eb病毒阳性b细胞的血清型依赖重组腺相关载体(AAV)感染，对局灶性EBV +淋巴增生性疾病的重组AAV治疗

背景

b细胞增殖性疾病，如移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，在t细胞损伤患者中增加。大多数是eb病毒(EBV +)，可首先表现为局灶性病变。直接将溶瘤病毒引入局部肿瘤比化疗、免疫治疗和放射治疗具有理论上的优势，可以降低全身毒性。尽管腺相关病毒作为基因治疗的载体被广泛研究，但由于技术和理论障碍，它很少被应用于人类癌症研究。此外，人类b细胞在历史上被描述为对AAV感染具有抗性。尽管如此，使用具有独特取向的不同重组AAV血清型进行细胞毒治疗的进展表明，局部抗肿瘤方法是可行的。

方法

作为开发治疗载体的前导，通过共聚焦显微镜、流式细胞术和随后的细胞活力测定，评估了15种不同的携带egfp的rAAV血清型转导人b细胞的能力，包括原代、永生化和b细胞肿瘤系±EBV。

结果

秩序分析显示rAAV6.2和密切相关的病毒粒子增强转导。EBV阴性b细胞肿瘤系的EBV感染和原代b细胞的EBV永生化增加了对rAAV6.2转导的易感性。作为概念证明，通过编码单纯疱疹病毒1型(HSV1)胸苷激酶(TK)的rAAV6.2转导可以消除TK阴性横纹肌肉瘤细胞，并在更昔洛韦孵育时降低转导的b细胞系的活力。

结论

rAAV血清型不同地转导人类b细胞系，扭转了人类b细胞对AAV感染难治的教条。EBV + b细胞显示出对rAAV6.2感染的易感性增加，揭示了一种改进核酸转移到抗转染b细胞系的新方法。将一个功能性自杀基因引入rAAV6.2基因组，为针对局灶性ebv携带b淋巴增生性疾病的基于raav的溶瘤治疗的发展确定了一个候选载体。

b细胞增生性疾病，如移植后淋巴增生性疾病(PTLD)和某些b细胞淋巴瘤，在t细胞损伤患者中发生频率增加。这些疾病主要是Epstein-Barr病毒(EBV +)，可首先出现可直接接种治疗药物的局灶性病变[4，7］．靶组织通常包括Waldeyer扁桃体环、移植器官的b细胞相关淋巴组织、孤立性淋巴结和中枢神经系统病变。直接将溶瘤病毒引入局部肿瘤比化疗、免疫治疗和放射治疗具有理论上的优势，因为它降低了免疫受损宿主特别容易受到的全身毒性[8］．

尽管腺相关病毒(AAV)被广泛研究为一种安全的基因治疗载体，但很少被用于治疗癌症[14］．此外，早期研究表明，人类b细胞是AAV的不良靶标[9，16，26］．因此，尽管近年来广泛衍生出具有改变取向的AAV重组体(rAAV)，但对AAV感染人类b细胞肿瘤的了解甚少[5，25］．

与溶瘤病毒不同，重组(r)AAV是非致病性的，不会独立复制也不会整合到宿主细胞DNA中。rAAV基因组最终被消除，降低了无意中扩散到正常细胞的风险。基因，包括基因调节产物，可以被引入AAV基因组[20.］．虽然对aav感染细胞的免疫反应会阻碍基因治疗，但这在短期抗肿瘤治疗中可能是有利的[21]，通常需要ptld相关肿瘤的频谱。

