埃塞俄比亚西北部HIV合并感染和单一感染人群中乙型肝炎病毒的分子流行病学研究

背景

乙型肝炎病毒(HBV)感染是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者特别关注的问题。在埃塞俄比亚，缺乏艾滋病毒合并感染和有症状的肝病患者中HBV流行的详细临床和病毒学描述。本研究的目的是调查埃塞俄比亚HBV/HIV合并感染者和HBV单一感染者的HBV病毒学特征。

方法

共有4105份来自HIV阳性个体、肝病患者和献血者的血清进行了HBV血清学筛查。提取180例HBV感染者的重叠聚合酶/表面基因组区，扩增并测序进行基因型分析。

结果

乙肝表面抗原在肝病患者中阳性率为43%，在献血者中阳性率为8.4%，在HIV/HBV合并感染者中阳性率为6.7%。在HIV/HBV合并感染的个体中，隐性HBV患病率为3.7%，献血者中隐性HBV患病率为2.8%，总体患病率为3.4%。系统发育分析显示3种HBV基因型;A(61.1%)、D(38.3%)及E(0.6%)。基因型A为A1(99.1%)和A9(0.9%)亚型，而基因型D为异质性亚型;D2(63.8%),其次是D4(21.7%)、D1(8.7%)、D3(4.3%),和D10(1.4%)。

结论

与肝脏疾病患者相比，HIV/HBV合并感染者和献血者HBsAg血清阳性率较低。隐性HBV流行率在HIV/HBV合并感染组和献血者组之间没有差异。该研究证实了埃塞俄比亚西北部HBV亚型A1和D2的优势分布。观察到的病毒学特征可能有助于埃塞俄比亚病毒性肝炎的循证管理，在埃塞俄比亚，抗逆转录病毒治疗指南没有考虑到艾滋病毒合并感染期间的病毒性肝炎筛查。

HBV是持续性肝脏感染和慢性肝脏疾病的主要原因之一。乙型肝炎病毒在全球约有2.4亿人感染，其临床后果、血清流行病学和基因型分布存在地理差异[1，2］．乙型肝炎病毒的全球分布范围从东亚、非洲和亚马逊盆地地区的超流行(> 8%)到欧洲、北美和澳大利亚的中等流行(2-7%)[1］．HBV具有高度的遗传异质性，可分为10种基因型(a - j)和若干亚型[1］．HBV基因型的多样性也与不同的临床感染模式、肝病严重程度有关[3.]、病毒持久性和对抗病毒治疗的反应[4］．

就传播途径和相关危险因素而言，HBV和HIV之间普遍存在高度的流行病学相似性[5］．HBV/HIV合并感染者更容易传播肝炎病毒，HBV慢性感染是一种常见的临床现象[6］．除了流行病学重叠外，HBV/HIV合并感染的病毒学和免疫学相互作用也改变了每种病毒的自然临床病史和管理。高活性抗逆转录病毒疗法(ART)的引入降低了艾滋病毒/获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)的发病率和死亡率。但与病毒性肝炎相关的肝脏疾病仍成为全球HBV/HIV合并感染期间的第二大死亡原因[7］．特别是，HBV的遗传变异和临床并发症被认为在合并感染期间更容易受到HIV的影响[5，8]，尽管关于HBV对HIV自然史影响的争议仍在继续[6，9］．慢性HBV/HIV合并感染患者血清中HBV病毒载量较高，影响HBV感染化解机制。更重要的是，HBV/HIV合并感染的患者可能有更高的慢性肝病并发症风险，包括肝硬化和肝细胞癌[6］．因此，病毒相互作用对自然史和治疗结果的影响在HBV/HIV合并感染者的管理中变得越来越重要，特别是在这两种病毒都流行的地区。

此外，尽管艾滋病毒与该地区HBV高流行率相关，但在大多数非洲地区，HBV治疗较少。10］．同样，埃塞俄比亚在HIV/HBV合并感染期间肝病患者中HBV报告较少，尽管从献血者和普通人群中可获得大量HBV血清流行病学报告[11］．总的来说，埃塞俄比亚缺乏详细的HBV在HIV合并感染和有症状的肝病患者中流行的临床和病毒学描述。特别是，埃塞俄比亚忽视了完善的乙肝病毒筛查和临床管理[12］．因此，临床参数是评估肝脏相关疾病的唯一手段，这些疾病对确定HBV合并感染期间艾滋病毒的影响具有有限的预测价值。因此，这项研究的目的是调查来自埃塞俄比亚西北部的HIV合并感染和单一感染人群的HBV血清学和病毒学特征。

