巨细胞病毒潜伏期和再激活期间宿主细胞信号的调制

背景

人巨细胞病毒(HCMV)潜伏于髓细胞室，包括CD34⁺造血祖细胞和循环单核细胞。健康的宿主潜伏着这种病毒，这种感染在大多数情况下是无症状的。然而，如果有适当的外部线索，HCMV会从潜伏期中重新激活，此时病毒会传播，导致疾病。病毒和细胞因素决定了这些感染阶段之间的平衡尚不完全清楚，尽管大量文献支持病毒介导的宿主细胞信号传导的操纵作用。

主体

为了建立和维持潜伏期，HCMV进化出了各种手段，通过这些手段，它篡夺了宿主细胞因子来改变细胞环境，以达到自己的优势，包括改变宿主细胞信号级联。早在病毒进入髓系细胞时，HCMV就会篡夺细胞信号以改变细胞环境，这种调节包括不同信号级联的上调和下调。事实上，如果给予适当的再激活线索，这种信号再次被改变，以允许病毒裂解基因的转激活。

结论

HCMV对宿主细胞信号的调节不是二元的，许多改变的细胞通路被精细调控，其中最轻微的修改会对细胞环境产生深刻的变化。同样明显的是，病毒介导的细胞信号不仅在这些感染阶段之间不同，而且是髓系细胞类型特异性的。尽管如此，了解HCMV介导它们的确切途径和手段无疑将为治疗干预提供新的靶点。

HCMV潜伏期维持在髓系室的细胞中，特别是外周血单核细胞和CD34⁺造血祖细胞[1，2，3.，4，5，6］．在原发感染的初始阶段，HCMV在上皮细胞内裂解感染和扩增，最终导致外周血单核细胞感染[7，8］．单核细胞的HCMV感染导致一种独特的潜伏形式，Yurochko实验室将其称为静止感染[9，10，11，12，13］．这种静止感染的建立特点是缺乏病毒裂解复制和与潜伏期相关的病毒基因产物的有限表达[3.，4，14］．然而，这种独特形式的潜伏期的维持阶段是有限的，因为病毒进入过程触发信号事件，将单核细胞的生存延长到正常的48小时寿命之外，增强迁移，并刺激分化为复制允许的巨噬细胞[9，10，15，16，17，18，19]，它们共同使单核细胞成为病毒传播到外周组织的载体。一旦感染的单核细胞外渗到组织中并分化为巨噬细胞，病毒就会发生复制和扩散[14，20.，21］．重要的是，骨髓的扩散和感染导致CD34内的潜在储存库的建立⁺手持电脑(2，5，22］．与原发性感染期间单核细胞的静止感染相反，潜伏感染的CD34发生长期维持⁺HPCs和需要外部激活刺激才能重新激活到裂解复制[23］．相比之下，单核细胞感染后的早期信号事件促使它们分化为巨噬细胞，并在感染后2-3周自发的病毒再激活。［13]，这是区分静止感染与CD34中更规范的潜伏期定义的一个重要方面⁺手持电脑。在再次激活信号后，潜伏感染CD34⁺HPCs优先沿髓系分化为潜伏感染的单核细胞，最终复制允许型巨噬细胞，导致病毒在外周器官部位重新播种[24，25］．同样，静止感染的单核细胞也可在2-3周前通过外部再激活信号刺激其重新激活(例如，参考文献[26])。因此，早期hcmv诱导的事件有助于静止感染的单核细胞和潜伏感染的CD34的建立、维持和重新激活⁺hpc可能非常相似。因此，对静止感染单核细胞的研究也可能有助于深入了解CD34 + HPCs的潜伏期机制，反之亦然。在单核细胞和CD34中建立了持续性感染⁺HPCs对于病毒传播和在受感染宿主中的终生存在至关重要(图。1)．在此，我们回顾了宿主细胞信号通路HCMV的合作，使细胞环境更易于延迟建立，以及维持和再激活。

建立

潜伏期的建立

潜伏期感染的建立需要从主要即时早期启动子(MIEP)限制病毒基因的表达来取消HCMV的裂解复制。MIEP控制病毒即早(IE)基因的表达，该基因负责病毒裂解复制程序的启动[27，28］．MIEP的限制是通过抑制激活转录因子、结合抑制转录因子以及染色质重排导致启动子不可接近来实现的(综述于[29])。虽然有关潜伏期建立的机制的文献有限，但一些研究表明，在病毒进入过程中调节细胞信号通路是至关重要的。本节将重点讨论细胞受体和病毒G蛋白偶联受体(vGPCRs)如何在病毒进入过程中调节细胞信号通路，以促进HCMV潜伏期的建立(图2)。2)．

HCMV进入骨髓细胞和信号转导

HCMV的进入是一个复杂的过程，它允许病毒有效地进入，但也启动了改变细胞环境的信号事件。在潜伏期建立期间缺乏病毒基因表达的情况下，这些信号事件被认为是潜伏期建立的关键。最初，HCMV糖蛋白gM/gN以可逆的低亲和相互作用结合硫酸肝素蛋白多糖[30.]，迅速被病毒糖蛋白与细胞受体之间不可逆的高亲和力结合所取代(在[31])。病毒糖蛋白gH在病毒粒子内的三个复合物中被发现;二聚体gH/gL、三聚体gH/gL/gO或五聚体gH/gL/UL128-131配合物[32，33，34］．对于单核细胞的感染，需要五聚体复合体[35，36］．gH直接结合整合素β1, UL128-131结合β3整合素[19，37］．此外，病毒糖蛋白gB结合表皮生长因子受体(EGFR)在单核细胞和CD34⁺手持电脑(19，38，39，40，41］．EGFR是HCMV嗜髓性的主要决定因素，因为单核细胞是唯一表达EGFR的人类白细胞，EGFR也在用于HCMV潜伏期模型的髓系中表达，如THP-1细胞[39，42，43］．在CD34中，EGFR是有效感染和建立潜伏期的重要受体⁺手持电脑(40］．HCMV的其他细胞受体已被鉴定，包括血小板来源的生长因子受体α (PDGFR-α)、神经蛋白酶-2 (NRP-2)、胸腺细胞分化抗原-1 (THY-1)、嗅觉受体家族14I1 (OR14I1)、CD147和CD151 [44，45，46，47，48］．许多这些受体，如PDGFR-α和OR14I1，在髓系细胞上不表达，因此它们不太可能参与潜伏期的建立[39，48，49，50，51］．尽管已知在髓系细胞上表达NRP-2、th -1、CD147和CD151等受体，但这些HCMV入口受体对单核细胞或CD34的感染有贡献⁺hpc还有待彻底检查[52，53，54，55］．

