。单纯疱疹病毒1型被膜蛋白VP22取消cGAS/ sting介导的抗病毒先天免疫。中国病毒学杂志，2018,92(15)。gydF4y2Ba
吴娟，李伟，邵毅，Avey D，付波，Gillen J, Hand T，马森，刘x, Miley W，等。疱疹病毒病毒粒蛋白对cGAS DNA感应的抑制作用细胞宿主微生物。2015;18(3):333-44。gydF4y2Ba
张光，陈B, Samarina N, Abere B, Weidner-Glunde M, Buch A, Pich A, Brinkmann M, Schulz T.卡波西肉瘤疱疹病毒LANA的细胞质异型招募并拮抗先天免疫DNA传感器cGAS。美国国家科学研究院。2016, 113 (8): e1034 - 1043。gydF4y2Ba
Verrier E, Yim S, Heydmann L, El Saghire H, Bach C, Turon-Lagot V, Mailly L, Durand S, Lucifora J, Durantel D，等。人肝细胞中环状单磷酸鸟苷-单磷酸腺苷合酶检测对乙型肝炎病毒的逃避作用肝病学(巴尔的摩，医学博士)。2018, 68(5): 1695 - 709。gydF4y2Ba
Lok A, McMahon B.慢性乙型肝炎。2007; 45(2): 507 - 39。gydF4y2Ba
李松，车娥，林俊，权山，金东，赵海华，韩凯。乙型肝炎病毒本质展开mini-HBX蛋白的结构特征。中国生物医学工程学报。2012;34(2):165-9。gydF4y2Ba
姜军，唐慧。乙型肝炎病毒X蛋白抑制I型干扰素诱导的机制。中国生物医学工程学报。2010;1(12):1106-17。gydF4y2Ba
陶娟，张鑫，金娟，杜霞，连涛，杨娟，周霞，蒋志，苏鑫:cGAS N端非特异性DNA结合促进cGAS活化。J Immunol。(巴尔的摩，马里兰州:1950)2017,198(9):3627-36。gydF4y2Ba
王霞，李艳，毛安，李艳，田平。乙型肝炎病毒X蛋白通过破坏签证相关复合物抑制病毒触发的IRF3激活和ifn - β诱导。细胞Mol免疫，2010;7(5):341-8。gydF4y2Ba
陈敏，孟强，秦勇，梁鹏，谭鹏，何玲，周勇，陈勇，黄娟，王锐，等。TRIM14抑制选择性自噬受体p62介导的cGAS降解，促进先天免疫应答。中国生物医学工程学报，2016;36(1):344 - 344。gydF4y2Ba
Park S, Rehermann B.对HCV和其他肝炎病毒的免疫应答。免疫力。2014;40(1):24里面。gydF4y2Ba
熊敏，王松，王勇，冉勇。cGAS的调控。中国病毒学杂志，2018;33(2):117-24。gydF4y2Ba
Murphy CM, Xu Y, Li F, Nio K, Reszka-Blanco N, Li X, Wu Y, Yu Y, Xiong Y, Su L.乙型肝炎病毒X蛋白促进SMC5/6的降解，增强HBV复制。Cell Rep. 2016;16(11): 2846-54。gydF4y2Ba
张海涛，陈广根，胡广朋，张志智，恽太平，何明明，赖保。乙型肝炎病毒x蛋白通过激活死亡相关蛋白激酶诱导自噬。病毒性肝炎杂志。2014;21(9):642-9。gydF4y2Ba
高鹏，Ascano M，吴Y, Barchet W, Gaffney B, Zillinger T, Serganov A，刘y, Jones R, Hartmann G，等。Cyclic [G(2 '，5 ')pA(3 '，5 ')p]是由dna激活的环状GMP-AMP合成酶产生的后生动物第二信使。细胞。2013;153(5):1094 - 107。gydF4y2Ba
赵波，徐鹏，罗莱特C，景涛，辛德O，雷Y, West A，刘伟，李鹏。cGAS紧密核系留与失活的分子基础。大自然。2020;587(7835):673 - 7。gydF4y2Ba
陈红，陈红，张娟，王艳，Simoneau A，杨红，Levine A，邹玲，陈志，兰玲。cGAS作为复制叉的减速器抑制基因组不稳定性。科学通报2020,6(42)。gydF4y2Ba
感谢郑春福教授的STING-HA质粒、IFN-I-β-Luc质粒和IRF3/5D-FLAG质粒。我们也要感谢Fanxiu Zhu教授的cgas flag质粒。gydF4y2Ba
本研究由国家自然科学基金(No. 81873971)和重庆市科委基金(No. 81873971)资助。Cstc2016jcyA0264)。gydF4y2Ba
CWX和WY对研究的概念和设计做出了贡献。CH和JLS进行实验，分析数据，并起草手稿。CS, HQ和HY分析了数据。所有作者审阅了手稿并批准了提交的版本。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba
不适用。gydF4y2Ba
所有作者都同意这篇稿子。gydF4y2Ba
作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba
伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba
陈浩，姜林，陈松。gydF4y2Baet al。gydF4y2BaHBx通过cGAS的泛素化和自噬抑制DNA传感信号通路。gydF4y2Ba性研究JgydF4y2Ba19gydF4y2Ba， 55(2022)。https://doi.org/10.1186/s12985-022-01785-3gydF4y2Ba
收到了gydF4y2Ba：gydF4y2Ba
接受gydF4y2Ba：gydF4y2Ba
发表gydF4y2Ba：gydF4y2Ba
DOIgydF4y2Ba：gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1186/s12985-022-01785-3gydF4y2Ba
病毒学杂志gydF4y2Ba