犬瘟热病毒自然感染犬脑组织细胞凋亡的研究

背景

犬瘟热症是由犬瘟热病毒引起的，属于犬瘟热病毒麻疹病毒属副粘病毒科属仍是全球流行的重大传染病，尤其在中国宠物犬中流行，严重危害养犬业的发展。已知犬瘟热病毒引起的细胞凋亡可在培养细胞、淋巴组织和小脑中表现出来。然而，它在脑组织细胞中的发生情况尚不清楚。目的探讨犬瘟热感染脑组织与脑组织细胞凋亡及脱髓鞘发病机制之间的关系。

方法

在研究中使用了16只自然感染的狗，它们表现出CD的临床症状，抗cdv单克隆抗体检测呈阳性，6只健康的狗作为对照。脑标本分为脑、脑干、小脑石蜡包埋，分别做切片。用苏木精-伊红、甲基绿吡啶、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP镍端标记技术和免疫组织化学染色约5µm厚的切片。免疫链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物检测CDV核衣壳蛋白。

结果

被cvv感染的狗的脑组织的改变涉及各种细胞和神经纤维。CDV对所有脑组织细胞均有不同程度的嗜细胞性;所有脑细胞均发生凋亡，尤其是脑血管内皮细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜细胞，感染越严重，凋亡越明显。严重的感染还包括锥体细胞和浦肯野细胞。神经纤维出现脱髓鞘病变(多灶性小液泡)，部分轴突神经元萎缩逐渐消失(形成大液泡)。

结论

脑组织细胞凋亡主要与CDV的传播途径和嗜细胞性有关。星形胶质细胞、少突胶质细胞和部分神经元的凋亡可能在犬急性犬瘟热脱髓鞘发病机制中起重要作用。临床上出现的许多不同的神经体征可能与不同的神经元凋亡有关。

犬瘟热病毒(Canine diemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine diemper virus, CDV)引起的一种全球流行的重大传染病麻疹病毒属副粘病毒科的属[1，2，3.］．CDV的自然宿主谱至少包括6目20余科哺乳动物[4，5]，尤其是食肉目所有科[6，7]，包括易受CDV感染的狗只[8］．根据最近的报告[9，10，11，12]，犬瘟热病毒再次出现的风险在世界范围内，一些新的犬瘟热病毒株已在亚洲分离出来。这似乎告诉我们必须重视乳糜泻的预防和控制。

CD的发病机制主要涉及中枢神经系统和免疫抑制。中枢神经系统(CNS)的损害是cvv感染犬的一个重要特征。脱髓鞘脑病是乳糜泻早期或急性期最常见的组织病理病变[13，14，15］．病理上，乳糜泻的中枢神经系统改变通常包括神经纤维束中显示多灶性或弥漫性脱髓鞘的白质和主要显示神经元多样化变性的灰质。胶质细胞感染先于脱髓鞘，并与白质胶质细胞中的强病毒复制相关[16］．神经体征是乳糜泻犬最常见的临床表现，包括冷漠、麻木、行为障碍、癫痫发作、共济失调、四肢瘫痪、四肢瘫痪、截瘫、感觉亢进、肌阵挛、大小便失禁[17，18，19，20.］．虽然患有乳糜泻的狗往往有多种神经表现，但临床上仅凭神经体征很难诊断。

根据先前的研究，CDV已被证明在体内诱导细胞凋亡，如在小脑[21]和自然感染狗的淋巴组织[22，23］．CDV在体外也引起细胞凋亡，如Vero [24，25]和海拉细胞[26］．然而，自然感染CDV的狗的大脑凋亡情况尚不清楚。本研究旨在研究CDV是否能诱导自然感染犬脑细胞凋亡，阐明CDV感染与脑细胞脱髓鞘发病机制之间的凋亡关系。

动物

在这项研究中，22只狗被分为两组。第1组为16只神经体征犬(1 - 16号，试验组)，临床经抗cdv单克隆抗体诊断为急性自发性乳糜泻。第二组为6只健康的比格犬(3公3母，6个月大，17-22号，对照组)，为一项中药研究的对照动物。这些狗按照标准规程接种了疫苗并驱虫。