除了通过病毒糖蛋白与细胞受体的相互作用触发信号通路外，HCMV还编码四种vGPCRs，包括US28、US27、UL33和UL78，它们可以调节细胞信号通路。虽然所有四种vGPCRs都是在溶解感染期间从头合成的，但只有US28、UL33和UL78在潜伏期期间表达(在[56])。每一种hcmv编码的GPCRs都被纳入成熟的病毒颗粒[57，58，59，60，61]，从而促进它们在病毒融合时进入宿主细胞。重要的是，病毒粒子传递的US28足以减弱早期IE基因的表达[57，62］．然而，在没有从头合成US28的情况下，HCMV无法维持长期潜伏期，这表明病毒粒子传递的US28足以建立HCMV潜伏期，但不能维持HCMV潜伏期[62］．虽然UL78和UL33也被纳入病毒粒子，但这些vGPCRs在骨髓细胞潜伏期建立过程中的作用尚未被探索，尽管UL33在重新激活过程中发挥作用，详见下文[63］．因此，我们将重点研究US28在调节糖蛋白诱导的细胞信号通路以促进HCMV潜伏期的建立中的潜在作用。

PI3K / Akt

EGFR是一种研究充分的病毒进入受体，有助于单核细胞和CD34的有效感染和潜伏期的建立⁺手持电脑(19，38，41，64］．在HCMV进入过程中，病毒糖蛋白gB与EGFR结合，触发下游PI3K/Akt信号通路的激活[19，38，39，40］．HCMV激活EGFR通过激活含有肌醇5-磷酸酶1 (SHIP1)的Sh2结构域诱导非典型的PI3K/Akt信号通路[16，19]，导致Akt在丝氨酸473位点优先磷酸化。相反，单核细胞内典型生长因子诱导的PI3K/Akt信号通路刺激Akt在丝氨酸473和苏氨酸308位点的双磷酸化[16］．Akt被HCMV感染激活导致一个独特的抗凋亡蛋白亚群上调，包括髓系细胞白血病-1 (Mcl-1)蛋白、热休克蛋白27 (HSP27)和x -连锁凋亡抑制剂(XIAP)，这是受感染单核细胞存活所必需的[9，15，17，18］．虽然这些生存因子的上调对于在自然寿命短的单核细胞中建立潜伏期至关重要，但HCMV诱导的非典型EGFR/PI3K/Akt信号传导如何直接促进MIEP的抑制尚不完全清楚。在CD34⁺HPCs, Kim等人表明，基因组核易位后EGFR的抑制增加了IE基因的表达，同时降低了潜伏期维持蛋白UL138的表达[40］．慢性EGFR和PI3K信号通路对于维持潜伏期也是必要的，因为通路的抑制会刺激病毒再激活，这表明EGFR/PI3K/Akt信号通路可能通过调节激活和抑制转录因子直接调节MIEP活性。在支持下，EGFR/PI3K/Akt级联直接调节多种转录因子的活性。另外，早期EGFR诱导的信号事件调节单核细胞和CD34内核小体内的病毒基因组运输⁺手持电脑(40，65］．病毒被膜蛋白pp71介导从MIEP去除早幼粒细胞白血病核体(PML-NB)蛋白，包括Daxx和组蛋白去乙酰酶(HDACs)，以允许转录启动[66，67，68］．然而，Lee和Kalejta发现，在TB40/ e潜伏感染的CD34中，pp71被隔离在核内体中⁺HPCs，从而阻止pp71转位到细胞核[69]，可能导致pp71在潜伏期建立过程中无法降解PML-NB蛋白。同样，Saffert和Kalejta表明，在ad169感染的N-Tera2或THP-1细胞中，pp71在细胞核中受到限制[67]，两种体外模型细胞类型研究HCMV潜伏期。使用这些相同的细胞系统和病毒株，HDAC抑制剂处理或sirna介导的Daxx敲除导致IE基因表达[67］．然而，随后辛克莱[70]和Stamminger [71]组，分别使用胚胎癌NT2D1细胞或THP-1单核细胞，显示出不同的表型。在NT2D1细胞中敲除Daxx不影响感染Toledo株后IE基因的转录[70]，同样，敲低PML、Daxx或Sp100也不能启动TB40/ e感染的THP-1细胞中IE基因的表达[71］．这些数据表明，基于病毒株、临床与实验室适应菌株和/或研究中使用的细胞类型，潜在的机制确实可能是不同的。然而，有趣的是，EGFR驱动的PI3K/Akt控制内体转运可能通过pp71或其他病毒蛋白的隔离导致潜伏期的建立。无论其作用机制如何，这些数据表明EGFR/PI3K/Akt通路在早期抑制MIEP和建立潜伏期中具有直接作用。虽然已知GCPRs改变PI3K/Akt级联，但病毒GCPRs在调节糖蛋白诱导的EGFR/PI3K/Akt信号通路中的作用可促进hcmv感染单核细胞和CD34的潜伏期建立⁺HPCs是一个有待阐明的重要研究方向。