研究人群

在贡达尔大学机构伦理审查委员会(编号:RCS/V/P/05/372/2013)批准伦理许可并获得研究参与者的知情同意后，于2013年收集了人口学、临床数据和血清。从埃塞俄比亚西北部的三个卫生机构共招募了4105名研究人群;即贡达尔大学教学医院、贡达尔卫生中心和德布雷塔博尔区医院。研究人群来自三个研究组;献血者(n = 1720)、肝病患者(n = 252)和艾滋病毒携带者(n = 2133)(表2)1)．献血者显然是健康的，但艾滋病毒阳性组是在一组已知的艾滋病毒阳性患者中招募的，他们正在接受抗逆转录病毒治疗诊所的常规随访。收集血清时记录与ART相关的临床信息，如ART状态和适格性、ART方案、ART临床毒性评估、世界卫生组织(WHO)分期和机会性感染状况。肝病患者组包括有一种或多种急性和慢性肝病临床表现的病例，如黄疸、腹水、肝硬化、肝肿大、肝细胞癌和/或以前报道的其他感染引起的肝脏并发症[13］．

采血和血清学检测

采集静脉血约10 ml。根据制造商的说明，使用市售HBsAg快速检测试剂盒(In Tec Products, INC, 332新光路，厦门，中国)对血清进行HBsAg筛查。从这些HBsAg阳性血清中，使用市售酶免疫测定试剂盒(Abbott Diagnostics, Wiesbaden, Germany)进行HBV e抗原(HBeAg)检测。

在隐匿性HBV (OHB)分析中，对476例HBsAg阴性病例进行抗hbc抗体(anti-HBcAb)检测，采用酶知®抗hbc单克隆ELISA(西门子医疗诊断产品有限公司，马尔堡，德国)。然后，使用ARCHITECT系统(Abbott Diagnostics, Delkenheim, Germany)进一步检测抗hbc抗体阳性血清的抗hbs抗体。然后将抗hbs抗体阳性和阴性(但抗hbc抗体阳性)血清进行HBV DNA检测和病毒载量测定。

根据世卫组织采用的为发展中国家设计的埃塞俄比亚国家检测算法，使用HIV-1/2快速检测试剂盒进行HIV-1/2筛查[14］．测试算法使用三个快速诊断测试套件串联;HIV-(1/ + 2) Antibody胶体金(KHB，上海科华生物工程有限公司，中国)作为筛查试验，如果筛查结果呈阳性，则进行HIV-1/2 STAT-PAK®(Chembio HIV-1/2, Medford, New York, USA)。在上述两种试剂盒检测结果不一致的情况下，使用Unigold™HIV (Trinity Biotech, Ireland)作为决胜局来决定最终结果。

DNA提取、PCR、测序

使用Abbott m2000sp自动样品制备系统(Abbott Molecular, Des Plaines, IL, USA)上的mSample制备系统核酸提取试剂盒分别从900µl血浆中提取HBV DNA。在Abbott m2000rt系统(Abbott Molecular, Des Plaines, IL, USA)上使用实时HBV定量检测试剂盒(低检出率< 10 IU/mL)检测HBV病毒载量。HBV的提取、扩增和测序步骤已在前面详细描述[15］．

简单地说，为了测序，使用Taq DNA聚合酶(Promega, Madison, WI, USA)使用前面描述的正向(5'AAAT TCGC AGTC CCA ACC3 ')和反向(5'GCAG CAAA GCCC AAAAG ACC3 ')引物扩增重叠的HBV聚合酶/表面基因组区域(密码子52-298 nt) [15，16］．扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用Wizard®SV gel & PCR clean - up system (Promega, Mannheim, Germany)分离纯化。使用ABI Prism 3500基因分析仪(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上的BigDye Terminator Cycle sequencing Ready Reaction试剂盒对清洁的HBV DNA PCR产物进行正向和反向链的直接测序。

系统发育分析

使用genous®软件6.1.4版本手动编辑和组装核苷酸序列后(http://www.geneious.com)，用MEGA 6进行基因分型分析(http://www.megasoftware.net)．为了进行系统发育分析，HBV基因型参考序列从HBV数据库(https://hbvdb.ibcp.fr/HBVdb/HBVdbNomenclature?nomenclature=table)．此外，从GenBank Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)中检索到一组同源序列。采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，采用Kimura 2-parameter法计算遗传距离(http://www.megasoftware.net)．为了确认系统发育树的可靠性，进行了1000次自举重采样试验。本研究中使用的HBV核苷酸序列注册于GenBank/EMBL/DDBJ数据库，登录号为KT367571-KT367731和OL630698-OL630716。