在此，我们检查并比较了15个从编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的特征良好的自互补(sc)rAAV质粒载体衍生的精选重组体的体外能力[16来转导人类b细胞。重点是被EBV感染并永久化的b细胞。血清型的排序分析显示，rAAV6.2转导始终支持EGFP在人b细胞中的表达，并且在携带EBV的b细胞中荧光细胞的百分比最高。当单纯疱疹病毒1型(HSV1)胸苷激酶(TK)被引入rAAV6.2基因组时，暴露于更昔洛韦后，转导的人TK阴性横横肌肉瘤细胞被消除，转导的b细胞肿瘤细胞的活力降低，为开发基于raav的溶瘤治疗提供了支持。这项概念验证研究表明，AAV血清型(如rAAV6.2)优先转导人类EBV + b细胞，并可以支持自杀基因的表达，突出了开发选择性raav介导的局灶性EBV +增生性疾病治疗的潜力。

rAAV病毒粒子来源

15种不同血清型的单一自我互补rAAV-EGFP质粒载体[28]是在马萨诸塞大学医学院Horae基因治疗中心通过衣壳蛋白的差异表达产生的。亲本rAAV-EGFP质粒载体编码由混合CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子驱动的细胞质增强绿色荧光蛋白(EGFP) [27］．转导后，EGFP荧光可以通过显微镜(共聚焦显微镜，流式细胞仪)直接在细胞中可见，蛋白表达可以通过特异性抗体检测(见下文)。15种rAAV血清型中的每一种(表1)在修饰的人HEK293细胞中合成，提取、纯化、分离、分析基因组含量并按所述方法滴定[25］．15种血清型的生产细节可通过Horae基因治疗中心获得。

细胞来源

本研究中使用的b细胞系见表2连同他们的来源。原代b细胞根据NEOB机构审查委员会和马萨诸塞大学医学院的政策，从从新英格兰器官库获得的人类脾脏样本中分离出来。原代B细胞分离采用STEMCELL技术公司EasySep直接人类B细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies)，根据制造商说明书进行负选择。使用单克隆抗体:APC-conjugated anti-CD20 (BioLegend)和FITC-conjugated anti-CD19 (BioLegend)，流式细胞术验证b细胞群纯度大于90%。所有b细胞保存在rmi -1640 (Sigma-Aldrich)中，添加10%热灭活胎牛血清(HyClone)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素(Cellgro)， 37℃，5% CO₂孵化器。

转导程序和共聚焦显微镜

为了比较每种人类b细胞系中15种rAAV血清型的转导效率，以2 × 10的密度将生长到中对数期的细胞种在24孔板中⁵每孔细胞。24小时后，细胞以MOI为10的rAAV血清型转导⁵．感染48小时后，ZEISS LSM 700共聚焦显微镜捕捉EGFP表达介导的荧光。

转导程序和流式细胞术

b细胞来自所描述的每个来源(表2)生长到中对数相，然后镀(3 × 10⁵细胞/孔)在24孔板。然后以MOI为10的15种rAAV血清型中的每一种转导细胞⁵在重复三次的独立实验中，n = 3。感染48小时后，收集细胞，PBS清洗，2%多聚甲醛固定，并在LSRII流式细胞仪上进行流式细胞术分析(BD Biosciences)。BD FACSDiva™软件(BD Biosciences)用于量化荧光(egfp表达)细胞的百分比。

编码HSV1-TK的rAAV6.2的合成与生产

基于raav的编码EGFP-HSV1-TK和单独编码HSV1-TK的质粒由Gene Universal (Newark, Delaware)合成。各基因组如图所示。4a.插入物(EGFP-HSV1-TK和HSV1-TK)的来源已在前面描述过[6］．每个基因组被封装以产生rAAV6.2血清型，并如上所述在Horae基因治疗中心进行转导实验。

143BTK-人横纹肌肉瘤细胞系，缺乏人TK-1表达(ATCC)，被预先选择为溴脱氧尿苷耐药。细胞保存在DMEM (Corning)中，添加10%热灭活胎牛血清(HyClone)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素(Cellgro)， 37℃，5% CO₂孵化器。143BTK细胞经上述rAAV6.2- egfp -HSV1-TK或rAAV6.2 HSV1-TK共聚焦分析b细胞系。

