核因子e2相关因子2 (Nrf2)的上调抑制单纯疱疹病毒1型的复制gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

核因子e2相关因子2 (Nrf2)是一种重要的转录因子，在解毒活性氧(ROS)中起着关键作用，最近已被证明可以调节炎症和抗病毒反应。然而，Nrf2在单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染中的作用仍不清楚。在这项研究中，研究了Nrf2和HSV-1复制之间的相互作用。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

采用8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-OHdG) ELISA试剂盒检测氧化应激水平，Western Blot检测nrf2 -抗氧化反应元件(Nrf2-ARE)通路的动态变化。采用Western Blot、Real-Time PCR和TCID分析Nrf2-ARE通路对HSV-1增殖的调控作用gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba化验。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

HSV-1感染诱导氧化应激。Nrf2在HSV-1感染早期被激活，其下游抗氧化酶血红素氧合酶-1 (HO-1)和NAD(P)H醌氧化还原酶-1 (NQO1)升高。Nrf2过表达或用其激活剂叔丁基对苯二酚(tBHQ)处理可抑制HSV-1的增殖。相反，Nrf2的沉默促进了病毒的复制。HO-1参与调控IFN反应，导致有效的抗hsv -1作用。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的观察表明Nrf2-ARE通路在HSV-1感染的早期激活被动防御反应。靶向Nrf2途径证明了对抗HSV-1感染的潜力。gydF4y2Ba

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是一种流行和重要的人类病原体，全世界成人血清流行率超过80%。尽管付出了巨大的努力，但仍然没有治愈HSV-1的方法和疫苗。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．病毒感染诱导的氧化应激是主要致病机制之一，可能通过破坏细胞内氧化还原循环的平衡而导致炎症反应和组织损伤[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．HSV-1感染产生的活性氧(ROS)对病毒复制有重要影响[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]并使细胞对凋亡敏感[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

核因子e2相关因子2 (Nrf2)是调节细胞对氧化应激的适应性反应的中心转录因子。在非胁迫条件下，Nrf2由于与kelch样ech相关蛋白1 (Keap1)相互作用而低表达，导致Nrf2的泛素化和降解，而在胁迫信号下，Nrf2从Keap1上解离并转移到细胞核，然后与称为抗氧化反应元件(ARE)的DNA序列结合，随后启动抗氧化基因的转录，包括血红素加氧酶-1 (HO-1)， NAD(P)H醌氧化还原酶1 (NQO1)，保护细胞免受不同压力的不利影响[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

nrf2 -抗氧化防御系统的调节参与病毒易感性、病毒相关炎症和免疫清除。几种激动剂，包括叔丁基对苯二酚(tBHQ)、D、l -萝卜硫素(SFN)和富马酸二甲酯(DMF)，靶向Nrf2并对兔出血性疾病病毒(RHDV)、鲤鱼病毒春季病毒血症(SVCV)和SARS-CoV2感染表现出抗病毒活性[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．然而，目前HSV-1感染对Nrf2通路的影响尚不清楚，Nrf2在HSV-1感染中的作用有待进一步阐明。gydF4y2Ba

在本研究中，我们旨在研究Nrf2在HSV-1感染的HEp-2细胞中的作用。我们的数据显示，HSV-1感染诱导氧化应激，Nrf2在病毒感染早期被激活。上调Nrf2可有效抑制HSV-1的增殖。然而，沉默Nrf2促进病毒复制。Nrf2-ARE通路参与调控HSV-1感染后氧化应激和炎症反应。激活依赖于nrf2的抗氧化途径可能是对抗HSV-1感染的可行治疗方法。gydF4y2Ba

细胞病毒质粒和化学物质gydF4y2Ba

HEp-2和Vero细胞来自我们研究所的库存，在Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM) (Hyclone, USA)中添加10% FBS (Thermo Fisher Scientific, USA)， 37°C和5% CO中培养gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．HSV-1 BAC Luc由郑春富教授(福建医科大学，福州，中国)赠送[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．Nrf2表达质粒nHA-NFE2L2/pRK5由我所王姣博士构建(未发表)。tBHQ (MedChemExpress，美国，CAS编号:1948-33-0)通过在二甲基亚砜(DMSO)中分级稀释到所需浓度(SIGMA，美国)。X-tremeGENE HP转染试剂购自瑞士罗氏公司。gydF4y2Ba