样本收集和组织学

动物尸检后立即取脑，10%中性缓冲福尔马林浸泡72 h固定。固定后的脑沿纵裂分为左右半脑，详细观察脑损伤情况，再分为大脑、脑干、小脑，切成0.3 cm厚。所有组织用梯度醇脱水，石蜡包埋，用徕卡切片机按5 μm厚度切片。切片用苏木精-伊红(HE)染色。对照动物(17-22号)采用安乐死，它们的大脑也接受同样的组织病理学检查。

基因组碎片的原位检测

采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP镍端标记(TUNEL)技术，使用商用ApopTag Plus原位凋亡检测试剂盒(DAKO EPOS)进行DNA片段的原位检测。反应是按照制造商的说明进行的。简而言之，切片与蛋白酶K在室温(RT)下孵育15分钟，内源性过氧化物酶用3% H淬灭₂O₂在RT下在甲醇中浸泡5分钟。应用末端脱氧核苷酸转移酶和脱氧核苷酸，然后将切片置于37°C的潮湿气氛中30分钟。用阻断缓冲液停止反应。切片用过氧化物酶、链霉亲和素、偶联加二氨基联苯胺(DAB)处理，并用血碱轻微反染色。

甲基绿pyronin (MGP)染色

MGP染色检测凋亡发生时核仁和细胞质中DNA和RNA的变化。脑组织切片脱蜡，蒸馏水水化，MGP溶液(Bi yuntian, China)覆盖4分钟，然后在RT下封堵风干5分钟，蒸馏水分化，脱水，安装。

CDV的免疫组化检测

采用链霉亲和素生物素化过氧化物酶复合物(sABC)法检测CDV核衣壳蛋白单克隆抗体(NP)，确定CDV感染。切片在121°C柠檬酸缓冲液中蒸压5分钟，进行抗cdv免疫染色。用3% (w/v) H淬灭内源性过氧化物酶活性₂O₂RT下甲醇稀释10分钟。切片用一抗(小鼠抗cdv单克隆抗体1:400;Chemicon International, Inc.)在4°C孵育24小时和二抗(生物素化山羊抗小鼠和兔IgG;Chemicon International, Inc.) RT 10分钟。最后，用DAB显示切片，用苏木精轻微反染色。

抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)测定

抗GFAP实验是为了研究星形胶质细胞的代谢，其中GFAP仅由星形胶质细胞表达，被认为是星形胶质细胞的特异性标记物。简而言之，再水化切片在室温下浸泡在3%过氧化氢甲醇溶液中15分钟，用PBS稀释(1:20)的正常山羊血清堵塞20分钟，用一抗(小鼠单克隆抗gfap;DAKO EPOS)孵育80分钟，用二抗(山羊抗小鼠IgG过氧化物酶偶联物)孵育40分钟，用DAB观察，用苏木精轻度反染。

抗半乳糖苷(GalC)测定

抗GalC检测试剂盒;DAKO EPOS)检测少突胶质细胞类型及代谢状态。简而言之，脱亲和-再水化切片在RT下浸泡在3%过氧化氢甲醇溶液中10分钟，在121℃的柠檬酸缓冲液中蒸压5分钟，在RT下与一抗孵育60分钟，在RT下加入二抗孵育30分钟，用DAB观察。

在临床检查中，所有16只患有天然CD的狗都表现出不同程度的神经表现。一些狗只表现出轻微的症状，而另一些则表现出与上述症状相似的严重特征[15，16，20.最常见的表现为冷漠(16/16)、厌食(16/16)、肌阵挛(16/16)、癫痫(12/16)、共济失调(10/16)、四肢屈伸(8/16)、眼球震颤(7/16)、踏板运动(5/16)和视屈伸(5/16)(表1)．对照组动物对CDV抗体呈阴性反应。对照组动物没有表现出任何神经症状。

被cvv感染的狗的脑组织的改变涉及各种细胞和神经纤维。各种脑组织细胞的变化主要为CDV感染、变性和凋亡。神经纤维主要表现为脱髓鞘病变(多灶性小液泡)，部分神经元轴突逐渐萎缩消失(形成大液泡)。CDV在所有脑组织细胞中均有不同程度的嗜细胞性，脑内各类细胞也均发生凋亡。CDV感染越严重，凋亡细胞越多。