免疫印迹检测转导细胞中HSV1-TK蛋白的表达

选择生长到中对数期的b细胞株，以2 × 10的密度在24孔板中播种⁵每孔细胞。24小时后，细胞以MOI为10的rAAV6.2血清型编码HSV1-TK转导⁵．转导48小时后，收集细胞，在RIPA缓冲液中裂解，并用Bradford法定量。用NuPAGE Bis-Tris(4-12%)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Thermo Fisher Scientific)在MOPS缓冲液中还原条件下分离总细胞蛋白(20µg / lane)。将蛋白质转移到硝化纤维膜上，在TBST中用5%脱脂牛奶阻断1小时，然后进行抗体孵育，清洗5次膜，最后使用ECL化学发光检测试剂盒Clarity Max Western ECL Substrate (Bio-Rad)进行检测。

一抗兔多克隆抗- hsv1 - tk由耶鲁大学William Summers博士慷慨提供。最终检测采用hrp标记山羊抗兔二抗(Santa Cruz Biotechnology)。

一抗小鼠抗egfp和小鼠抗gapdh来自Santa Cruz Biotechnology公司，酶标山羊抗小鼠IgG二抗用于化学发光检测。

HSV1‐TK‐转导细胞对GCV的敏感性

用ZEISS LSM 700共聚焦显微镜采集143BTK-细胞经rAAV6.2 HSV1-TK或EGFP-HSV1-TK转导后的共聚焦图像。使用ZEN lite软件分析图片。所有图片均在相同的放大倍率(比例尺= 50 μm)下拍摄。用10 μM更昔洛韦孵育前和孵育后72 h分别采集图像。更昔洛韦显示的浓度是在先前的实验中通过剂量-反应曲线确定的。

更昔洛韦孵育rAAV6.2 HSV1-TK转导b细胞的MTT活力分析

选择b细胞株(2 × 10⁵细胞/ml)在96孔微孔板中37℃培养24 h。用rAAV6.2-HSV1-TK转染细胞48 h，用10 μM GCV或安慰剂(无GCV)孵育细胞3 d。显微镜观察后，将20微升MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)溶液(5mg /ml)加入每孔，与细胞一起孵育4小时。加40 μl DMSO使积累的甲马赞产物增溶。在570 nm处测定了反应产物的光学吸收。通过测量处理细胞的平均吸光度比未处理细胞的平均吸光度来计算存活细胞的百分比。未经处理的细胞100%存活。结果用平均值±标准差表示(n = 3)。

统计分析

使用GraphPad Prism 8软件(GraphPad, San Diego, CA)对流式细胞术产生的荧光数据进行统计分析。因为条件内的变化很小，我们假设所有数据都服从正态分布。来自独立实验的数值报告为平均值±标准差。

伦理批准

本研究是根据NEOB机构审查委员会和马萨诸塞大学医学院(irb# H00004283)的政策进行的。

检测十种人b细胞系±EBV感染15种不同的重组自我互补腺相关病毒载体

尽管原代人类b细胞被描述为创始AAV载体的不良靶标[17]，对于它们对显示出新取向的rAAV血清型感染的易感性知之甚少。人类b细胞肿瘤系对rAAV血清型谱的易感性更是鲜为人知。为了研究rAAV载体介导抗肿瘤治疗的潜力，15种不同的rAAV候选基因[25对编码的EGFP进行分析(表1)，因为它们能够感染10种人类b细胞系。这些细胞系包括2株EBV-， 5株EBV + Burkitt淋巴瘤细胞系，2株EBV永生化淋巴母细胞(LCLs)，以及原代b细胞(表2)2)．

滴度正常化后(10⁵基因组拷贝数/ml)，表中列出的每一种rAAV血清型1被独立转导到所研究的每种人类b细胞来源(表2)．EGFP荧光在各自细胞靶标中的检测最初通过共聚焦显微镜进行评估(图。1)．尽管观察到与起源rAAV载体以及靶b细胞相关的荧光变化(图。1)，总的来说，无论细胞系来源如何，rAAV6.2血清型导致表达EGFP的b细胞比例最高。类似的荧光模式在与6.2最密切相关的血清型(AAV6, AAV6TM, AAV2)中被注意到，如图右缘的垂直红线所示。1．

