大象嗜内皮性疱疹病毒出血性疾病(EEHV HD)是亚洲、北美和欧洲圈养亚洲象幼崽死亡的主要原因，在人类照顾下的幼崽死亡率约为65%。尽管EEHV HD最初是在大象营地中发现的，但最近在野生大象种群中发现了它，这对大象种群构成了更大的威胁。在野生大象中发现过EEHV HD导致的死亡，但当地的流行率和死亡率尚不清楚。我们报告了马来西亚首例EEHV HD病例，来自沙巴的3头野生出生的濒危婆罗洲象幼崽具有已知的典型临床症状。
第一只小牛在出现临床症状后24小时内死亡;第二头小牛在出现临床症状后12小时内死亡。第三头小牛在72小时内死亡。尸检显示，所有3头小牛都有相似的EEHV HD表现，但第三头小牛的严重程度较轻。我们进行了常规聚合酶链式反应(cPCR)检测，在3头犊牛的7个位点均发现了EEHV DNA;它被确定为EEHV1A，在大多数其他报告的病例中都发现了这种病毒类型。
典型的EEHV HD临床症状以及通过cPCR和测序对EEHV的分子确认指向EEHV为死亡原因。该菌株的进一步遗传研究正在进行中。
大象嗜内皮性疱疹病毒(EEHV)是第一个也是迄今为止唯一描述的在大象中引起严重疾病并具有明显形态变化的疱疹病毒[1]并导致受感染者的死亡率达85% [2，3.］．继一份新颖的EEHV报告后[2]，在全球范围内发现了100多起类似病例。圈养出生的幼年亚洲象(Elephas马克西姆斯)在大部分确诊个案中均受到影响[4，5］．在过去的20年里，这种疾病在欧洲和北美人类护理的3个月至15岁的年轻亚洲象中造成了65%的死亡率[3.］．此外，在亚洲地方性野生和圈养种群中，EEHV出血热病例的报告越来越多[3.，6，7，8，9］．
大多数与影响亚洲象的全身性内皮溶解性疾病有关的EEHV病例属于EEHV1组(EEHV1A和EEHV1B)，尽管在亚洲象中也有几例因EEHV4和EEHV5而发病和死亡的病例[10，11，12，13，14］．历史上有两只非洲象死于EEHV2病毒(非洲象)及因EEHV6而死亡的个案，[4，15]以及EEHV3B的幸存者[16]及EEHV6 [13］．自2019年以来，有3例死亡，5例EEHV HD幸存者，5例几乎没有临床/亚临床的EEHV，都是由于EEHV3A或EEHV3B，还有一例死于EEHV2和似乎控制良好的EEHV6病毒血症[17,Latimer E，个人交流]。虽然EEHV的传播机制尚未完全了解，但在躯干分泌物和其他体液中发现了病毒DNA，据信与传播有关[18］．
感染eehv的大象急性发作时表现为嗜睡、头部和四肢全身性水肿、口腔溃疡、舌发绀、心动过速，1-7天后死亡。淋巴细胞减少和血小板减少在血液评估中很常见。越来越多的报道称，大象通过抗病毒药物、液体、血小板和免疫兴奋剂等治疗，在EEHV HD中幸存下来[4，17，19，20.，21，22，23］．心包积液、肠出血和粘膜溃疡是常见的尸检结果。EEHV的靶组织包括心脏、舌头、肝脏和大肠。组织学检查通常显示这些器官有微出血、水肿和炎症。病变可伴有毛细血管内皮细胞核内疱疹病毒包体[1］．
此前在马来西亚或婆罗洲象(婆罗洲岛上的亚洲象亚种，主要分布在马来西亚东部的沙巴州)没有关于EEHV感染的报道。婆罗洲的大象,大冰原象，是亚洲象的四个不同亚种之一。由于栖息地丧失，根据国际自然保护联盟(IUCN)的濒危物种红色名单，它们被列为濒危物种。最近，该物种还受到非法狩猎、投毒和试图保护作物的人袭击的威胁。沙巴州有24头大象在人类的照顾下，分别位于塞比洛猩猩康复中心(Sandakan, SORC)、婆罗洲大象保护区(Kinabatangan)和Lok Kawi野生动物园(Kota kinababalu)。该州的野生种群估计有2000只[24］．