脑血管内皮细胞、星形胶质细胞和室管膜细胞是脑血管严重感染的细胞。强烈的阳性反应性内皮细胞，显示棕色细胞或深棕色细胞(图。1A)，主要在脑组织小血管中进行抗cdv免疫染色。感染加重后，内皮和星形细胞足突呈线状符号，环绕在血管内，抗CDV免疫染色显示强烈的阳性反应，提示CDV感染了这些细胞。星形胶质细胞也被染色为强烈的阳性细胞，并变成深棕色的星形图案(图。1B)抗CDV免疫染色，表明CDV已经感染星形胶质细胞，并开始在星形胶质细胞的细胞质中复制。抗gfap染色显示脱髓鞘区星形胶质细胞代谢紊乱，胞浆中存在多种抗gfap强阳性物质(对照组弱阳性反应)(图。1C).一些小血管的内皮细胞和血管周围的星形胶质细胞有强烈的阳性反应(图。1D) TUNEL染色，显示深棕色细胞，显示凋亡。

MGP染色显示血管周围部分内皮细胞和星形胶质细胞核固缩，呈暗红色，提示细胞核仁RNA凝结，处于凋亡状态。

对照组的室管膜细胞呈柱状细胞，自由表面有微绒毛(图2)。2A)抗cdv和TUNEL染色均呈阴性反应。而在cdv感染犬中，室管膜细胞变为立方或扁平细胞，细胞膜表面微绒毛消失，细胞质和细胞核中可见数个嗜酸性包涵体(图)。2B).室管膜细胞嗜酸性包涵体中观察到抗cdv阳性反应物质(图;2C)，证明CDV感染室管膜细胞，因为嗜酸性包涵体是由CDV复制和代谢产生的。当细胞严重感染时，大量室管膜细胞凋亡死亡，细胞核呈深棕色(图)。2D) TUNEL染色。

脑组织中继发的cdv感染细胞为少突胶质细胞、小胶质细胞和神经元，主要位于脑干白质神经核。对照组脑干少突胶质细胞沿神经纤维呈串珠状排列，抗cdv和TUNEL染色阴性，GalC染色弱阳性。相比之下，在cdv感染的犬中，脱髓鞘区域的一些少突胶质细胞处于分散状态，抗galc染色有强烈的阳性反应，这可能表明双极未成熟少突胶质细胞增加(图)。3.然而，在一些初始脱髓鞘区域，多极成熟少突胶质细胞通过凋亡减少，MGP表现出强烈的阳性反应(图2)。3.B)和TUNEL染色(图;3.C).少突胶质细胞凋亡后，脑干及大脑白质可见局部及弥漫性脱髓鞘，在HE染色的脱髓鞘区可见大量小空泡及较大空泡。脱髓鞘区可见少量小胶质细胞，少突胶质细胞中可见少量小胶质细胞，部分小胶质细胞抗cdv和TUNEL染色呈强阳性反应。白质神经核中的部分神经元常被CDV感染，其中核浓缩的萎缩神经元表现出强烈的抗CDV阳性反应(图)。3.D)和TUNEL染色，表明CDV严重感染的神经元凋亡。

轻度cdv感染的神经元为锥体细胞和浦肯野细胞。当感染严重时，整个皮质物质被CDV感染，其中大量CDV感染阳性细胞(图。4A)，包括位于脑膜、分子层、外颗粒层和锥体层的细胞，通过抗cdv染色检测。位于灰质的锥体细胞，特别是较大的锥体细胞常被CDV感染，CDV感染后锥体细胞退行性病变，表现为卫星现象和噬神经现象(图)。4B)，或缩小，核致密，呈暗红色(图。4C) MGP染色。部分锥体细胞抗cdv免疫染色呈阳性反应，并出现凋亡(图。4D) TUNEL染色，提示CDV严重感染的锥体细胞易发生凋亡。部分锥体细胞凋亡后，脑白质出现大的空泡样脱髓鞘，尤其是脑灰质下。此外，一些浦肯野细胞也被CDV感染，表明核浓缩的缩核细胞，即细胞核周围染色质压实，在浦肯野细胞层抗CDV染色反应呈阳性。