MAPK

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，包括c-Jun n端激酶(JNK) 1/2/3，细胞外信号调节蛋白激酶(ERK) 1/2和p38，促进MIEP的转录。MAPK信号通路激活激活蛋白-1 (AP-1)转录因子，由c-fos和c-jun组成，与MIEP结合以启动转录[72］．ERK1/2信号通路介导环AMP响应元件结合蛋白(CREB)依赖性的MIEP激活[73］．除了激活转录因子外，通过抑制转录阻遏物来解除MIEP的抑制在再激活和IE基因表达过程中起着同样重要的作用。在潜伏感染的单核细胞和CD34中，MIEP与异染色质蛋白1 (HP-1)相关，这是一种涉及基因沉默的染色体蛋白⁺手持电脑(74，75，76］．然而，MIEP和HP1的关联在HCMV再激活过程中丢失。在机制上，Dupont等人证明ERK刺激有丝分裂原和应激激活激酶1和2 (mks)的活性，mks识别并随后磷酸化CREB以促进组蛋白H3丝氨酸10的转录和磷酸化，导致在il -6介导的树突状细胞(dc)内的再激活过程中，组蛋白与HP1的去稳定[77］．最后，MIEP和随后的病毒复制也以依赖于p38的方式被激活[78]，进一步揭示了MAPK活性对MIEP激活的重要性。尽管MAPKs在促进IE基因表达中的重要作用，我们将在下面更详细地讨论，但病毒进入单核细胞和CD34后，MAPKs会被迅速激活⁺HPCs没有启动转录从MIEP。HCMV gB触发ERK/MAPK促进Mcl-1的表达以及随后感染单核细胞和CD34的存活⁺手持电脑(79］．此外，如下所述，EGFR通过MEK/ERK信号激活早期生长反应1 (EGR-1)转录因子，从而驱动病毒潜伏期维持蛋白UL138的表达[80］．hcmv感染单核细胞快速分泌IL-1β触发p38 MAPK信号，促进有利于延迟的细胞环境[81］．这些研究强调了MAPK信号在促进支持延迟的细胞环境方面的关键重要性，尽管它也具有刺激IE基因表达的功能。因此，问题仍然是mapk的激活如何能够促进延迟的建立。正如下面更详细地讨论的那样，US28在THP-1细胞中分离表达时会减弱ERK磷酸化[82］．因此，US28降低了c-fos的表达和磷酸化[62］．类似地，US28缺陷病毒感染增加了AP-1与MIE增强子/启动子的结合[62]和IE基因在单核细胞中的表达[62，82］．有趣的是，潜伏感染的CD34中c-jun也下调⁺HCMV感染后的HPCs和Kasumi-3细胞，尽管以us28独立的方式[62，83］．然而，目前尚不清楚病毒粒子传递的US28是否在调节糖蛋白激活的MAPKs中发挥作用。有趣的假设是MAPKs在进入时通过糖蛋白/受体相互作用被激活，然后随后被US28对抗。然而，值得注意的是，MAPKs并没有被US28完全衰减;相反，US28作为一个变阻器，微调这一信号通路的活动。因此，可能存在一个激活的阈值水平，对潜伏期的建立很重要，但不足以启动miep驱动的转录。

Src

整合素是由单一α和β链组成的异二聚体受体家族。有24个α和9个β整合素链，可以形成25个单独的受体，根据细胞类型表达到不同的水平(在[84])。α和β链的每种组合不仅具有不同的结合性质，而且还表现出不同的下游信号特征。HCMV利用整合素多样性介导进入不同的细胞类型，并启动不同的细胞类型特异性信号。在进入成纤维细胞时，HCMV只参与α₂β₁,α₆β₁［85，或αvβ_3.［86整合素异二聚体通过gH/gL/gO三聚体，刺激瞬时Src信号。相反，五聚物同时结合两个β₁和β_3.含有异二聚体的整合素刺激Src的慢性但低水平激活[87］．重要的是，三聚体复合物对Src进入单核细胞期间的活性没有影响，这表明由五聚体复合物特异性启动的Src介导的信号对感染的建立至关重要[37］．在成纤维细胞的溶解感染过程中，也有证据表明gB通过分解素结构域结合β1整合素[88］．然而，这种相互作用对Src信号诱导的贡献仍未被探索。重要的是，我们最近报道了gB在感染单核细胞中直接与EGFR相互作用，但不与β1整合素相互作用[19］．在单核细胞中，五聚体诱导的Src信号通路对于增强细胞运动性以及适当的内吞作用和病毒粒子的运输是必需的[37，41，87，89］．然而，Src信号是否在单核细胞或CD34中调控MIEP⁺目前还不清楚HPCs。最近，Src家族激酶(SFKs)在MIEP中参与染色质结构的调节。如下所述，SFKs、Src和造血细胞激酶(Hck)的上调，在潜伏期期间招募单核细胞白血病锌指蛋白(MOZ)组蛋白乙酰转移酶，导致染色质重排和MIEP转录的启动[77］．这些数据表明，在病毒进入过程中，糖蛋白介导的Src信号的激活必须在一定程度上受到限制，以允许建立潜伏期所需的细胞变化，同时抑制MIEP。为了支持这一点，US28在模型髓系THP-1细胞中的表达导致Src基因表达下调[62］．需要指出的是，Krishna等人在一项磷酸激酶研究中表明，经组成性表达US28结构转导的THP-1细胞增加了Src磷酸化，尽管这些数据随后未在本研究中得到证实[82］．然而，Aslam等人的研究支持了这一工作，他们的研究表明，在US28的存在下，Src磷酸化被上调[90］．然而，从这项工作中还不清楚，哪些Src磷酸化位点被评估，这是至关重要的，如Ser⁴¹⁶磷酸化使Src活化，而在Ser磷酸化⁵²⁷是一个消极的调控位点，与Src不活性有关(在[91])。病毒粒子传递的US28是否抑制早期Src信号以促进潜伏期的建立仍有待阐明，尽管这是一个有吸引力的假设。