关于这些大象的起源有两种假说——它们要么是从苏鲁传入婆罗洲的，要么是从苏鲁传入婆罗洲的。25]或苏门答腊和马来西亚半岛，或原产于婆罗洲，但起源于圣代语系[26］．线粒体DNA差异的遗传学研究支持后一种假设[26，27］．在野外，它们可以在马来西亚沙巴州婆罗洲的北部和东北部，以及印度尼西亚加里曼丹的Sembakung河上游找到。[28］．随着许多猖獗的威胁，包括EEHV HD，低种群数量和物种在栖息地范围和基因组成方面的独特性，该物种的保护和健康对于确保这一标志性物种在野外和人类护理中的生存至关重要。
首次发生在SORC的EEHV感染发生在24个月大冰片e.m.b arneensis小腿(表1)．给予对症治疗(泼尼松龙1 mg/kg, papase，土霉素20 mg/kg，静脉输液治疗)。犊牛在出现临床症状后24小时内死亡。超过1l的血浆液心外膜液(图。1D)从心包取出。小腿有面部肿胀(图。1A). 6-12小时后肿胀加重，观察舌尖变色(图。1B).尸检显示明显的面部和躯干水肿，舌部青色肿胀。全身性皮下穿刺(图。1C)观察中度皮下水肿。心脏严重出血明显，从心外膜延伸至心肌和乳头状肌肉组织(图2)。1E).观察到包括肠系膜在内的胃肠道广泛出血和水肿(图。1F)，肝脏肿大，有轻度瘀点。
EEHV的尸检结果。一个第一例舌紫，面部及躯干明显水肿。B第二例因内出血导致舌头变色(第一例也有)。C3例均见弥漫性皮下穿刺。D第一例有心包积液，但三例均有。E心脏的第一例，严重的心脏出血。F3例均出现胃肠道全身性出血
在第一只小象死亡后，SORC的所有其他大象都服用了19毫克/公斤的阿昔洛韦，20毫克/公斤的土霉素，维生素C和初椰子油补充剂。第二例EEHV病例发生在8天后的另一只24个月大的小牛身上(表2)1)．立即进行静脉输液治疗，但小牛在不到12小时后死亡。第三例死亡发生在3天后，是一只36个月大的小牛(表2)1)．给予如上所述的治疗。小牛在强化液体治疗(直肠和静脉注射)后的第二天恢复了对牛奶和固体食物的胃口。然而，第二天早上，牛犊停止进食，几个小时后死亡。
第二头死牛犊的尸检结果与第一头相似。第三头牛犊的尸检结果与前两头牛犊相似，但严重程度较轻。在所有病例中观察到迟钝、食欲不振和嗜睡。而舌头发紫肿胀，面部和躯干水肿仅见于前两只犊牛。3头犊牛均未观察到囊泡和口腔溃疡。
从这三只死牛犊身上采集了器官样本大肠杆菌培养及组织病理学检查。最后两头死去的小象和来自SORC的五头明显健康的大象的血液样本(表2)1)在沙巴州哥打基纳巴卢的野生动物健康、遗传和法医实验室(WHGFL)进行储存和测试，这是一家经过认证的生物安全2级实验室，应沙巴州野生动物部门的要求，并得到沙巴州生物多样性中心的批准(SaBC许可证号码:JKM/MBS.1000-2/2JLD.5)。使用QIAamp血液和组织迷你试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从这些样本中提取DNA。为了立即诊断，使用共识对提取的疱疹病毒DNA进行常规PCR扩增[29，30.]和EEHV pcr [4，13)(表2)．为了对这些位点的变异进行进一步的遗传学研究，所有血液和器官样本在WHGFL上用pcr重新筛选保守基因位点- u60 (TERex3)、U71(gM)和U77(HEL)以及高变基因位点- u48.5 (TK)、U48(gH-TK)、U51(vGPCR1)和E54(vOX2-1) [Hayward G，未发表数据。31)(表3.)．由于第一只死小牛的血清和全血无法获得，因此未对该动物进行初步共识和EEHV pcr。相反，这些器官样本被用于后续的EEHV pcr。
电泳琼脂糖上正确大小的PCR产物使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)进行切割和纯化。纯化产物使用相应的特异性引物进行测序。使用genous 10.1.3软件(Auckland, New Zealand)分析核苷酸序列，并使用Basic Local Alignment Search Tool (BLAST;国家生物技术信息中心)。使用genous Prime 2021.1.1软件(Auckland, New Zealand)将最初EEHV PCR中的清洗序列与17条发表的EEHV DNA聚合酶序列进行比对。成本矩阵:单位，表4)．使用geneous Prime 2021.1.1软件(Auckland, New Zealand) geneous tree Builder构建系统发育树，使用Jukes-Cantor遗传距离模型和1000个自举复制(图2)。2)．