病毒感染gydF4y2Ba

HEp-2细胞按4 × 10接种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba在6孔板(Corning, USA)中每孔培养细胞，并培养过夜以研究Nrf2在HSV-1感染过程中的调控。HSV-1感染细胞的感染倍数(MOI)为1。在感染后6、12和24 h采集样本。采用8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-OHdG)法监测HSV-1感染诱导的氧化应激水平。Western Blot检测Nrf2 (Abcam, USA)、Keap1 (Abcam, USA)、HO-1 (CST, USA)、NQO1 (CST, USA)和病毒蛋白ICP4 (Abcam, USA)的表达。进一步研究病毒感染对Nrf2-ARE通路的影响。细胞在MOI分别为0.5、1、2、5时感染HSV-1。Western Blot检测Nrf2及其调控抗氧化酶的表达。gydF4y2Ba

为了研究Nrf2上调对HSV-1增殖的影响，以2 × 10的剂量接种HEp-2细胞gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba每孔细胞在6孔板(康宁，美国)培养过夜。在感染HSV-1 (MOI = 1)前24 h，用两种不同浓度(1µg, 0.5µg) Nrf2质粒预处理细胞，然后在维持培养基中培养24 h，提取蛋白和总RNA。如上所述，Western Blot检测蛋白表达，包括HSV-1糖蛋白D (gD) (Abcam, USA)。冷冻解冻3次后，用TCID法测定上清液的病毒滴度gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba化验。Real-Time PCR检测干扰素α (IFN-α)、2 ' -5 ' -寡聚腺苷酸合成酶1 (OAS1)和人泛素样修饰剂(ISG15)的表达。gydF4y2Ba

为了进一步探讨Nrf2内源性激活对HSV-1增殖的影响，以2 × 10的剂量接种HEp-2细胞gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba每孔细胞在6孔板(康宁，美国)培养过夜。在感染HSV-1 (MOI = 1)前12小时，用两种不同浓度(10µM, 25µM)的tBHQ预处理细胞，然后在维持培养基中培养24小时。如上所述，分别用Western Blot和Real-Time PCR检测蛋白和基因的表达，用TCID检测病毒滴度gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba化验。gydF4y2Ba

为了进一步验证Nrf2对HSV-1的保护作用，通过转染siRNA敲除Nrf2。HEp-2细胞按2 × 10接种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba每孔细胞在6孔板(康宁，美国)培养过夜。在感染HSV-1 (MOI = 1)前12小时，用nrf2特异性siRNA (100 nM) (Santa Cruz, USA)或非特异性siRNA (NC)转染细胞。如前所述，分别用Western Blot和Real-Time PCR检测蛋白和基因的表达，用TCID检测病毒滴度gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba化验。gydF4y2Ba

Western blot分析gydF4y2Ba

根据前面描述的方案，用Western Blot检测蛋白的表达[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．简单地说，使用含有1 × Cocktail (SIGMA，美国)的裂解缓冲液裂解细胞。离心后12000gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃15 min，等量蛋白质样品用4 - 20% SDS-PAGE (Beyotime，中国)分离，用半干转移系统(Bio-Rad，美国)转移到PVDF膜上(Millipore，美国)，然后用5%脱脂牛奶在室温下阻断1 h，膜上依次加入相应的一抗Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1、ICP4、gD和β-actin, 4℃孵育过夜。二抗为抗兔IgG，酶标连接抗体，抗小鼠IgG，酶标连接抗体(Abcam, USA)。蛋白条带检测使用增强化学发光(ECL) Western blotting试剂盒(Millipore，美国)和Clinx ChemiScope成像系统(Clinx Science Instruments，中国)。gydF4y2Ba