NF -κB通路

核因子κB (NF-κB)信号通路对HCMV生物学的许多方面至关重要[92]，但它在延迟建立中的作用尚不清楚。HCMV同时编码NF-κB的激动剂和拮抗剂，这增加了该通路调控的复杂性。NF-κB作为转录因子与MIEP结合驱动IE基因表达[93，94]，在溶菌感染过程中，病毒结合和进入激活NF-κB信号通路和MIEP表达[34，95］．有趣的是，单核细胞感染后，NF-κB被病毒糖蛋白和细胞受体相互作用以依赖toll样受体-2 (TLR-2)的方式激活，促进单核细胞中独特炎症表型的诱导[39，96，97］．NF-κ b介导的表型刺激异常环境下炎症和抗炎细胞因子和趋化因子的表达，可能对推动hcmv感染单核细胞在组织中的外渗很重要。然而，为什么未分化骨髓细胞感染期间NF-κB通路的激活不会导致IE基因的表达，这一问题仍然存在。一种可能是NF-κ b驱动的细胞基因表达是有功能的，但在未分化的髓系细胞中不活跃的其他调控辅因子是刺激IE表达所必需的。Krishna及其同事证明了US28在潜伏期期间调节NF-κB核定位。US28信号缺失突变体增加了NF-κB的核定位，提示US28通过未知机制减弱NF-κB信号通路[82］．此外，功能性病毒microRNAs (miRNAs)，包括已知能调节NF-κB的miRNAs [92]，由感染病毒粒子传送到宿主细胞[98］．这些数据提示了一种潜在的模型，即HCMV通过糖蛋白-细胞受体相互作用刺激NF-κB活性，但通过US28和miRNAs限制其活性，以允许NF-κB反应性细胞基因的表达，而不启动MIEP的转录。

维护和再激活

一旦病毒形成潜伏期，病毒就必须设法维持这一感染阶段。这一过程无疑是多方面的，但很明显HCMV与宿主共同进化，篡夺宿主细胞网络，为自己谋利。病毒的一个“容易攻击的目标”是细胞信号，因为这是改变细胞环境的主要手段之一。事实上，HCMV已经设计出生物机制来选择宿主细胞信号，以维持病毒潜伏期并触发重新激活进入裂解周期(图2)。3.)．

UL133-138位点

来自不同研究小组的研究表明UL133-138位点对延迟和再激活的调节非常重要(综述于[99])。UL138是建立潜伏期所必需的，事实上，废除这个开放阅读框(ORF)会导致感染，有利于裂解复制，导致病毒粒子产量增加[One hundred.，101，102］．最近，Buehler等人发现UL138调节EGFR信号通路，而EGFR信号通路下游上调PI3K/Akt信号通路[80，103］．PI3K/Akt的药物抑制有利于再激活，尽管这种表型在与再激活刺激细胞因子联合使用时最为显著，这表明其他因素调节了该途径[80］．这些数据还强调，病毒对宿主细胞信号的操纵可能不像直接的开/关状态那么简单，而是反映了一种更精细的机制。事实上，UL138在HPC潜伏感染过程中实际上是通过上调egfr调控的转录因子EGR-1来调节自身表达的。这种宿主蛋白结合病毒基因组，从而驱动UL138HPCs的转录，以及成纤维细胞[80]，进而创建一个调节ul138介导的事件的反馈回路。病毒基因组中UL138上游EGR-1结合位点的破坏，导致病毒无法在hpc中建立/维持延迟，这支持了该反馈回路对延迟的作用[80］．

UL133-138位点的重要性并没有随着病毒潜伏期而结束。虽然UL138有助于维持延迟，但UL135对于有效的再激活至关重要。当给予适当的再激活线索时，UL135通过靶向EGFR来对抗ul138介导的功能[80］．事实上，UL135 ORF的破坏导致病毒不能有效地在CD34中重新激活⁺手持电脑(104］．为了确保EGFR信号及其下游效应物得到适当调控，HCMV额外编码了一种miRNA, cmv-miR-US22，其靶向EGR1 [105］．UL135在再激活过程中的作用并不仅限于对抗UL138的功能。UL135与宿主连接蛋白，abelson - interator (Abi)-1和Cbl-interaction protein (CIN) 85/ CD2 associated protein (CD2AP)相互作用，进而调节细胞表面的EGFR。因此，在缺乏UL135及其与这些宿主蛋白相互作用的情况下，HPCs细胞表面的EGFR增加，从而放大信号并有利于延迟。与此相一致，抑制EGFR或其下游途径在与再激活刺激耦合时导致再激活，并挽救了在UL135突变病毒感染中观察到的再激活缺陷[80，103］．总的来说，UL135和cmv-miR-US22都能拮抗ul138介导的EGFR调控，从而创造一个更易于再激活的细胞环境。这些数据还阐明了潜伏期间EGFR信号的关键性质，为此病毒设计了几种方法来调节这一途径。

操纵宿主细胞信号传导影响MIE增强子/启动子活性

建立和维持HCMV潜伏感染的关键步骤是MIE位点的沉默，这可能是由染色质重塑引起的(在[29])。MIE增强子/启动子被认为是“溶解开关”，其作用就像一个变阻器，可以更准确地描述为使感染倾向于潜伏感染而不是溶解感染(在[29])。长期以来被认为是MIE增强子/启动子的沉默因子[106，107]， Poole及其同事最近证实了阴阳1 (YY1)转录因子结合维持潜伏期的必要性[108］．也许毫不奇怪，HCMV通过操纵宿主细胞信号来调节YY1。宿主编码的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶，骨形态发生蛋白受体2 (BMPR2)信号通路诱导SMAD6, SMAD家族成员，负调控BMP和转化生长因子β (TGFβ)信号通路(在[109])。在潜伏感染的情况下，SMAD6的上调会限制TGFβ受体(TGFβ r)的活性[108］．这是至关重要的，因为潜在感染的诱导多能干细胞(iPSCs)或CD34⁺HPCs显示TGFβ显著上调[108，110，111]，至少部分由cmv-miR-US5-2对NGFI-A结合蛋白1 (NAB1)的抑制介导[112］．由于NAB1是EGR-1的转录抑制因子[113，114]，这代表了HCMV确保EGR-1转录和随后TGFβ产生的另一种机制。此外，cmv-miR-UL22A也靶向TGFβ信号，事实上，在病毒基因组中删除pre-miR-UL22A序列会导致病毒突变体，其再激活效率较低[110］．这与TGFβ信号通路增加导致宿主编码的miRNA hsa-miR-29增加的发现是一致的，hsa-miR-29最终靶向YY1。反过来，YY1对MIE增强子/启动子的招募减少，这缓解了病毒启动子的抑制并导致重新激活[108］．总的来说，这些发现不仅揭示了TGFβ信号转导对潜伏期和再激活的重要性，而且揭示了这一途径在调节MIE增强子/启动子的活性和抑制状态之间的平衡的中心转录因子方面的关键性质。后一点被HCMV设计的多种生物机制放大，以调节YY1调节达到顶峰的细胞信号。