2头死牛和1头活牛EEHV DNA聚合酶的系统发育树。OK635292、OK635293、OK635294、OK635295);JX011009.1, JX011010.1, JX011011.1, JX011015.1, KT832467.1)，肯尼亚KT832491.1)，泰国KT390753.1, KT390754.1, KT390755.1, KT447199.1, KT447204.1, KR812388.1)，印度(加入号:JX011035.1、JX011036.1、JX011037.1、JX011038.1)、老挝(加入号:JX011035.1;KJ400033.1)。WB2型第二次采集的全血年代血清,S2第二次采集血清
组织病理学检查显示，3头小牛的器官中包涵体不明显，但组织病理学病变提示第一头小牛为肠炎，第二头和第三头小牛为病毒感染。使用共识终止酶和聚合酶疱疹病毒，聚合酶特异性EEHV 3/4和EEHV终止酶PCR检测，所有测试样本中均未检测到疱疹病毒。在SORC使用聚合酶pan EEHV PCR检测筛选的7个个体中，3个个体(第二头和第三头死牛犊和5头健康动物中的1头)被确认为EEHV序列，与EEHV 1A和1B(北美分离株)和象皮疱疹病毒1 DNA聚合酶的序列相同91-93%。系统发育分析表明，3头牛的序列与最初的EEHV PCR检测结果完全一致，与来自老挝的EEHV 1A基因的亲和度更高。KJ400033.1)比其他序列用于比较。对第一只死牛犊的EEHV检测得到了后续pcr序列的证实。后续遗传调查结果的详细分析将在后续手稿中提出。
这是婆罗洲大象中首次报告的EEHV HD病例(大冰片象)．然而，马来西亚缺乏以前的报告并不一定表明EEHV HD发病率低。最初，EEHV被假设为一种新型病毒，通过接触圈养的非洲象而传播给亚洲象[2］．然而在2012年，亚洲象被证明是宿主，并在野生印度象中检测到[3.]以及随后在亚洲野生象和营地象中检测到的其他EEHV [9，31］．我们的病例支持后者，因为受感染的动物之前没有与非洲象接触过。
牛群成员的脱落可能是脆弱小牛的感染源;SORC爆发的来源尚不清楚。EEHV可能是由两头最小的小牛脱落的，它们的年龄不到12个月，在疫情爆发4个月前获救，它们可能仍然受到母体抗体的保护。死亡的小牛年龄超过24个月;没有年轻的小牛表现出任何临床症状，尽管在其中一只小牛身上检测到EEHV。这与其他24个月以上的死亡病例一致[4，10]，母体抗体通常在24个月大时减弱，这就解释了稍大的小牛死亡率较高的原因[32］．
大多数致命的EEHV HD病例是幼年亚洲象，年龄在12至84个月之间，通常在首次发现临床症状后24小时内死亡[2，10］．头两头犊牛的病程为急性期，均在出现临床症状后不到24小时内死亡，第三头犊牛在72小时后死亡。病毒血症可在出现临床症状前几天发生，此时已出现严重的血管病变[10］．尽管如此，饲养员仍应接受培训，以识别疾病的迹象。立即服用抗病毒药物可能会防止进一步的血管损伤，但其疗效尚不清楚，需要更多的研究[23，33］．对症治疗方案，包括强化液体治疗、抗炎药、肠外抗生素和维生素，对于减少或停止初始血管损伤的影响仍然至关重要[33］．在给大象食用的初榨椰子油中发现的月桂酸具有抗病毒的功效[34]对EEHV HD的治疗效果尚无定论，因为我们无法区分药物治疗和补充剂的效果。在疫情爆发时，关于成功治疗的信息有限，随后发表了新的治疗指南[19，20.，21，22，23]为未来疫情爆发提供有用的指导。