肿瘤和永生化b细胞比原代b细胞更容易受到rAAV6.2转导的影响

为了定量原代细胞中EGFP荧光百分比与永生化细胞系和肿瘤细胞系相比，并更精确地确定EBV感染是否改变了EGFP检测，接下来使用流式细胞术进行转导研究进行分析(图。2f)。无论转导的rAAV血清型如何，原代b细胞中的EGFP荧光都是最小的，这与先前的报道一致，即创始AAV载体不感染正常的人类b细胞(图2)。2a).原代细胞感染EBV 48小时后检测到EGFP适度增加(1-10%)(图。2b).在转导rAAV6.2和密切相关的血清型后，EBV不朽细胞系B95-8原型细胞的荧光增加到~ 50%(图。2c).三种自然发生的EBV +伯基特淋巴瘤株系的感染显示，每一株系均表达EGFP，其中rAAV6.2感染株系产生EGFP的细胞比例最高。然而，rAAV6.2转导Raji后荧光细胞的百分比为60-80%(图2)。2d)和P3HR1(图;2e)，只有~ 7%的细胞在Daudi中显示出可检测到的EGFP(图。2f).从先前的DNA序列分析(NCBI)可知，这些EBV +肿瘤系中的每一个都包含相对于原型B95-8基因组的不同缺失和突变。特别是Daudi的克隆，已被证明在EBV主要蛋白LMP1的表达上存在差异[11］．由于EBV产品促进受感染细胞的特定表型变化[2]，对各自基因组的比较分析可能揭示与高效rAAV6.2转导相关的b细胞修饰，如下所述。

EBV阴性Burkitt肿瘤系的“重复感染”增加了rAAV6.2的易感性

为了进一步研究EBV感染是否促进了rAAV6.2的b细胞转导，两种EBV阴性的伯基特淋巴瘤系BL41和Ramos稳定地“重复感染”了EBV B95-8株，分别转导了表中描述的15种raav中的每一种1．已知重复感染B95-8原型病毒可引起ebv阴性Burkitt系的表型变化。事实上，BL41/B95-8先前被证明显示了原代b细胞抗原激活时发生的典型表型变化[2］．在转导rAAV6.2(及相关血清型)后，与BL41/B95-8相比，BL41中荧光细胞的百分比从不足10%增加到大于50%(图2)。3.一个,b)．AAV6.2感染Ramos/B95-8后，EGFP表达同样升高(图2)。3.c,d)，尽管差异小于bl41衍生系。

编码HSV1-TK的rAAV6.2经更昔洛韦孵育后被清除

EBV PTLD的治疗通常涉及暴露于系统性药物，这些药物可能危及移植受者的生存，即使PTLD表现为局部生长，也是必需的。因此，需要精确的方法。细胞中HSV1-TK的表达特异性地将核苷类似物更昔洛韦转化为三磷酸更昔洛韦，促进核苷酸并入细胞DNA和细胞凋亡[12］．三磷酸更昔洛韦随后释放到肿瘤微环境中，通过积极增殖邻近肿瘤细胞导致旁观者杀伤，从而导致优先摄取[19］．这些结果表明，直接注射rAAV血清型，如rAAV6.2携带HSV1-TK，可能有助于消除b细胞肿瘤细胞[18]形成病变。虽然HSV1-TK能有效磷酸化更昔洛韦，但在快速生长的肿瘤细胞中被激活的核苷激酶也能磷酸化更昔洛韦，尽管程度较低。首先，为了证实rAAV6.2编码HSV1-TK消除转导肿瘤细胞的能力，原型TK阴性人横纹肌肉瘤细胞系，143B TK- [22]，然后评估b细胞系±EBV的子集对更昔洛韦的反应。这是通过一系列实验实现的，包括修改rAAV6.2基因组以表达融合的EGFP-HSV1-TK(图2)。4a，左侧)或单独使用HSV1-TK(图。4A，右边)。通过免疫印迹法检测转导细胞中的EGFP-HSV1-TK和HSV1-TK蛋白来证明感染。4b)在更昔洛韦存在的情况下，选择性地消除转导的HSV1-TK表达细胞。