MIE增强子/启动子位点是一个富含转录因子结合位点的区域，为激活这个非常强的启动子区域点缀着多个结合位点。因此，正如病毒必须进化策略，在潜伏期期间只招募沉默转录因子，如YY1, HCMV有相反的策略，招募转录因子，激活MIE增强子/启动子，当病毒重新激活。研究人员已经证明，这些转录因子中的几个是由病毒操纵宿主细胞信号调节的。例如，Keller和同事发现，在静止感染的ntera2来源的神经元细胞中，MIE位点的转录被forskolin(一种使CREB磷酸化的化合物)处理后，MIE位点的转录被解除了抑制[115，116］．事实上，这依赖于MIE远端增强子内的cre结合位点[115］．最近，Kew等人发现，与MIE增强子/启动子结合的磷酸化CREB有助于dc中的病毒再激活，这依赖于ERK-MSK信号轴的激活。与此一致，MIE增强子/启动子区域CREB结合位点的缺失导致突变病毒无法在dc中重新激活，尽管两者都是CD14⁺单核细胞和未成熟的dc维持病毒基因组。同样重要的是要指出，在这种情况下，CREB不仅作为一个典型的转录因子，而且还促进组蛋白H3的磷酸化，这有助于MIEP的染色质重塑，促进再激活[73］．最近，我们展示了调节CREB活性和MIE增强/启动子招募的平行机制。与之前在其他细胞类型(如COS-7，成纤维细胞;［117，118])，我们发现病毒GPCR信号UL33激活CREB [63］．此外，ul33介导的信号通路在MIE位点重新激活期间促进了磷酸化creb的募集。事实上，整个UL33 ORF或UL33的g蛋白偶联基序(' DRY '基序)的破坏导致CD34感染后无法从潜伏期中重新激活⁺HPCs，尽管每个突变病毒都有能力维持病毒基因组。当磷creb被招募到潜伏感染的Kasumi-3造血细胞的MIE位点时，用12- o- tetradecanoylphorbol13 -acetate (TPA)处理以诱导重新激活[63，119]，这在感染UL33突变体的平行培养中显著降低[63］．因为细胞GPCRs偶联到Gα_o通过p38 MAPK激活CREB [120]，似乎UL33使用了类似的机制。然而，抑制单核细胞中p38 MAPK对磷酸化creb与MIE位点的结合几乎没有影响[73］．因此，需要做更多的工作来全面理解CREB调控背后的上游机制。

NF-κB和AP-1宿主转录因子也可激活MIE增强子/启动子(综述于[29])。潜伏感染的Kasumi-3造血细胞被肿瘤坏死因子(TNF) α刺激诱导活化[119]，同时与curaxins联合抑制NF-κB，可显著降低NF-κB的表达UL123转录，与单独用TNFα处理的培养物相比[121］．此外，hcmv编码的GPCR, US28在潜伏感染期间减弱NF-κB [82]，与US28表达和信号通路对病毒潜伏期的要求一致，具体讨论如下[25，57，62，82，122，123，124，125，126］．事实上，在us28缺失病毒突变体感染的单核细胞中，NF-κB的药理学抑制导致感染倾向于潜伏期，而不是通常观察到的这种突变体的溶酶样表型感染[82］．在MIE增强子/启动子中有四个结合位点(在[29])，可能NF-κB在再激活过程中的作用是关键。例如，进一步阐明US28调节宿主信号以调节这一重要转录因子的确切机制是有必要的，并可能揭示对病毒再激活至关重要的造血特异性信号级联。

AP-1是一种异二聚体转录因子，由c-fos和c-jun亚基组成[127］．我们之前已经证明了c-fos [62]和c-jun [128]在潜伏期期间减弱，从而限制了它们的异二聚。AP-1与MIE增强子/启动子结合的平衡是其调控的关键;而缺乏AP-1结合有助于保持MIE增强子/启动子沉默[62]，其与启动子近端位点的结合是病毒再激活所必需的[129］．尽管该转录因子需要再激活，但AP-1结合对于成纤维细胞或上皮细胞的溶酶复制是可有可无的[72，129］．调控fos和jun的上游信号事件目前正在研究中，虽然我们已经展示了us28诱导的信号靶点fos [62]，病毒和/或细胞因素操纵jun是未知的。正如下面更详细地讨论的那样，信号级联US28劫持以减弱c-fos仍有待阐明，但很可能是病毒平衡了信号级联的激活和衰减，使细胞环境偏向于有利于延迟的环境，而不是帮助再激活的环境。因此，病毒蛋白，如US28，很可能在重新激活期间被拮抗以“切换”其功能，类似于UL138和UL135之间的关系。

最近的一项研究详细介绍了在CD34潜伏期和再激活过程中，kruppel相关盒域相关蛋白(KAP)-1/含有三方motif (TRIM) 28和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的参与⁺手持电脑(130］．KAP-1协同调节转录，因为它招募SET结构域分叉(SETDB) 1和HP1α，促进H3K9me3。这种组蛋白修饰是一种抑制性染色质标记，在HCMV潜伏期期间，在SETDB1和HP1α募集后抑制MIE位点(在[29])。因此，这些因素在整个潜伏期沉默MIE位点。然而，当mTOR被激活时，它会磷酸化KAP-1，缓解MIE位点的染色质化，导致裂解基因转录的激活和病毒颗粒的产生，这表明该途径在潜伏期和再激活中都有作用[130］．如上所述，Buehler等人的研究表明，使用Akt或PI3K药物抑制剂治疗可以刺激CD34中的溶出复制⁺潜伏条件下培养的HPCs [80］．此外，我们发现HCMV刺激单核细胞潜伏感染24小时后mTOR活性[17，18]，尽管这种活动不足以驱动主动复制[18］．这可能反映了潜伏感染期间不同时间的细胞类型特异性或细胞环境的差异(例如，早期[24hpi]和晚期[7dpi]事件)。或者，这支持了mTOR以变阻器样的方式调节的概念，其中必须满足激活阈值或尚未达到激活阈值。虽然这一途径调控的机制尚不清楚，但雷帕霉素(一种mTOR抑制剂)用于移植受者可抑制病毒再激活[131，132，133，134］．这是由于对病毒的直接影响还是由于免疫反应，目前还存在争议[135]，因为雷帕霉素没有发挥作用UL123lps刺激dc的表达[136］．MAPK和Akt信号轴调控下游mTOR信号，所有这些都涉及CMV在细胞中的进入和维持，支持延迟[137］．Akt在单核细胞潜伏感染后迅速激活[16，18，138]和CD34⁺手持电脑(80]，尽管在单核细胞中72hpi减弱[16，138]并且在CD34中最低限度地维持⁺手持电脑(80］．同样，mTOR信号在单核细胞24hpi内也迅速上调[17，18]，在延迟维护期间衰减[130］．此外，持续的药物抑制Akt活性导致CD34中潜伏病毒WT的重新激活⁺手持电脑(80]，表明长时间完全取消Akt活性会改变细胞环境，使其不再支持HCMV潜伏期。