统计分析

分析时适当采用Mann-Whitney非参数检验和卡方检验。采用Graph Pad Prism版本5.01,2007进行统计分析。P值< 0.05认为有统计学意义。

HBsAg阳性的血清学和病毒载量特征

HBsAg-HIV合并感染研究参与者的人口学和临床特征细节见表2．HIV合并感染者HBsAg的血清流行率6.7%(143例)显著低于献血者;8.4% (145) (p= 0.04)、肝病患者;43.3% (109) (p< 0.001)(图1A).相比之下，HBeAg在HIV阳性人群中的频率显著较高(44.6% (25)，p= 0.02)和肝病患者(41.8%(23人)，p= 0.04)高于献血者;21.7%(10)(图;1B)。

HBV病毒血症发生率在HIV/HBV合并感染者中分布频率为55.5%(71/128)，在献血者中分布频率为79.6%(82/103)，在肝病患者中分布频率为89.9%(98/109)(表2)1)．在HIV/HBV合并感染中，接受抗逆转录病毒治疗的HBV病毒血症率明显较低;47.5% (38/80);68.8% (33/48) (p= 0.02)。总体中位数(四分位范围;IQR)病毒载量水平也在每个研究组中进行了比较，结果显示，HIV/HBV合并感染者的差异显著高于献血者和肝病患者(图2)。2)．同样，在HBV测序血清中，HIV/HBV合并感染的个体;6.4 log IU/ml(3.1 ~ 8.3)的病毒载量高于献血者;3.3 log IU/ml(2.7-3.8)与肝病患者;5.0 log IU/ml(3.9-6.8)(图;2)．然而，HBV病毒载量的中位数(IQR)水平在接受ART治疗的患者之间没有显著差异;4.6 log IU/ml(3.1-8.4)和ART navy;6.5 log IU/ml (2.9-7.9) (p= 0.89)。

隐匿性HBV的血清学和病毒载量特征

HBV/HIV合并感染者和献血者抗hbcab阳性率分别为57.0%(171/300)和50.6%(89/176)，差异无统计学意义(p= 0.21)。3.A).抗- hbcab阳性个体中抗- hbs阴性频率在HIV合并感染个体间无显著性差异;献血者77人，占25.7%;18.8% (33) (p= 0.11)3.B).在抗hbc抗体阳性的病例中，14.3%(11/77)的HIV合并感染者和15.2%(5/33)的献血者HBV DNA阳性(表2)3.)．OHB感染(HBsAg阴性但DNA阳性)的总血清阳性率为3.4%。然而，在HIV合并感染者和献血者中，血清阳性率分别为3.7%(11/300)和2.8%(5/176)。OHB感染的病毒载量范围为< 1至3.69 log IU/ml。

乙型肝炎病毒遗传多样性

共对180份HBV DNA阳性血清(HBsAg阳性病例177份，OHB感染3份)进行测序和基因分型(表2)1而且3.)，其中HBV/HIV合并感染者占36.1%(65人)，献血者占31.6%(56人)，肝病患者占33.3%(59人)。基因型分析显示3种HBV基因型;A型占61.1%(110人)，D型占38.3%(69人)，e型占0.6%(1人)。进一步的亚基因型分析显示，A型为A1，占99.1%(109人)，A9，占0.9%(1人)。D型中D2亚型占63.8%(44人)，D4亚型占21.7%(15人)，D1亚型占8.7%(6人)，D3亚型占4.3%(3人)，D10亚型占1.4%(1人)。

基因型A无显著性(p> 0.05) HIV合并感染者的差异分布;37人(33.6%)为献血者;33.6%(37例)，肝病患者;32.7%(36例)。同样，D基因型在上述各组中也有39.1% (n = 27)、27.5% (n = 19)和33.3% (n = 23)的分布(p> 0.05)。

系统发育分析显示，大部分A基因型聚集在非洲亚型，但也有部分聚集在亚洲、美洲(海地)和澳大利亚亚型。基因型D通常聚集在东非、北非、中东和欧洲菌株。单个分离的基因型E与非洲菌株的同源性最高(图2)。4)．