图中显示了修饰后表达EGFP-HSV1-TK或单独表达HSV1-TK的rAAV6.2基因组的图解。4a.转导细胞株的免疫印迹证实EGFP和HSV1-TK共同表达，以及HSV1-TK唯一表达(图。4b).值得注意的是，在无花果中显示出最高百分比的EGFP荧光的细胞系之间存在定量相关性。1而且2和HSV1-TK蛋白检测最多的两组(图。4B)，强调血清型转导的可重复性。共焦分析(图4c)证明AAV6.2 EGFP-HSV1-TK转导的143B TK阴性细胞孵育(左面板)或AAV6.2 HSV1-TK (右面板更昔洛韦(ganciclovir)可消除大部分143B tk表达细胞，证实了HSV1-TK的功能。AAV6.2 HSV1-TK转导到用更昔洛韦孵育的有代表性的b细胞系中同样会导致细胞活力的丧失，通过四氮唑染料MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四溴化铵(MTT)试验测量(图5)。4d). MTT检测EBV±b细胞群存活率的相对损失(图;4d)与rAAV6.2 EGFP转导后荧光细胞的百分比呈负相关(图。1而且2)，再次强调了由rAAV6.2介导的转导的可重复性。

成功的血液学和实体器官移植最具毁灭性的后果之一是PTLD的发展。PTLD是移植外来细胞所需的t细胞抑制的结果，主要导致携带ebv的b细胞不受控制地生长，从正常的活化淋巴细胞到侵袭性克隆b细胞恶性肿瘤。患有其他原因的t细胞缺陷(医源性、艾滋病、先天性疾病)的人患这些ebv相关疾病的风险也会增加。PTLD很少表现为EBV + t细胞增生或EBV +平滑肌肉瘤。虽然积极的手术、化疗、免疫治疗和放射治疗可以不同程度地控制疾病，但已经严重免疫抑制的人对治疗的耐受性往往很差。PTLD可能起源于Waldeyer环的局部生长，特别是在原发感染后，b细胞相关的异体移植物浸润，或孤立的淋巴结或中枢神经系统病变。精确针对个别病变的集中治疗可以显著降低基于治疗的发病率和死亡率。

原发性EBV感染的严重表现之一是急性传染性单核细胞增多症(AIM)并发气道阻塞。这是由于Waldeyer 's环附近淋巴细胞大量增殖引起的。大剂量的类固醇治疗，虽然通常有效，但不仅消除了EBV + b细胞，还消除了解决感染所需的其他免疫细胞，因此造成了一个临床难题。rAAV给药提高了集中有效治疗的前景。

AAV作为一种治疗方式主要与基因替代有关。近年来，多项创新影响了病毒基因组的结构和内容，通过衣壳突变改变和重新定向趋向性的能力，以及利用新技术增强制造[25引发了人们对将raav应用于精确癌症治疗的兴趣——系统和靶向治疗[14］．由于最初的研究表明人类b细胞对AAV感染不敏感，因此很少有与b细胞起源的癌症相关的公开信息。然而，目前的创新表明，将新的rAAV变体应用于b细胞肿瘤的治疗，重点是可直接引入相对少量病毒的局灶性病变，将是有价值的。

目前的概念验证分析结果显示，在评估的15种rAAV血清型中，基于衣壳序列，rAAV6.2和与6.2密切相关的rAAV6、rAAV6TM是病毒转导效率最高的rAAV血清型。所有15个候选rAAV都包含相同的egfp编码基因组，这意味着差异封装可能是改变转导效率的来源。尽管通过rAAV6.2转导的细胞百分比在不同的b细胞源之间有所不同，但转导效率在不同的试验中具有高度的可重复性，甚至当基因组内容因引入HSV1-TK而改变时也是如此。原代b细胞被所有15种rAAV血清型最低限度地转导，尽管在比较的基础上rAAV6.2是最有效的。这一结果与以前的观察结果完全一致，即原代b细胞不是AAV转导的可行靶点。相比之下，包含完整EBV基因组的b细胞是最有效转导的细胞之一。原型EBV B95-8病毒感染原代b细胞和EBV阴性细胞系一致增加了它们对rAAV6.2转导的易感性。