MAPK信号的操作

MAPK信号对HCMV潜伏期和再激活的重要性在过去十年中越来越明显。多项研究表明，MAPK信号通路促进单核细胞来源的dc中HCMV的再激活[73，77，139］．然而，这个规则不是二元的;与Akt一样，在HCMV潜伏感染期间，MEK和ERK磷酸化水平维持在低水平[80]，认为这些MAPK蛋白的活性是经过微调的。此外，这种细微的差异可能反映了组织或细胞类型的特异性。为了支持这一点，MAPK激活以细胞类型特定的方式促进再激活[139，140]，这表明并不是所有潜伏着CMV的细胞都有类似的行为(在[141])。事实上，IL-6介导的MAPK信号激活促进了单核细胞来源的dc和单核细胞来源的朗格汉斯样细胞(LCs)的病毒再激活，尽管在lc中病毒再激活与IL-6介导的MAPK信号激活并不耦合[77，140]，提示涉及其他病毒或宿主因素。如上所述，SFKs，特别是Src和Hck，在这种细胞类型特异性信号传导中发挥着重要作用(在[141])。在单核细胞来源的dc中，这两种SFKs在活化过程中表达上调，而MAPK活性影响MIEP上的组蛋白磷酸化，染色质化通过招募MOZ组蛋白乙酰转移酶(HAT)以sfk依赖的方式并行调控[77］．SFK信号的上游是各种能够增强信号的受体，其中之一是受体酪氨酸激酶，Fms相关受体酪氨酸激酶3受体(FLT-3R)，其下游调节Ras和ERK/MAPK等级联(在[142])。Crawford等人最近利用HEK293T细胞发现pUL7是FLT-3R的一种新型分泌配体。这种配体-受体相互作用确实会导致细胞信号转导，在骨髓淋巴母细胞中，PI3K/Akt和MAPK信号级联被激活。反过来，pUL7诱导HPCs和单核细胞的分化。为了支持这些数据，研究人员发现pUL7需要重新激活[143］．因此，MAPK信号的pUL7激活可能代表了HCMV为确保病毒再激活而设计的另一种机制。Src和/或Hck是否有助于调节pUL7-FLT-3R级联以影响下游MAPK信号尚不清楚，但假设这些因子协调其功能以确保病毒再激活期间适当的MAPK活性是有吸引力的。此外，这种调节实际上可能依赖于细胞类型，这强调了在造血细胞模型系统中询问这种途径的必要性。在这一点上，与重新激活的CD34相比，添加MEK或ERK抑制剂与再激活刺激相结合，显著增加了病毒的再激活⁺HPCs在没有抑制剂的情况下[80］．这些数据表明:1)MEK/ERK抑制本身不足以驱动再激活，2)MEK/ERK磷酸化的显著增加使平衡向再激活倾斜，3)MAPK活性与HCMV潜伏期有关，再激活可能取决于细胞类型。总的来说，这些数据揭示了MAPK信号通路是HCMV在潜伏期和再激活期间篡夺的关键通路，与Akt一样，MAPK信号通路可能被病毒微调，以扭曲宿主细胞环境，有利于特定的感染阶段。

us28介导的病毒潜伏期和再激活的调控

US28长期以来一直被认为是一种与延迟相关的转录本，早在1998年，Patterson和同事就发现这种病毒GPCR在受感染个体的外周血单个核细胞中被检测到[144］．此后不久，Beisser等人首先进行了演示US28在THP-1单核细胞潜伏感染期间转录[145］．然而，直到最近，US28在这一感染阶段的作用还没有被描述。我们是第一个在病毒潜伏期期间证明对US28的需求的人[57]，这一发现随后得到多个研究小组的独立证实[25，82，122，123，124，126］．US28是一种有效的信号分子[146]，因此us28介导的信号通路有助于建立和维持病毒潜伏期就不足为奇了[57，62，82，147］．将US28掺入成熟病毒粒子[57，62]可使MIE启动子/增强子立即表达，促进在造血细胞感染后2天内沉默[62］．为此，US28可减弱MAPK和NF-κB信号通路[82]，以及下游的fos表达式[62］．US28调控MAPK通路与先前的研究一致，这些研究表明MAPK信号的上调促进了单核细胞来源的dc中HCMV的再激活[73，77，139]，详见上文。us28介导的MAPK信号的衰减也与fos的下游抑制一致，最终阻止AP-1转录因子结合并激活MIE启动子/增强子[62］．如上所述，阻止AP-1募集到该启动子区域对成功的潜伏感染至关重要，相反，它的结合对病毒再激活至关重要[129］．作为一种在延迟期间表达的活性信号蛋白，US28调节最终影响MIE增强子/启动子活性的宿主因子可能并不令人惊讶，因为该区域对于平衡延迟和再激活至关重要。最近，Elder等人证明US28也调节ccctc结合因子(CTCF)与MIE增强子/启动子的结合。CTCF与该区域的结合在潜伏期期间增加，从而抑制MIE位点的转录。事实上，这依赖于us28介导的信号传导[122］．此外，这些新数据揭示了中性粒细胞趋化剂S100A8和S100A9在潜伏期期间下调[148]，实际上，至少部分是由us28介导的CTCF招募到它们的启动子[122]，揭示了US28操纵细胞蛋白质的另一种手段，使宿主细胞更容易受到病毒潜伏期的影响。