由于这是我们第一次在大象中发现EEHV，因此确定流行程度、脱落模式和疾病持续时间很重要。此外，早期PCR检测对于临床前病毒血症检测至关重要;常规筛查可作为早期预警系统，为大象中心更好地管理即将爆发的EEHV疫情做好准备。暴发事件后的PCR监测也至关重要。这些方法可以帮助我们了解EEHV HD，以降低野生和圈养大象的发病率和死亡率，这些大象已经因为栖息地丧失和与人类冲突的增加而濒临灭绝。
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。
大象嗜内皮性疱疹病毒出血性疾病
常规聚合酶链式反应
国际自然保护联盟
沙巴州山打根市西碧洛猩猩康复中心
野生动物健康、遗传和法医实验室，哥打基纳巴卢，沙巴州
沙巴生物多样性中心
基本的本地对齐搜索工具
Richman LK, Montali RJ, Cambre RC, Schmitt D, Hardy D, Hildbrandt T，等。一种新发现的由嗜内皮性疱疹病毒引起的大象疾病的临床和病理结果。中华动物医学杂志，2000;36(1):1 - 12。https://doi.org/10.7589/0090-3558-36.1.1．
Richman LK, Montali RJ, Garber RL, Kennedy MA, Lehnhardt J, Hildebrandt T, Schmitt D, Hardy D, Alcendor DJ, Hayward GS。对亚洲象和非洲象致命的新型嗜内皮性疱疹病毒。科学。1999;283:1171-6。
Zachariah A, Zong JC, Long SY, Latimer EM, Heaggans SY, Richman LK，等。印度南部野生和孤儿亚洲象的致命疱疹病毒出血性疾病。J Wildl, 2013; 49:381-93。
Garner MM, Helmick K, Ochsenreiter J, Richman LK, Latimer E, Wise AG, Maes RK, Klupel M, Nordhausen RW, Zong JC，等。两头亚洲象因嗜内皮性疱疹病毒新变异而致死性疾病的临床病理特征(Elephas马克西姆斯)．兽医病理学，2009;46:97-104。
龙SY，拉蒂默EM，海沃德GS。大象嗜内皮性疱疹病毒与急性出血性疾病的研究进展。中华医学杂志，2016;56(3):283-96。https://doi.org/10.1093/ilar/ilv041．
里德CE，希尔德布兰特TB，马克思N，亨特M, Thy N，雷恩斯JM，等。嗜内皮性大象疱疹病毒感染。亚洲首例经pcr确诊的死亡病例。兽医问;2006;28:61-4。
Bouchard B, Xaymountry B, Thongtip N, Lertwatcharasarakul P, Wajjwalku W.老挝首例大象嗜内皮性疱疹病毒感染病例。动物医学杂志。2014;45:7 4 - 7。
Sripiboon S, Jackson B, Ditcham W, Holyoake C, Robertson I, Thitaram C，等。泰国圈养小亚洲象嗜内皮性疱疹病毒感染的分子特征和遗传变异。感染Genet Evol 2016; 44:487-94。
吴泽，昂勇，昂涛，桑宁，敦泽，海沃德，等。缅甸伐木营地亚洲象幼崽的大象嗜内皮性疱疹病毒出血性疾病。新兴感染杂志2020;26(1):63-9。
Sripiboon S, Tankaew P, Lungka G, Thitaram C.大象嗜内皮性疱疹病毒在圈养亚洲象中的发生(Elephas马克西姆斯):亚洲首宗猪流感四型病毒个案。动物医学杂志。2013;44(1):100-4。
李文杰，李志强，李志强，等。圈养亚洲象的临床感染情况(Elephas大象嗜内皮性疱疹病毒4。动物医学杂志，2016;47(1):311-8。
李志强，李志强，李志强，等。一头圈养亚洲象发生致死性嗜内皮性疱疹病毒5型感染。兽医娱乐，2012年。https://doi.org/10.1136/vr.e6833．
