马疱疹病毒-8 (EHV-8)是世界范围内感染马属哺乳动物的最具经济意义的病毒之一，可导致马严重的呼吸道疾病和流产。然而，目前还没有关于驴因EHV-8导致流产的报道。
本病例报告是关于一头4岁驴在怀孕296天堕胎并出现严重呼吸问题。细菌学和分子试验用于筛选可能的细菌/病毒病原体，以检测病原。马流产沙门氏菌在本研究中，EHV-1、EHV-4和EAV均为阴性。另一方面，EHV-8是唯一被分离和识别的病原体。
这是中国首次从一头驴身上分离出EHV-8病毒。EHV-8感染可导致驴流产;因此，兽医和育种者应该意识到这一点。
影响马或驴业的主要传染性病原体是马疱疹病毒[1］．到目前为止，在马科动物身上发现了九种疱疹病毒。EHV-1、EHV-2、EHV-3、EHV-4和EHV-5感染马，而EHV-6 (AHV-1)、EHV-7 (AHV-2)和EHV-8 (AHV-3)与驴的感染有关[2，3.，4］．特别是ahv、EHV-8和EHV-9与EHV-1的联系比EHV-4更紧密[5，6］．
EHV-8是一种具有双链包膜DNA的疱疹病毒科病毒，属于阿尔法疱疹病毒亚科[4，7］．EHV-8的基因组长约150 kb，包含76个开放阅读框(orf) [8］．1988年，澳大利亚在潜伏感染的驴的鼻腔中分离出EHV-8 [3.］．在中国的一匹发烧和有鼻分泌物的马和以色列的一头阉割后出现严重切口感染的驴身上也发现了这种病毒[9，10］．EHV-8的发病机制尚不清楚，该病毒仅与驴的呼吸和神经系统疾病以及马的流产有关[4，5］．
这是第一份记录驴ehv -8人工流产典型病例的报告。有人提出EHV-8是与驴流产有关的潜在病原体。
2021年5月29日，聊城一家大型农场的一头4岁母驴在怀孕第296天流产。厌食、悲伤、不愿移动、低着头都是母驴的症状。除了肺呈蓝色/紫色外，流产胎儿的尸检没有发现明显的严重异常(图2)。1)．
流产胎儿的严重损伤。一个驴的流产胎儿;b心;c肺和肝
取流产胎儿胎盘、脐带、肺、肝组织标本进行细菌学检测，以确定病因。如前所述，所有组织标本均在沙门氏菌-志贺氏菌琼脂和5%羊血琼脂上培养，并在37℃下培养24 h [11］．结果显示，培养板上没有菌落。随后，如早期出版物所述，发现了潜在的病毒[12］．根据制造商说明，使用EasyPure®病毒DNA/RNA试剂盒从胎盘、脐带、肺和肝组织(北京创根生物技术有限公司，中国)中提取RNA和DNA。使用PrimeScript™RT-PCR试剂盒，使用合适的引物进行一步反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增，用于EAV检测(Takara Bio, Inc.， Japan)。采用PCR方法，使用指定引物检测EHV-1、EHV-4和EHV-8病毒(表2)1)．PCR周期如下:94°C 5 min, 94°C 30 s, 56°C 45 s, 72°C 1 min, 72°C 10 min。EAV、EHV-1和EHV-4在所有组织样本中均为阴性。脐带、胎盘和肺组织均为ehv -8阳性，预测产物为316 bp。然而，在肝组织中没有检测到，并使用琼脂糖凝胶进行识别(图。2)．
病毒病原体筛选。从组织中提取病毒DNA/RNA, EAV (一个)， ehv-1 (b)， ehv-4 (c)， ehv-8 (d)经RT/PCR和PCR检测。M道代表一个5000bp的DNA分子量阶梯。1为阴性对照，2为肝脏，3为胎盘，4为脐带，5为肺
如前所述，在胎盘和脐带上使用免疫组化(IHC)来确认体内EHV-8感染[13，14，15］．脐带和胎盘组织用10%福尔马林保存，石蜡包埋，用切片机(徕卡)切至5 μm，并安装在载玻片上。用过氧化氢处理以抑制内源性过氧化物酶。用ehv -8阳性血清(我们实验室的标本)进行过夜免疫染色后，载玻片在PBS中冲洗，用山根过氧化物酶偶联兔抗驴IgG处理1 h，用二氨基联苯胺染色5 min，用水冲洗，吉尔苏木精反染色30 s，脱水，清除，放在玻片上。阴性对照与阳性对照处理相同，但不进行抗体孵育，以评估非特异性结合效应。由于二氨基联苯胺的存在，脐带和胎盘中的ehv -8阳性细胞呈棕色，如图所示。3.，但对照载玻片未见ehv -8阳性细胞。
用阳性血清进行EHV-8免疫组化(IHC)染色的代表性图像。免疫组化检测EHV-8抗原。pbs治疗组为阴性对照，脐带(一个)和胎盘(B)．实验组用EHV-8阳性血清涂抹脐带(一个)和胎盘(b)组织。比例尺，50 μm
随后，如前所述，分离出EHV-8菌株[16］．用ehv -8阳性胎盘上清接种两天后，RK-13细胞(右)和阴性细胞(左)均出现细胞病变效应(CPE)。4a).采用本实验室制备的抗EHV-8小鼠血清进行免疫荧光试验(IFA)， cpe阳性细胞和模拟细胞分别用75%乙醇固定，DyLight 594标记的山羊抗小鼠IgG(H + L)为二抗。与模拟对照RK-13细胞相比，在cpe阳性细胞的细胞质和细胞核中观察到EHV-8蛋白(图2)。4b)。