正如我们作为一个领域所共同了解到的，在延迟期间，围绕US28的功能还有许多悬而未决的问题。对于US28调控的信号通路，我们可以清楚地看到，在配体的潜伏期中，US28改变了细胞环境- [57，62，82，126，147]和G蛋白偶联依赖方式[57，62，82，126］．US28结合多种细胞趋化因子并与各种G蛋白偶联(在[56])，因此了解关键，细胞蛋白US28篡夺的优势将为潜在的治疗策略提供信息。潜伏感染的粒细胞-巨噬细胞祖细胞(gmp)显示CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)表达增加[149]，一种已知的US28配体(在[56])。G的药理抑制作用_α含有百日咳毒素的蛋白或含有wortmannin减弱MCP-1转录水平的PI3K [149]，表明这是通过gpcr介导的信号调节的。虽然支撑MCP-1在潜伏期调控的分子机制尚未阐明，但病毒编码的GPCRs在潜伏期表达肯定是合理的[57，63，145，150，151]，如US28，可能利用MCP-1的上调为自己的优势，可能促进病毒感染初始阶段的传播。

虽然许多宿主细胞趋化因子是US28明显的潜在配体，但US28与病毒编码的趋化因子相互作用同样可能。HCMV编码病毒趋化因子和细胞因子(综述于[152])，因此，这可能代表了一种新的机制，通过US28调节造血细胞中的宿主细胞信号，从而将病毒保持在其潜伏状态，直到给予适当的线索。虽然US28不是造血细胞病毒活化所必需的[25，82，122，123，124，126]， Crawford等人发表了完整的、功能性的US28 ORF的表达对维持潜伏期没有影响，但对CD34中的病毒再激活是必需的⁺从胎儿肝脏中分离出的祖细胞。［147］．这种差异可能是由细胞的组织来源(胎儿肝来源vs.造血来源)所解释的。尽管如此，由于这种病毒GPCR在感染的所有阶段都有表达，一些宿主或病毒因子可能会在造血细胞的重新激活过程中影响US28，以克服其强大的“前潜伏”信号，或“切换”其信号以支持溶出感染。

miRNA对潜伏期和再激活的调控

宿主细胞和病毒编码的miRNAs在延迟和再激活期间都有功能(在[153])。上面讨论了cmv-US5-2、cmv-miR-UL22A和cmv-miR-US22的已知功能。其他一些cmv编码的miRNAs也在延迟和再激活期间调节细胞信号通路。例如，cmv-miR-US25-1靶向RhoA，破坏这种病毒编码的miRNA会增加CD34的增殖⁺手持电脑(154］．作为Rho家族的GTPases的一部分，RhoA作为各种信号级联的开关，因为它在其非活性gtp结合状态和活性gtp结合状态之间循环(在[155])。在造血细胞潜伏期期间，RhoA是如何被病毒信号蛋白和其他因素操纵和利用的尚不清楚，尽管Diggins等人假设TGFβ信号的作用[154]，调节RhoA通路[156，157，158，159，160，161］．如果是真的，这将揭示HCMV在潜伏期期间减弱TGFβ级联的另一种手段。如上所述，cmv-miR-UL22A在CD34潜伏感染期间靶向SMAD3以防止强大的TGFβ信号通路⁺手持电脑(110］．因此，cmv-miR-US25-1和cmv-miR-UL22a可能协同作用，以确保这种宿主细胞信号通路在潜伏感染期间被抑制。类似地，在病毒潜伏期期间稳定表达的cmv-miR-UL148D，通过直接抑制激活素A受体类型(ACVR) 1B细胞受体，靶向单核细胞中的激活素信号轴，从而限制IL-6的分泌[162］．这代表了病毒破坏免疫检测的一种可能机制。此外，cmv-miR-UL148靶向细胞立即早期反应基因5 (IER5)。IER5的抑制导致宿主编码细胞分裂周期25B (CDC25B)表达的增加，这有助于抑制UL123同时增加周期蛋白依赖性激酶1 (CDK1)。因此，cmv- mir - ul148介导的IER5-CDC25B轴的调控对于Kasumi-3和原发性CD34的潜伏感染很重要⁺细胞(163］．cmv-miR-US5-1和cmv-miR-UL112也在延迟期间改变宿主细胞信号通路。Hancock及其同事最近发现，这两种病毒编码的mirna会下调宿主细胞叉头盒O3a (FOXO3a)。而这两种miRNAs都保护CD34⁺细胞凋亡[164]，但FOXO3a的表达和靶向是否是延迟所必需的仍然悬而未决。FOXO3a结合并驱动MIE内部启动子2 (iP2)的转录[165]，这是一种启动子，有助于重激活原发性CD34中的潜伏病毒⁺手持电脑(166]和Kasumi-3细胞[129］．此外，MIE启动子/增强子位点内FOXO结合位点的突变导致在刺激潜伏感染的CD34后低效的病毒再激活⁺手持电脑(165］．因此，cmv-miR-US5-1和cmv-miR-UL112靶向FOXO3a来限制该蛋白的足够数量，从而使其不能转激活MIE位点似乎是合理的。cmv-miR-UL112在这方面可能确实具有双重功能，Lau等人表明该miRNA在单核细胞和THP-1单核细胞中靶向IE72以帮助维持潜伏期[167]，与先前的研究一致[168］．HCMV还通过调节宿主细胞的miRNAs来抑制mie编码的蛋白质。事实上，hsa-miR-200家族成员靶向IE86。种子序列突变UL1223 ' untranslation region (UTR)导致病毒无法在Kasumi-3细胞中经历潜伏期。这个宿主编码的miRNAs家族的表达在有利于延迟的细胞中上调(例如Kasumi-3, CD34⁺，以及单核细胞)[169]，因此很有吸引力的推测，他们也可能针对蛋白质参与信号转导网络。总的来说，病毒和宿主miRNAs都是延迟和再激活的关键。这些非编码rna所带来的许多变化很小，但意义重大。这再次强调了参与细胞信号传导的因素的调节确实是经过微调的。