根据乙型肝炎流行病学的地理差异[17]，埃塞俄比亚的HBV流行程度可分为高中级(5-7%)至超流行(≥8%)。本研究记录的HBsAg患病率从HIV/HBV感染者的6.7%和献血者的8.4%到肝病患者的43.3%。献血者的HBV流行率与其他非洲国家的报告一致[18，19，20.］．同样，肝病患者中的HBV流行率与非洲有症状患者的类似报告相当[21］．本研究中HIV感染者与献血者和肝病患者的HBV患病率相对较低，与非洲其他类似研究相比(9.0-16.9%)[10，22，23]可能与联合感染期间用于治疗艾滋病毒的拉米夫定和替诺福韦等抗逆转录病毒治疗药物有关[24]因为在本研究中筛查HBV的大多数(70.4%)HIV合并感染病例是在不同的抗逆转录病毒治疗方案下经历的药物。然而，目前研究中6.7%的HBV在埃塞俄比亚HIV合并感染者中处于先前报告的HBV流行率(3.7-7.4%)范围内[11］．此外，目前研究中HBV/HIV合并感染人群的特征还包括存在经典的和假定的免疫逃逸HBsAg基因变异[16]下调HBsAg抗体结合表面蛋白，这通常与低HBsAg导致HBV假阴性的高几率有关[25］．但是，在HBV检测呈阳性的病例中，尽管接受了抗逆转录病毒治疗，HIV患者的HBV病毒血症率仍然很高。这可能与研究地区多年来未检测患者HBV状态的HIV治疗有关，这是之前观察到和报道的多药耐药基因变异性组合的高比率[16］．

然而，与较低的HBsAg检出率相比，在这些HBV/ hiv感染者中观察到HBeAg频率几乎高出两倍，且中位病毒载量水平显著升高。然而，观察到HBsAg阴性HIV感染研究组的抗hbcab率显著较高，表明HIV合并感染期间的既往感染率相对较高。然而，在过去感染后显示免疫的抗- hbs状态与HIV感染者和单一感染者几乎相似。这可能支持这样一个事实，即在研究环境中，不同研究组的HBV暴露机会可能没有差异。在埃塞俄比亚，2007年开始对新生儿进行乙肝疫苗接种，目前的成年研究人群没有接种疫苗。报告还将艾滋病毒感染与“血清沉默”OHB感染联系起来，这对诊断、预防和控制提出了严重问题[22］．在本研究的HIV/HBV合并感染个体中，检测到3.7%的OHB感染，这突出了整合OHB筛查以适当管理HIV合并感染患者肝脏疾病的必要性。

在本研究中，系统发育分析揭示了三个基因型的循环;总体而言，基因型以A型为主，A型和D型的差异最大，它们聚集在非洲、亚洲、美洲、欧洲、中东和大洋洲的演化支中。在埃塞俄比亚所属的东非，在以东的索马里发现了A型基因的优势[26]和在肯尼亚[27到南方去。然而，在埃塞俄比亚西部的邻国苏丹，地理上接近，通过贸易和移民大量涌入的人口流动在埃塞俄比亚西北部目前的研究环境中很常见，所确定的基因型显示出不同的分布模式。与埃塞俄比亚以基因型A为主不同，苏丹以基因型D和E为主[19］．在这项研究中，只有一种基因型为E的分离物被鉴定出来，但当然与苏丹菌株的同源性最高。

虽然基因型A被认为是HBV的异质性基因型之一[28]，本研究发现A1亚型占优势。这实际上与迄今为止测序的大多数来自非洲的分离株属于A1亚型一致。A1亚型的优势和大多数分离株与邻近的索马里和其他东非分离株的系统发育相似性也支持了这一观点，即它是在一些非洲国家的土著人口中进化而来的，并且比其他亚型在非洲有更长的自然史[29］．