实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

使用RNeasy Mini Kit (QIAGEN)提取总RNA。取1 μg总RNA，用Evo M-MLV RT Kit和gDNA Clean进行qPCR(艾特生物科技有限公司，中国)。实时PCR采用Gentier 96E系统(天龙股份有限公司，中国)，SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒(中国精准生物技术有限公司)，按照制造商说明进行。所有样品均重复3次，用2gydF4y2Ba^{−gydF4y2Ba△gydF4y2Ba△gydF4y2BaCTgydF4y2Ba}方法(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．引物的设计如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．IFN-α(正向)，5 ' -AGAGTCACCCATCTCAGCAAG-3 '， IFN-α(反向)，5 ' -CACCAGGACCATCAGTAAAGC-3 ';OAS1(正向)，5 ' -TCAGTCAGCAGAAGAGATAA-3 '， OAS1(反向)，5 ' -CAATGAACTTGTCCAGAGATT-3 ';ISG15(正向)，5 ' - gaccatcacccagaagat -3 '， ISG15(反向)，5 ' -CCTTGTTATTCCTCACCAG-3 '， GAPDH(正向)，5 ' - gacacccactcctccacctt3 '， GAPDH(反向)，5 ' -ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3 '。数据归一化为GAPDH的表达。实验分为3个重复，结果以平均±SDs表示;gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05为差异显著。gydF4y2Ba

病毒滴定gydF4y2Ba

Vero细胞按1 × 10播种gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba每孔在96孔板中(美国康宁)，并培养过夜。将原病毒样品按1:10进行一系列稀释，然后将100 μL稀释后的病毒转移到96孔板中，每稀释6孔平行，在37℃的培养箱中，5% CO孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba3-4天。对于每种稀释，对细胞病变效应(CPE)阳性的孔数进行评分。用50%组织培养感染剂量(TCID)计算病毒滴度gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)按照Reed-Muench方法[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．实验分为3个重复，结果以平均±SDs表示;gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05为差异显著。gydF4y2Ba

氧化应激的测量gydF4y2Ba

8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-OHdG)水平，作为氧化应激的衡量指标，使用8-OHdG ELISA试剂盒(mlbio有限公司中国)，根据制造商的说明进行监测。gydF4y2Ba

HSV-1感染诱导氧化应激，Nrf2在感染早期被激活gydF4y2Ba

为了确定氧化应激是否由HSV-1感染引起，在MOI为1时监测HSV-1感染后氧化应激的测量指标8-OHdG水平。如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa，与未感染的HEp-2细胞相比，感染HSV-1 24小时后8-OHdG相对水平升高。这一结果表明，HSV-1感染可诱导氧化应激。gydF4y2Ba

由于Nrf2- are通路在抗氧化反应的调控中起着至关重要的作用，我们检测了受Nrf2信号通路调控的典型下游靶点HO-1和NQO1的蛋白水平。如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab，随着HSV-1感染的进展，直接早期蛋白ICP4的病毒蛋白表达逐渐增加。病毒感染导致Nrf2表达早在6和12 hpi时增加。但在24 hpi时又恢复到基本水平。抗氧化酶HO-1和NQO1呈时间依赖性增加。gydF4y2Ba

为了证实HSV-1可诱导Nrf2的翻转，HEp-2细胞在不同感染倍数(MOI为0.5、1、2和5)下感染HSV-1，在24 hpi感染细胞中观察到Nrf2蛋白水平的剂量依赖性降低，支持HSV-1特异性干扰Nrf2表达的观点。特别是在24 hpi时，感染HSV-1后Nrf2蛋白表达降低到几乎无法检测到的水平，在MOI为5时，HO-1和NQO1的表达显著降低。gydF4y2Ba

上述结果表明，HSV-1感染诱导氧化应激，Nrf2及其下游抗氧化酶在HSV-1感染早期(12 hpi)被激活，在感染后期(24 hpi)被抑制。gydF4y2Ba

Nrf2的过表达抑制了HSV-1的复制gydF4y2Ba

目的探讨Nrf2上调对HSV-1增殖的影响。在HSV-1 (MOI = 1)感染之前，按照材料和方法中所述，用1µg或0.5µg Nrf2质粒预处理HEp-2细胞24 h。Western Blot结果显示，Nrf2过表达后，与未处理的HEp-2细胞相比，Nrf2及其下游HO-1、NQO1的表达增加，而与HSV-1感染细胞相比，病毒蛋白gD降低(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).此外，病毒滴度显著降低，大约从1 × 10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba到1 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba/毫升(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