除了证明rAAV6.2作为一种治疗方法的实用性外，这些发现还强调了这种rAAV血清型将核酸引入难以转染的人类b细胞肿瘤系以揭示致癌机制的潜力。每个相应的细胞系的转染效率的优化都可以单独实现。

潜伏周期ebv编码蛋白，潜伏膜蛋白LMP-1和LMP-2，在b细胞激活两种主要途径后介导b细胞转化，一种是通过CD40和IL-4模拟t细胞刺激b细胞(LMP-1)，另一种是通过模拟IgM受体信号(LMP-2) [3.，10］．因此，在原发静止b细胞上低水平存在的许多b细胞表面抗原被上调或暴露，潜在地增加了rAAV6.2的获取。虽然数量有限，但两个小组的研究证实了相关的激活事件是关键的假设。Hallek实验室(2002-2004)使用rAAV2转导B-CLL细胞进行的一系列实验表明，将这些细胞与复合CD40L、抗igm(以及在较小程度上与CpG寡核苷酸)预培养，可增强rAAV2转导[26］．与这些观察结果一致，2018年，Hung等人用由CD40L三聚体、CpG和白介素- 2,10,15增强rAAV6转导组成的“b细胞激活鸡尾酒”培养原代人b细胞[9］．Hung等人对编码EGFP的8种rAAVs (rAAV1、2、2.5、5、6、8、9、D-J)进行了比较分析，结果显示rAAV6转导了40%的细胞，rAAV2转导了30%，其他均< 10%。综上所述，这些不同的观察结果强调了CD40信号在调节raav6.2介导的b细胞转导中的关键作用(尽管其他激活信号也可能起作用)。CD40结扎增强这些血清型后续转导的确切机制尚不清楚。在衣壳特异性的基础上，建议调节特定的b细胞表面受体(上调，通路改变)或可能的细胞内转运途径。

这对衣壳特异性意味着什么?衣壳序列变异通常发生在高变区外表面，高变区约占总蛋白质的19%，并决定向性[24］．虽然趋向性主要反映附着在细胞受体上，但它也可能包括影响细胞内衣壳稳定性、转运和核传递的进入后事件。虽然rAAV6.2转导是最有效的，但密切相关的血清型rAAV6和rAAV6TM衣壳(分支A)也有效。AAV6.2血清型是通过将AAV6 VP1蛋白129位的苯丙氨酸(F)残基突变为亮氨酸(L)而产生的，也被发现可以增加其他人类细胞类型的转导，如人类气道上皮[15］．迄今为止，增强转导的确切机制尚不清楚。rAVV6TM (TM =三重突变体)衣壳包含三个突变Y731F/Y705F/T492V，可以去除磷酸化依赖的蛋白酶体降解中涉及的残基，磷酸化依赖的蛋白酶体降解是一种可能阻碍核传递的事件[23］．然而，6TM突变的衣壳在人b细胞转导中并不更有效。与以前的研究相似，rAAV2(分支B)在人类B细胞转导效率中排名第二，尽管其机制仍未解决。

将HSV1-TK整合到rAAV6.2载体基因组中，并成功证明其转导后的活性，为探索其他自杀效应因子以及选择EBV启动子/增强子元件(如EBV核抗原-1,EBNA-1)铺平了道路，这些元件以保证仅在靶向EBV + b细胞肿瘤中表达的方式驱动自杀效应因子[13］．观察到原发静止b细胞没有转导是一个优点。然而，由于rAAV6.2已被证明转导其他人类细胞，包括某些癌症，临床转译将需要选择性向性的证明。因此，有必要对rAAV6.2衣壳进行进一步的突变分析，以确定赋予选择性取向的氨基酸替换。rAAV6衣壳高变区单例突变文库可用于初步筛选[24]，但可能需要多次交换。一种结合载体和衣壳改变来创造高选择性rAAV6.2变体的方法有可能改变局部EBV疾病的治疗。

虽然在啮齿动物中开发合适的局灶性EBV疾病体内模型将证实这些结果(尽管有关于EBV-啮齿动物模型的警告)[1]，观察到多种小鼠细胞类型易受rAAV6.2的影响[23使这种努力在目前行不通。如上所述，需要开发一种高度ebv特异性启动子，能够激活自杀基因或衣壳突变，从而产生精细的细胞特异性。