与基因型A不同，基因型D的亚型在本研究人群中呈异质性(D1、D2、D3、D4和D10)。事实上，D1至D5亚型在目前所描述的9种亚型(D1- d9)中以其更广泛的全球分布而闻名[1，28，30.］．在这项研究中，D2亚型(61.1%)和D4亚型(21.7%)占主导地位，尽管最近埃塞俄比亚献血者的一份报告报告D4亚型最少(2.5%)，也未能确定D3亚型[31］．然而，D3亚型在本研究中仅在肝病患者中发现。既往研究表明D1亚型主要分布在非洲东部国家[32]，尽管目前的研究和早些时候来自邻国索马里的一份报告[29]以D2和D4为主。因此，这些亚型可能是埃塞俄比亚和索马里的土著。这是因为邻近的中东和北非地区[1]，但在当前的研究中，该亚型的频率非常低(8.7%)。此外，地理上邻近的国家，大多与D2、D3和D4亚型有关(南非、阿拉斯加、欧洲南部至东北部和大洋洲)[1，33]虽然目前研究中很少有分离株与来自阿曼、英国和意大利等遥远的分离株有系统发育关系。实际上，鉴于本研究系统发育分析所使用的聚合酶/表面基因序列，除非比较全基因组序列，否则这样的结论可能是片面的，因为已知HIV合并感染是导致HBV变异性和高重组率的原因[34］．例如，最近描述的来自尼日尔和印度的新的D8和D9亚型，分别被认为是基因E型的D型重组形式[35基因型C [36］．埃塞俄比亚还报告有一种新型乙型肝炎病毒D10亚型在流行[37]，但在目前的研究中，只有一个分离物被鉴定为该亚型。总体而言，该研究表明，埃塞俄比亚西北部的基因型D亚型是异质性的。

综上所述，与献血者相比，HIV/HBV合并感染组HBV血清阳性率较低，但HBeAg检出率较高，病毒载量中值水平较高。此外，显示既往HBV感染的抗hbcab在HIV合并感染组显著升高，但与抗hbs (HBV对既往感染免疫的一种标志物)和OHB感染无差异。系统发育分析显示，埃塞俄比亚存在HBV亚型(A1、A9、D1、D2、D3、D4、D10和E)的异质性，其中A1和D2亚型占优势。乙型肝炎病毒亚型显示最分散的分离株聚集在非洲和非非洲支。这是埃塞俄比亚首次在HIV合并感染和有症状的肝病患者中进行HBV遗传多样性研究。这些数据将对进一步了解艾滋病毒合并感染期间HBV的临床和病毒学相互作用具有重大的公共卫生意义，在这个国家，病毒性肝炎的管理完全被忽视，艾滋病毒抗逆转录病毒指南甚至没有照顾到艾滋病毒合并感染期间的病毒性肝炎。

本研究中使用的HBV核苷酸序列注册于GenBank/EMBL/DDBJ数据库，登录号为KT367571-KT367731和OL630698-OL630716。

艾滋病:

获得性免疫缺陷综合症

Anti-HBs:

抗乙型肝炎表面

艺术:

积极抗逆转录病毒疗法

爆炸:

基本本地对齐搜索工具

ELISA:

酶联免疫吸附试验

HBcAb:

乙型肝炎核心抗体

表面:

乙型肝炎表面抗原

乙肝病毒:

乙型肝炎病毒

艾滋病毒:

人类免疫缺陷病毒

兆:

分子进化遗传学分析

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

OHB:

隐匿性乙型肝炎病毒

人:

世界卫生组织

作者要感谢埃塞俄比亚贡达尔大学医院、德布雷塔布尔医院和贡达尔保利健康中心的血清学科、血库、艾滋病毒检测和自愿咨询中心的研究参与者和工作人员。我们感谢Banchamlak Asmare、Getnet Ayelew、Amare Kiflie、Mengistu Endris、Feleke Moges教授、Melashu Balew和Zuriayash Alemu在数据收集期间提供的帮助。感谢Andargachew Mulu博士、Susanne Hummel和Kathleen Zielinski的专家技术援助。

这项研究得到了莱比锡大学的德国学术交流服务(DAAD)之友和赞助商的部分支持，并获得了Fusao Ota名誉教授2010年埃塞俄比亚青年研究员奖学金。http://web.me.com/fusao_ota/Japan-Ethiopia/toppage.Eng.html．

作者及隶属关系

1. 德国莱比锡大学医学微生物研究所病毒系

   Yeshambel Belyhun, Uwe Gerd Liebert和Melanie Maier

2. 埃塞俄比亚贡达尔大学医学和健康科学学院生物医学和实验室科学学院

   Yeshambel Belyhun

贡献

YB、UGL和MM对这项研究同样有贡献。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Yeshambel Belyhun．

伦理批准并同意参与

该研究获得了贡达尔大学机构伦理审查委员会的伦理批准(编号:RCS/V/P/05/372/2013)，并获得了埃塞俄比亚贡达尔大学教学医院、Debretabor医院和贡达尔保利保健中心的许可(编号:CMHS/08/30/2013)。在数据收集前还获得了每位研究参与者的知情同意。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明我们之间没有任何利益冲突。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。

转载及权限