已知HO-1可调节IFN的产生，并在抑制病毒复制中发挥重要作用[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．为了确定在HSV-1感染的情况下HO-1上调是否激活抗病毒IFN反应，我们测量了细胞内抗炎因子IFN-α、OAS1和ISG15的水平。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac, Nrf2在HSV-1感染细胞中过表达，IFN-α mRNA表达增强，一些ISGs如OAS1和ISG15蛋白表达增强。这些结果表明Nrf2通过HO-1介导的IFN反应在控制HSV-1复制中发挥作用。gydF4y2Ba

Nrf2激动剂tBHQ抑制HSV-1复制gydF4y2Ba

进一步探讨Nrf2内源性激活对HSV-1增殖的影响。Nrf2激活激动剂tBHQ被用来评估Nrf2激活对HSV-1复制的影响。tBHQ通过形成氨甲酰二硫酸盐来修饰Keap1中的半胱氨酸残基，并从Nrf2-Keap1复合体中释放Nrf2，从而导致Nrf2转位进入细胞核[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．因此，HEp-2细胞在感染HSV-1 (MOI = 1)前按照材料和方法用10或25 μM tBHQ预处理12 h。gydF4y2Ba

如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa、Nrf2、HO-1和NQO1较未处理的HEp-2细胞升高，而病毒蛋白gD较tBHQ处理的HSV-1感染细胞降低。此外，病毒滴度降低了约5.0 ~ 10.0倍。在HSV-1感染细胞中Nrf2的激活增强了IFN-α的mRNA表达，以及一些ISGs的蛋白表达，如OAS1和ISG15(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

综上所述，Nrf2的上调或内源性Nrf2的激活促进了下游抗氧化酶的表达，Nrf2- are通路控制了这些炎症基因的基础表达，有效抑制了HSV-1的增殖。gydF4y2Ba

沉默Nrf2促进病毒复制gydF4y2Ba

为了进一步评估Nrf2对HSV-1的保护作用，通过转染siRNA敲除Nrf2。与未处理的HEp-2细胞相比，转染Nrf2 siRNA可使Nrf2的表达降低90%。与此同时，Nrf2下游HO-1和NQO1蛋白水平也显著降低(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).在HSV-1复制方面，下调Nrf2的表达可增加HSV-1 gD的表达(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa)和病毒滴度(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB)分别约2.0倍。这些数据表明，下调Nrf2的表达有效地下调了细胞的抗氧化能力，Nrf2- are通路在抵御病毒感染中起着至关重要的作用。gydF4y2Ba

氧化应激最近已被确定干扰HSV-1的感染[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．ROS生成和抗氧化防御系统之间的不平衡参与维持细胞内稳态和病毒感染过程[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．Nrf2是通过调节下游细胞抗氧化反应来应对抗氧化剂氧化应激的关键转录因子之一[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．然而，Nrf2在HSV-1感染中的作用尚不清楚。在这项研究中，我们研究了Nrf2与HSV-1复制之间的相互作用。gydF4y2Ba

在本研究中，我们的数据显示(i) HSV-1感染引发氧化应激。(ii) Nrf2在HSV-1感染早期(12 hpi)被激活。(iii)上调Nrf2抑制HSV-1复制，沉默Nrf2促进病毒感染。(iv) Nrf2-ARE通路调控炎症基因表达和HSV-1增殖。gydF4y2Ba

我们发现HSV-1感染后Nrf2的短暂上调(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab和1c)，在卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)和登革病毒感染中也得到证实[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．据报道，病毒感染引起的Nrf2降解受keap1依赖或keap1不依赖的泛素-蛋白酶体途径调控[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．牛疱疹病毒型感染通过依赖keap1的泛素蛋白酶体途径刺激Nrf2降解[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．然而，登革病毒利用NS2B3蛋白酶复合物战略性地靶向Nrf2进行降解[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在我们的研究中，Nrf2在24 hpi时被抑制，此时，Keap1仅在MOI为1的病毒感染组上调，而在MOI较高的病毒感染组无明显变化(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).因此，我们推测Nrf2的泛素化降解可能由多种途径引起，具体机制有待进一步研究。gydF4y2Ba