拉蒂默E，宗JC，希根斯SY，里奇曼LK，海沃德GS。亚洲象和非洲象常规和病理标本中新型疱疹病毒的检测和评价:鉴定了两种新的鼻疱疹病毒(EEHV5和EEHV6)和两种新的γ疱疹病毒(EGHV3B和EGHV5)。兽医微生物，2011;147:28-41。
张志刚，张志刚，张志刚，张志刚，等。大象嗜内皮性疱疹病毒5，一种新发现的与圈养亚洲象临床和亚临床感染相关的大象疱疹病毒(Elephas马克西姆斯)．动物医学杂志，2013;44(1):136-43。
王晓燕，王晓燕，张晓燕，等。圈养非洲象的大象嗜内皮性疱疹病毒6型感染(非洲象)。《EEHV研讨会论文集》，2015年，休斯敦，第41页。
Bronson E, McClure M, Sohl J, Wiedner E, Cos S, Latimer EM，等。非洲象嗜内皮性疱疹病毒3b感染的流行病学评价(非洲象)．动物医学杂志，2017;48(2):335-43。
Fayette MA, Brenner EE, Garner MM, Bowman MR, Latimer E, Proudfoot JS。5头非洲象因大象嗜内皮性疱疹病毒3A感染而患上急性出血性疾病(非洲象)在一个北美动物机构。中华动物医学杂志，2021;52(1):357-65。https://doi.org/10.1638/2020-0126．
李志强，李志强，李志强，等。健康成年亚洲象常规洗鼻中致病性大象嗜内皮疱疹病毒的检测(Elephas马克西姆斯)采用实时定量聚合酶链式反应法。美国兽医杂志，2010;71(8):925-33。
Sripiboon S, Angkawanish T, Boonprasert K, Sombutputorn P, Langkaphin W, Ditchman W，等。成功治疗临床大象嗜内皮性疱疹病毒感染:病毒载量动态、基因型分析和阿昔洛韦治疗。动物医学杂志，2017;48(4):1254-9。
大象嗜内皮性疱疹病毒。入职:Miller ER, Lamberski N, Calle PP，编辑。福勒动物园和野生动物医学:当前疗法。圣路易斯:爱思唯尔;2019.672 - 9页。
威辛克-阿吉拉加N, Dastjerdi A, Molenaar FM。利用内部血液学指导成功治疗和监测大象嗜内皮细胞疱疹病毒1b临床和随后亚临床病例的决策。动物医学杂志，2019;50(2):498-502。
Drake GJ, Haycock J, Dastjerdi A, Davies H, Lopez FJ。使用免疫刺激剂成功治疗亚洲象的EEHV1A临床感染(Elephas马克西姆斯)．兽医娱乐案例代表2020;8:e001158。
张志强，张志强，张志强，等。病例报告:成功治疗亚洲象嗜内皮性疱疹病毒感染(Elephas马克西姆斯)小牛口服阿昔洛韦药物。野生科学兽医医学科学2020。https://doi.org/10.1292/jvms.20-0375．
Alfred R, Ahmad AH, Payne J, William C, Ambu L.婆罗洲象密度与种群估算(大冰原象)在沙巴。中国生物医学杂志，2010;10(2):92-102。
克兰布鲁克E，佩恩J，莱CMU。大象的起源Elephas马克西姆斯婆罗洲。沙捞越植物学报，2007;29(4):344 - 344。
Fernando P, Vidya TNC, Payne J, Stuewe M, Davison G, Alfred RJ，等。DNA分析表明，亚洲象原产于婆罗洲，因此是保护的重中之重。公共科学图书馆。2003;1(1):110-5。
Sharma R, Goossens B, Heller R, Rasteiro R, Othman N, Bruford MW, Chikhi L.遗传分析支持婆罗洲大象的古老和自然起源。科学通报2018;8:88 - 91。