EHV-8的分离鉴定。RK-13细胞分别接种ehv -8阳性胎盘上清液(右图)或模拟对照(左图)。一个感染后48 h，显微镜下观察CPE。比例尺，100µm。bEHV-8分离物的IFA鉴定。cpe阳性的RK-13细胞和模拟对照细胞用75%乙醇固定。使用抗EHV-8小鼠血清进行间接免疫荧光检测，图像显示了EHV-8蛋白的亚细胞位置，以及相应的DyLight 594偶联二抗。细胞用Leica DMi8成像。比例尺，50µm。cPCR检测不同人群的EHV-8 ORF70基因。从这些细胞中提取DNA。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳。左侧标记(M巷)，1为阴性对照，2为模拟对照RK-13细胞，3为CPE阳性RK-13细胞
采用PCR方法检测EHV-8分离物，收集cpe阳性细胞，提取DNA，采用G1-Forward和G1-Reverse引物进行EHV-8检测。在cpe阳性组中，琼脂糖凝胶电泳显示了一个预期大小为316 bp的单一条带(图。4c)。
与此同时，经过一周的抗生素治疗，母驴逐渐康复。获得母驴鼻拭子和血液样本，并利用上述PCR方法检测EHV-8感染。然而,ORF70基因的不完整序列仍然可以在这些样本中检测到(附加文件1:图S1)。最后，主人为了防止EHV-8病毒的传播，把这头驴安乐死了。
近年来，中国各地涌现出大量大型驴场，为当地经济做出了巨大贡献。然而，由于驴的广泛饲养，流行病逐年增加[17，18，19］．特别是堕胎和呼吸道疾病，给中国的驴业造成了巨大的经济损失，严重限制了它的扩张。根据先前的研究，驴或马驹的流产与几种微生物有关，例如流产沙门氏菌，钩端螺旋体spp，马链球菌，Zooepidemicus、马动脉炎病毒(EAV)、EHV-1、EHV-4及EHV-8 [4，14，20.，21，22，23，24，25］．在Li等人之前的研究中，马流产沙门氏菌据报道与母驴流产密切相关，尽管在这种情况下没有发现[12］．此外，与之前的研究一样，在本例中，EHV-1、EHV-4和EAV均为阴性[12］．
EHV-8与驴和马的呼吸道症状、流产和神经系统疾病有关[9，10］．在此情况下进行了细菌学培养和病毒筛选。仅发现并分离出EHV-8，提示EHV-8是引起母驴流产的主要病原之一。
根据我们最近的研究，山东省大型驴场的EHV-8阳性率可能高达25.3%。因此，应重视驴场的EHV-8感染，并探索相应的预防措施，减少EHV-8感染。
所有相关数据都在本文中。
马疱疹病毒8型
马动脉炎病毒
开放阅读框
细胞病理效应
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不适用。
本文由聊城大学科研基金(318051919,318051918)、山东省驴产业技术协同创新中心开放项目(No. 3193308)、聊城大学畜牧学科开放项目(319312101- 23,319312101 -22)、山东省现代农业技术体系驴产业创新团队(SDAIT-27)资助。
T.W.和L.H.进行了研究，分析数据，并起草了手稿。Y.W.和C.W.参与了样品的采集和PCR检测。g.l.， w.z.， M.Z.对病毒的分离和鉴定做出了贡献。W.L.和H.R.修改了手稿。l.l.构思了这项研究，进行了额外的分析，并最终确定了手稿。所有作者都对手稿的修改做出了贡献。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。
所有程序均经聊城大学动物科学研究所动物福利与伦理委员会批准(协议号LC2021-05)，并按照中国农业部《动物伦理程序与指南》执行。根据批准的程序采集血液或鼻拭子样本。主人为他们的驴被纳入研究提供了知情的书面同意。这项研究是按照reach指南进行的。
驴的主人提供了发表的书面同意。
作者宣称他们之间没有利益冲突。
伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。
用PCR法检测母驴EHV-8感染。
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王涛，胡林，王勇。et al。驴流产马疱疹病毒8的鉴定:一例报告。性研究J19， 10(2022)。https://doi.org/10.1186/s12985-021-01738-2
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