脑组织细胞凋亡与脱髓鞘发病机制的关系

CDV感染犬的脑组织脱髓鞘是一种常见的脑病，可以认为是由CDV引起的特征性脑损伤。有研究探讨了CD犬脱髓鞘的潜在机制，发现神经纤维脱髓鞘主要与星形胶质细胞和少突胶质细胞有关。本研究证实了神经元和胶质细胞的凋亡与脑组织脱髓鞘有关。多项研究[13，27，28]表明星形胶质细胞是中枢神经系统中CDV的主要目标。在白质中，被髓鞘包围的星形胶质细胞积极影响神经元和少突胶质细胞的存活。受感染的星形胶质细胞不能产生神经元和少突胶质细胞所需的神经营养因子。因此，cdv感染的星形胶质细胞可能在脱髓鞘机制中起重要作用。以往的研究[29，30.]证明星形胶质细胞是cdv感染的主要靶点，抗cdv免疫染色阳性反应强。本研究中，cdv感染犬星形胶质细胞代谢紊乱表现为强阳性反应，而对照犬白质经抗gfap免疫技术染色呈弱阳性反应，脱髓鞘部位尤甚。许多星形胶质细胞TUNEL染色呈强阳性反应，表明阳性反应的星形胶质细胞已发生凋亡。就像麻疹病毒[31]， CDV可破坏胶质纤维酸性蛋白细胞骨架，引起星形胶质细胞凋亡。因此，当一些星形胶质细胞凋亡死亡时，神经营养因子没有传递到少突胶质细胞以维持髓鞘，脱髓鞘过程逐渐促进。

少突胶质细胞与乳糜泻犬的大脑脱髓鞘直接相关。在脱髓鞘区，负调控髓鞘基因转录，抑制少突胶质细胞特异性酶活性[32]，少突胶质细胞变性和少突胶质细胞数量减少提示少突胶质细胞参与了急性犬瘟热脱髓鞘过程[33］．本研究发现脱髓鞘区少突胶质细胞紊乱，失去正常结构状态。多极成熟少突胶质细胞因凋亡而减少。而脱髓鞘区双极少突细胞前体细胞增多，抗glac染色显示GalC强烈阳性反应。Pearce-Kelling等报道双极少突细胞对某些CDV株表现出高敏感性[34］．

类似地，另一种从成年犬大脑中获得的双极细胞群在体外研究中显示了对CDV的易感性增加[35］．大量白质CDV感染可导致少突胶质细胞凋亡，脱髓鞘部位TUNEL染色表达强阳性细胞。少突胶质细胞能产生许多髓鞘形成所必需的物质。因此，它们在维持髓鞘的完整性方面具有重要的功能。此外，本研究发现灰质中许多锥体细胞和神经核内神经元发生凋亡，TUNEL染色显示强烈的阳性反应。轴突退化、溶解、死亡，导致轴突周围髓鞘解体，脱髓鞘区形成大液泡[30.］．

脑组织细胞凋亡与CDV感染的关系

以往的研究[29，36，37，38已经证明，CDV主要通过血液和脑脊液感染脑组织。本研究表明，脑组织中细胞凋亡与cdv感染途径有关。细胞与CDV接触越早，CDV感染越严重，凋亡越明显。本研究表明，血源性感染比脑脊液感染更早、更严重，感染细胞较多。Krakowka等人证实CDV的神经元侵袭主要通过血行途径发生[39］．萨默斯等人。[40和Axthelm等人。[41]表明病毒抗原首先在脑毛细血管组织和静脉内皮细胞中检测到，在PI 5和6天和/或血管周围淋巴细胞、星形胶质足突和8天的周细胞中检测到。本研究发现CDV随血液循环侵入脑组织小血管内皮细胞并在内皮细胞内复制，导致内皮细胞内CDV大量存在，抗CDV免疫染色阳性反应强烈。这种病理性的细胞病变最终可通过细胞凋亡导致严重cdv感染的内皮细胞死亡。抗CDV和TUNEL免疫染色显示，血管内皮中的CDV也可通过星形胶质细胞足突感染星形胶质细胞，导致星形胶质细胞严重感染和凋亡。在这种模式下，CDV可以破坏血脑屏障，进入脑组织，并感染其他神经元和胶质细胞。