很明显，HCMV篡夺了宿主细胞信号的优势，早在潜伏期建立的初始阶段就开始了，并通过重新激活。可以说，病毒对这些信号级联的操纵改变了细胞环境，使其更容易受到病毒延迟的影响。事实上，这种对细胞环境的改变在触发病毒再激活的外部线索之后进一步改变;为建立和维持潜伏期而减弱的通路被激活(反之亦然)。然而，重要的是要认识到宿主细胞信号的调节不是二元的。这种细胞信号通路更有可能受到精细调控，其中最轻微的活动变化会导致深刻的细胞变化。这在潜伏期的建立过程中尤其明显，其中对于产生支持潜伏期的生物学变化至关重要的信号通路通常也在溶出感染期间被激活，以促进病毒基因的表达和复制。这一悖论揭示了病毒在潜伏期建立和维持以及再激活期间操纵宿主细胞信号的复杂性。细胞信号级联是交织在一起的，它们的调节很可能依赖于多种病毒和细胞因子以协调的方式工作。需要进一步的工作来揭示HCMV用于“重新布线”复杂的细胞信号网络的调节机制，该网络促进骨髓间隔内HCMV潜伏期的建立、维持和重新激活。 Finally, viral manipulation of host signaling cascades is likely cell type specific depending on the type of infection elicited by HCMV. Quiescent infection of primary monocytes likely produces a signaling network skewed towards promoting the establishment of latency while signaling within latently infected hematopoietic cells is undoubtedly more conducive to both the establishment and long-term maintenance of latency. In turn, cell type specific signaling likely leads to differences in the activation signals necessary for reactivation into lytic replication. Thus, understanding how HCMV modulates cell signaling in the cells that support viral latency and reactivation will undoubtedly provide clues as to the pathways crucial to supporting these exact phases of viral infection, keeping in mind that even the cell type used for experimentation matters (e.g. monocyte versus CD34⁺HPC)。随着这一领域的工作越来越多，我们可能会发现值得开发的途径，作为潜在储层的新型治疗靶点。

不适用。

:血巨细胞病毒

人类巨细胞病毒

手持电脑:

造血祖细胞

MIEP:

主要直接早期启动子

即:

直接早期基因

vGPCRs:

病毒G蛋白偶联受体

UL:

独特的长

表皮生长因子受体:

表皮生长因子受体

PDGFR -α:

血小板衍生生长因子受体

NRP-2:

Neuropilin-2

THY-1:

胸腺细胞分化抗原1

OR14I1:

嗅觉受体家族14I1

我们:

独特的短

PI3K:

磷酸肌醇3激酶

SHIP1:

含有肌醇5-磷酸酶的Sh2结构域

mcl1:

髓细胞白血病-1

HSP27:

热休克蛋白27

XIAP:

x -连锁凋亡抑制剂

PML-NB:

早幼粒细胞白血病核体

Daxx:

死亡域相关蛋白

hdac:

组蛋白去乙酰酶抑制剂

MAPKs:

丝裂原激活蛋白激酶

物:

C-Jun n端激酶

兵:

细胞外信号调节蛋白激酶

AP-1:

激活蛋白1

分子:

环AMP响应元件结合蛋白

HP1:

异染色质蛋白1

MSK的:

丝裂原和应激激活激酶1和2

DCs:

树突细胞

EGR-1:

早期生长反应1

il - 1β:

Interleukin-1β

SFKs:

Src家族激酶

Hck:

造血细胞激酶

MOZ:

单核细胞白血病锌指蛋白

NF -κB:

核因子B

TLR-2:

toll样受体2

microrna:

小分子核糖核酸

子:

开式阅读架

Abi:

Abelson-interactor 1

CIN85:

85 kDa的cbl相互作用蛋白

CD2AP:

CD2相关蛋白

YY1:

阴阳1

BMPR2:

骨形态发生蛋白受体2

骨形态发生蛋白:

骨形态发生蛋白

TGFβ:

转化生长因子

TGFβR:

转化生长因子受体

则:

诱导多能干细胞

NAB1:

NGFI-A结合蛋白

肿瘤坏死因子α:

肿瘤坏死因子α

TPA:

12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate

KAP-1 / TRIM28:

[Kruppel-associated box domain]-associated protein-1/tripartite motif-containing 28

mTOR:

雷帕霉素的哺乳动物靶点

SETDB1:

SET域，分岔1

H3K9me3:

组蛋白H3赖氨酸9三甲基

MEK:

丝裂原活化蛋白激酶激酶1;MAPK/ERK激酶1

LCs:

Langerhans-like细胞

il - 6:

白细胞介素- 6

帽子:

组蛋白乙酰转移酶

FLT3:

Fms相关受体酪氨酸激酶3

FLT3R:

FLT3受体

HEK293T:

人类胚胎肾细胞293转化

CTCF:

CCCTC-binding因素

达到:

粒细胞-巨噬细胞祖细胞

答:

C-C基序趋化因子

MCP-1:

单核细胞趋化蛋白-1

ACVR1B:

激活素A受体1B型

IER5:

立即早期反应基因5

CDC25B:

细胞分裂周期25B

CDK1:

周期蛋白依赖性激酶1

FOXO3a:

O3、叉头箱

所有的图形都是用BioRender.com创建的。

这项工作由美国国家卫生研究院资助，资助号为AI150931 (CMO 'C)， AI153348 (CMO 'C)， R01AI141460 (GCC)和R01HL139824 (GCC)。资助机构在这篇手稿的写作中没有任何作用。

作者及隶属关系

1. 纽约州立大学北部医科大学微生物与免疫学系，锡拉丘兹，纽约，13210，美国

   Nicholas A. Smith & Gary C. Chan

2. 美国克利夫兰诊所勒纳研究所感染生物学项目基因组医学系，克利夫兰，OH, 44195

   克里斯汀·m·奥康纳

贡献

NAS、GCC和CMO’c撰写了原始草案;NAS、GCC和CMO’c编辑了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到陈志强或克里斯汀·m·奥康纳．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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