据报道，通过过表达Nrf2或补充Nrf2激活剂上调Nrf2可显著抑制几种病毒的复制[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．tBHQ上调Nrf2使小鼠对小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染不那么敏感[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．与此一致的是，Nrf2的过表达降低了病毒复制、甲型流感核蛋白表达、抗病毒反应和氧化应激[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．在本文中，我们发现HSV-1的繁殖受到Nrf2的调控。Nrf2过表达导致HSV-1感染，病毒蛋白表达和病毒滴度显著降低(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa和b)，而在HSV-1感染前用Nrf2激动剂预处理的细胞显示出对HSV-1复制的轻微抑制(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa和b).原因是去除外源激动剂后Nrf2的激活效应可能会持续很短的时间，激动剂激活的抗氧化酶的表达不如转染Nrf2质粒组高。相反，Nrf2的沉默促进了HSV-1感染(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA和b)。gydF4y2Ba

近年研究表明Nrf2-ARE通路不仅参与氧化应激的调控，还参与炎症和抗病毒反应的调控[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．先前的一项研究表明，HO-1是Nrf2下游的一种抗氧化酶，能够激活抑制流感病毒复制的IFN-α/β [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．IFN-α已被证明通过诱导IFN刺激基因(ISGs)在防御HSV-1感染中至关重要，该基因通过多种不同的机制协同抑制病毒复制[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．在这里，我们发现Nrf2的激活上调了HO-1的表达，HO-1可以激活IFN反应并诱导IFN刺激基因的表达，从而产生有效的抗hsv -1作用(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac和gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).因此，Nrf2激活的抗病毒活性很可能与isg的诱导有关。ROS是激活NF-kB和IRF-3途径以诱导HSV-1感染细胞产生I型IFN所必需的[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，同时Nrf2-ARE通路调节ROS的产生[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．因此，Nrf2介导的抗氧化反应与抗病毒反应之间的相互作用有待进一步研究。gydF4y2Ba

我们的研究表明Nrf2在HSV-1感染早期被激活，并参与调节抗氧化反应。Nrf2过表达或其激动剂上调可抑制HSV-1的复制。相反，Nrf2的沉默促进了病毒的复制。综上所述，Nrf2- are通路不仅参与了氧化应激的调节，还参与了HSV-1感染的炎症调节和抗病毒反应，因此靶向Nrf2通路具有对抗HSV-1感染的潜力。gydF4y2Ba

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。gydF4y2Ba

Nrf2:gydF4y2Ba

核因子e2 -相关因子2gydF4y2Ba

1型单纯疱疹病毒:gydF4y2Ba

单纯疱疹病毒1型gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

HO-1:gydF4y2Ba

血红素oxygenase-1gydF4y2Ba

NQO1:gydF4y2Ba

NAD (P) H醌氧化还原酶gydF4y2Ba

特丁基对苯二酚:gydF4y2Ba

Tert-ButylhydroquinonegydF4y2Ba

干扰素-α:gydF4y2Ba

干扰素αgydF4y2Ba

OAS1:gydF4y2Ba

2'，5'-寡聚腺苷酸合成酶gydF4y2Ba

ISG15:gydF4y2Ba

人类类泛素修饰剂gydF4y2Ba

CPE:gydF4y2Ba

细胞病理效应gydF4y2Ba

TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

50%组织培养感染剂量gydF4y2Ba

作者感谢郑春福教授(福建医科大学，福州，中国)赠送的HSV-1 BAC Luc和Wang Jiao博士提供的nHA-NFE2L2/pRK5表达质粒。gydF4y2Ba

国家科技重点项目(2018ZX10201002)资助。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 张莉(Li Zhang)和王娇(Jiao Wang)对这项研究做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京102206gydF4y2Ba

   张莉，王姣，王湛，李颖，王辉，刘宏图gydF4y2Ba

2. 中国科学院生物安全大科学研究中心，湖北武汉430071gydF4y2Ba

   性病刘gydF4y2Ba

3. 中国疾病预防控制中心-中国科学院武汉病毒研究所新发传染病与生物安全联合研究中心，湖北武汉430071gydF4y2Ba

   性病刘gydF4y2Ba

4. 卫生和计划生育委员会医学病毒学重点实验室，北京102206gydF4y2Ba

   性病刘gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

HL设计了这个项目。ZW负责监督该项目。YL和HW对数据进行了分析。LZ和JW撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba性病刘gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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