苏库马R.亚洲象:生态与管理。第二版。剑桥:剑桥大学出版社;1993.p。272。
Chmielewicz B, Goltz M, Ehlers B.山羊新型γ疱疹病毒的检测和多基因特征。病毒决议2001;75:87-94。
Van DeVanter DR, Warrener P, Bennett L, Schultz ER, Coulter S, Garber RL, Rose TM。一致引物PCR检测和分析多种疱疹病毒。临床微生物学杂志。1996;34:1666-71。
撒迦利亚A，撒耶什PK，桑托什S，巴斯拉查拉姆C，梅根M，潘迪扬J，等。印度野生和圈养亚洲象22例致命EEHV1出血性疾病的扩展基因型评估和比较PLoS ONE。2018; 13: e0202438。
张晓东，陈建平，张晓明，等。与大象嗜内皮性疱疹病毒1相关的致命出血性疾病和临床疾病是由原发性感染引起的:对诊断蛋白检测的影响。中国病毒学杂志。2020;94:1-14。
Dastjerdi A, Seilern-Moy K, Darpel K, Steinbach F, Molenaar F.幼年亚洲象中幸存和致命的嗜内皮性疱疹病毒- 1a感染——经验教训和抗疱疹病毒治疗的建议。BMC Vet Res. 2016; 12:178-89。
戴曼达尔M，曼达尔S.椰子(椰子L.:槟榔科):用于促进健康和预防疾病。中华热带医学杂志，2011;4(3):241-7。https://doi.org/10.1016/s1995 - 7645 (11) 60078 - 3．
我们对戴安娜·拉米雷斯博士为这项工作和沙巴野生动物保护做出的重要贡献表示最深切的感谢。作者感谢沙巴野生动物救援部队护林员协助管理SORC的爆发，并协助兽医对这些大象进行治疗、重症监护和尸检。作者还感谢沙巴生物多样性中心批准这项研究。作者感谢Gary Hayward博士对测序基因选择的建议，以及保护医学的Fernandes Opook对所使用的系统发育树模型的审查。
共识性疱疹病毒pcr的部分原因是美国人民通过美国国际开发署(USAID)新兴大流行威胁预测项目(合作协议号GHN-AOO-09-00010-00)的慷慨支持。内容由作者负责，并不一定反映美国国际开发署或美国政府的观点。美国驻吉隆坡大使馆资助艾琳·拉蒂默前往沙巴提供基因位点pcr培训。
MHL对测试提出建议，处理样本，进行PCR测定，分析和解释序列，并且是准备手稿的主要贡献者。SKSSN监督尸检，根据体征确定疾病，建议治疗，并有助于撰写手稿。LB和PN对患病大象进行现场临床管理，进行尸检，收集样本，并参与撰写手稿。EL进行了一些PCR分析，分析和解释序列，是准备手稿的主要贡献者。DR安排了将样本运送到实验室的后勤工作，以及EL前往沙巴及其周边地区的旅行，并帮助控制了疫情。TH在样本收集和测试方面提供建议，支持使用共识PCR和第一轮特定EEHV测试进行疱疹病毒测试，安排实验室测试的批准，并在准备手稿方面做出了主要贡献。JRAS监督SORC和WHGFL的运作，并为撰写手稿做出了贡献。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。
不适用。
不适用。
作者宣称他们之间没有利益冲突。
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戴安娜·拉米雷斯:2018年10月31日去世
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李，MH，内森，s.k.s.s.，本尼迪克特，L。et al。马来西亚首例大象嗜内皮性疱疹病毒感染性出血性疾病报告:病例报告。性研究J18， 231(2021)。https://doi.org/10.1186/s12985-021-01694-x
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