人类b细胞不能被AAV转导的教条被推翻了。特定的raav能够转导人类b细胞，特别是当以肿瘤细胞系的形式被激活时。EBV感染b细胞增加了对特定raav转导的易感性。在本研究检测的15种血清型中，rAAV6.2表现出最大的转导效率，建立了rAAV6.2及相关血清型在通常难以转染的人类b细胞系转导中的效用。自杀基因(HSV1-TK)表达的载体支持和随后细胞杀伤的演示为raav的开发提供了初步的基础，由于其独特的性质，可以根除局灶性PTLD和相关病变，限制了对毒性治疗的需求。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者和第一作者处获得。

PTLD:

移植后淋巴增生性疾病

AAV:

腺相关病毒

rAAV:

重组腺相关病毒

scAAV:

自体互补腺相关病毒

EBV:

巴尔病毒

HSV1:

单纯疱疹病毒1型

TK:

胸苷激酶

即时通讯:

传染性单核细胞增多

EBNA-1:

eb病毒核抗原1

LMP-1:

潜伏膜蛋白-1

LMP-2:

潜伏膜蛋白-2

中枢神经系统:

中枢神经系统

EGFP:

增强型绿色荧光蛋白

拼箱:

淋巴母细胞系

我们感谢William Summers教授(耶鲁大学)提供兔子抗hsv1 TK抗体。我们感谢Melanie Trombly博士的行政协助(马萨诸塞大学医学院)。

这项研究得到了马萨诸塞大学医学院传染病与免疫学学部、马萨诸塞大学医学院Horae基因治疗中心、伊朗德黑兰Tarbiat Modares大学医学院和预防癌症基金会提供的试剂和专业知识的支持。

作者及隶属关系

1. Tarbiat Modares大学医学院病毒学系，伊朗德黑兰邮政信箱14155-331

   Elham Ahmadi & Mehrdad Ravanshad

2. 美国马萨诸塞州伍斯特市种植园街364号，马萨诸塞州01605，马萨诸塞大学医学院医学系传染病与免疫科

   Elham Ahmadi, Rajesh Panigrahi, Sandeep S. Jubbal & Joyce Fingeroth

3. Horae基因治疗中心，马萨诸塞大学医学院，364种植园街，伍斯特，马萨诸塞州，01605，美国

   谢军，高广平

4. 美国马萨诸塞州伍斯特市种植园街364号，马萨诸塞州01605，马萨诸塞大学医学院分子、细胞和癌症生物学系

   Santosh Kumar Guru

5. Alborzi临床微生物研究中心，设拉子医科大学Namazi医院，设拉子，伊朗

   Mazyar Ziyaeyan

贡献

E.A.设计并进行实验，获取并分析数据，撰写论文。mr构思了研究设计，监督了项目，讨论并审阅了手稿。J.F.指导了整个项目，构思了策略，监督了研究，并撰写、审查和编辑了手稿。J.X.和G.G.提供了材料、试剂、分析工具和策略，讨论并审阅了手稿。M.Z.讨论了结果和结论，并审阅了手稿。r.p.、S.S.J和s.k.g设计并进行了实验并审阅了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到人士Ravanshad或乔伊斯Fingeroth．

伦理批准并同意参与

同意用于研究的正常丢弃的和未鉴定的人脾b淋巴细胞来自新英格兰器官银行。这些组织是根据新英格兰器官库机构审查委员会(IRB)和马萨诸塞大学医学中心的政策根据IRB批准的方案获得的(H00004283, Fingeroth博士)。UMMS IRB认为，使用NEOB丢弃和去识别的人类细胞进行的工作不是人类研究，NEOB批准了这一区分。

发表同意书

不适用，本手稿不包含任何可识别的患者信息，需要同意。所有人类细胞系都是从NEOB中分离和丢弃的细胞或从商业供应商获得的。

相互竞争的利益

作者声明他们对这项工作没有竞争利益。

出版商的注意

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