Vandevelde等研究了CDV在脑组织中的感染途径，发现室管膜和室管膜下白质感染可被CDV感染[42]，表明脑组织可以通过脑脊液途径感染。此外，可以观察到脉络膜丛内皮细胞的复制cdv感染，子代病毒释放到脑脊液中，随后是室管膜感染，病毒扩散到室管膜下白质[42，43］．本研究发现，CDV感染室管膜细胞的病理形态由柱状转变为立方形，再转变为扁平细胞，其中一些嗜酸性包涵体经抗CDV免疫染色在其细胞质中表现出强烈的阳性反应。CDV感染严重时，心室表面室管膜细胞大量凋亡死亡，TUNEL染色呈强阳性。这一现象说明脑脊液中的CDV侵入室管膜细胞并复制，导致室管膜细胞感染和凋亡。在这种方法中，CDV通过破坏室管膜屏障进入室管膜下白质。由此可见，脑室周围的脱髓鞘比脑组织白质的其他部位更为严重。

此外，本研究通过对CDV犬不同部位的大脑、脑干和小脑切片的调查，发现神经核或灰质的神经元凋亡和白质的脱髓鞘在脑组织中是随机发生的，并没有特定的脑组织区域和位置是病变的某个恒定区域。因此，在临床实践中，虽然临床上在CDV感染犬中检查了许多不同的神经体征，但没有特定的神经表现可以作为CD的诊断症状。另一方面，据报道，乳糜泻狗的神经体征是由其他因素引起的[13，44］．

据我们所知，这项研究首次表明自然CDV感染导致各种脑组织细胞凋亡。HE、甲基绿pyronin、TUNEL技术、免疫sABC和免疫组化的数据支持细胞凋亡在脱髓鞘发病机制中起重要作用。CDV可感染脑血管内皮和血管周围的星形细胞食物过程。严重的感染会导致细胞凋亡，导致血脑屏障损伤，病毒进入灰质和白质。CDV还可侵入室管膜细胞，诱导细胞凋亡，破坏脑室屏障，侵入脑白质。进入脑组织的CDV可继续感染神经胶质细胞、神经核内的一个神经元、锥体细胞、浦肯野细胞等，并引起部分严重感染细胞凋亡。由此可见，脑细胞凋亡主要与CDV的传播途径和嗜细胞性有关。星形胶质细胞、少突胶质细胞和部分神经元的凋亡在犬急性乳糜泻脱髓鞘的发病机制中起重要作用。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

CDV:

犬瘟热病毒

CD:

犬瘟热

中枢神经系统:

中枢神经系统

他:

Hematoxylin-eosin

轻拍:

Diaminobenzidine

TUNEL:

TdT介导的dUTP缺口端标记

MGP:

甲基green-pyronin

NP:

核衣壳蛋白

PBS:

磷酸盐缓冲盐水

RT:

室温

不适用。

本项目由河南省科技支撑计划资助项目(202102110094)资助。

作者指出

1. 潘耀谦和王帅对这项工作做出了同样的贡献

作者及隶属关系

1. 新乡学院生命科学与基础医学学院，河南新乡453003

   潘耀谦，李鹏，岳峰，张艳芳，刘兴友

2. 新乡医学院基础医学院，中国新乡

   帅王

3. 南达科他大学桑福德医学院基础生物医学学部，佛州，57069，美国

   Bo锅

贡献

研究构想及监督研究进展:YP和XL。进行实验:YP, SW, PL, FY, YZ。样本采集:PL, FY, YZ, BP。草稿:YP和XL。所有作者都审阅了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Bo锅或Xingyou刘．

伦理批准并同意参与

实验动物研究遵循新乡学院动物伦理委员会批准(批准文号20170305)的研究方案进行。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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