基于itraq的定量蛋白质组学揭示了牛病毒性腹泻病毒感染MDBK细胞的蛋白质组谱

背景

牛病毒性腹泻(BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的一种急性传染性疾病。尽管使用了疫苗和消灭项目，BVDV在过去几年中仍然给养牛业造成严重的经济损失。本研究从感染宿主细胞不同时间点蛋白表达水平的角度初步分析致病机制，以阐明BVDV相关的感染过程。

方法

我们使用等压标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术，结合液相色谱-串联质谱(LC-MS /MS)方法，对BVDV nadl感染的MDBK细胞和未感染的细胞进行定量蛋白质组学比较。通过功能注释推断蛋白质的功能，并通过KEGG通路分析探索它们在代谢过程中的参与，以确定它们的相互作用。

结果

在感染后12、24、48 h, BVDV nadl感染的MDBK细胞中差异表达的蛋白有357个(47.6%下调，52.4%上调)，101个(52.5%下调，47.5%上调)，66个(21.2%下调，78.8%上调)(倍数变化> 1.5或< 0.67)。GO分析表明，差异表达蛋白(DEPs)主要参与代谢过程、生物调控和定位。KEGG富集分析显示，在BVDV nadl感染的不同阶段，一些参与调节BVDV nadl感染和宿主抗性的信号通路均显著富集(P < 0.05)，如内吞信号通路、FoxO信号通路、同源重组信号通路和溶酶体信号通路。

结论

这些结果表明，DEPs在BVDV nadl感染的MDBK细胞中具有广泛的调节作用;为BVDV感染后宿主细胞蛋白质组学的研究提供了大量的资源。

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的细胞病变情况，将其分为细胞病变型(CP)和非细胞病变型(NCP) [1］．这种病毒还能在物种之间传播，感染各种动物，如猪、羊、鹿和骆驼[2］．虽然被称为腹泻病，但对牛的危害不仅限于腹泻，还会严重影响生殖系统、呼吸系统、消化系统，以及产奶量的发生[3.］．该病可通过直接或间接接触传播。感染BVDV的怀孕奶牛可通过胎盘感染胎儿，导致流产和先天性犊牛死亡，或者它们可能生下看似正常但持续感染的动物。BVDV在世界范围内广泛传播，尽管使用了疫苗和根除计划，它仍然给养殖业造成严重的经济损失。近年来，流行病学调查发现，中国大型养牛场BVDV的患病率持续上升，部分养牛场抗体阳性率甚至高达90%。

随着蛋白质组学技术的发展，它在研究病毒与宿主细胞相互作用方面具有突出的优势。然而，关于MDBK细胞系对BVDV NADL感染反应的蛋白质组学信息的研究非常有限。蛋白质组学最初是由澳大利亚学者Wilkins在1994年的双向电泳会议上提出的。利用蛋白质组学技术对多物种样品进行高通量分析，从细胞内蛋白质组成、整体水平活性模式和蛋白质相互作用的研究，可以得到样品中蛋白质的本构表达、质量评价水平和修饰状态。这样可以揭示蛋白质的功能和蛋白质之间的潜在关系，从而发现新的蛋白质。蛋白质组学方法可以有效地对蛋白质进行大规模分析，更有助于深入探索各种疾病的发病机制。定量蛋白质组学方法可用于筛选和寻找由任何因素引起的样品间的差异表达蛋白，主要用于细胞或组织中蛋白质表达差异的相对定量分析，如差异凝胶电泳(DIGE) [4]，所有理论片段离子(SWATH)的顺序窗口采集。结合生物信息学揭示细胞的生理和病理功能，还可以定性和定量分析某些关键蛋白。

等压标签相对和绝对定量(iTRAQ)结合串联质谱(LC-MS /MS)已经成为一种更强大的蛋白质组学定量方法，因为它比传统的蛋白质组学方法更敏感和精确[5]，尤其用于检测样品中低丰度蛋白质定量。近年来，iTRAQ的定量蛋白质组学技术被应用于病毒-宿主相互作用的研究[6，7，8］．然而，利用高通量方法研究BVDV NADL感染后MDBK细胞蛋白质组学变化的研究很少。

本研究采用iTRAQ等压标记结合LC-MS /MS定量蛋白质组学技术，对BVDV NADL感染MDBK细胞的DEPs进行研究分析，揭示BVDV NADL感染后宿主对病毒入侵的反应变化，揭示病毒感染的发病机制。这些结果不仅增强了我们在蛋白质水平上对bvdv -宿主相互作用的理解，而且还为潜在的抗病毒靶点指明了方向。

细胞培养

本研究使用的MDBK细胞系(不含BVDV和抗BVDV抗体)购自中国科学院型培养馆藏(中国上海)，保存于石河子大学生命科学学院动物基因工程实验室。将储存的MDBK细胞从液氮中取出，在37°C下快速熔化。细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基(DMEM;10%胎牛血清(FBS;Hyclone)。本研究的所有材料都远离BVDV和抗BVDV抗体。BVDV标准株NADL来源于国家食品药品监督管理局(北京，中国)。

病毒接种

底表面覆盖上述培养的MBDK细胞(聚集量约75 ~ 85%)后，将含10% FBS的DMEM改为不含血清的培养基，用BVDV NADL (100 TCID50/ 0.1 ml)感染细胞。因此，我们要求在感染前准备BVDV NADL 50%的组织培养感染剂量(TCID50)。感染处理两小时后，我们用含有血清(5%胎牛血清)的新鲜培养基培养。在感染后12 h、24 h和48 h收集这些细胞。我们给对照组提供等量的PBS。我们通过观察细胞病变效应(CPE)来验证BVDV感染。

样品制备、蛋白质消化和肽的iTRAQ标记

我们用细胞刮板收集在12、24和48 hpi感染的BVDV和未感染的MDBKs，然后在1500 × g下离心10 min，用PBS清洗。收集的细胞用含100 mm NH的裂解缓冲液裂解₄HCO_3.(pH 8)， 6 M尿素和0.2% SDS，然后在冰上超声5min。然后，裂解液在12000xg下4℃离心15分钟，将上清液取至清洁管中。样品的提取物用10 m MDTT还原1小时，然后用足量的碘乙酰胺在室温下在黑暗中烷基化1小时。将样品与预冷丙酮涡旋完全混合，在- 20℃下孵卵至少2小时，离心后收集沉淀。用冷丙酮洗涤2次后，用溶解缓冲液溶解颗粒。其中含有0.1 M碳酸氢铵(TEAB, pH 8.5)和6 M尿素，然后测定浓度[9］．蛋白溶液(120 μg)按比例用50 mM TEAB稀释。用胰蛋白酶金消化后，用Strata X C18色谱柱对肽进行脱盐。干燥后用20 μl 1 M TEAB溶解。按照制造商的说明使用iTRAQ试剂8-plex Kit进行肽标记。

肽分离和LC-MS /MS

所有标记样品等体积混合、脱盐、冻干。流动相A和B用于梯度洗脱。在Rigol L3000高效液相色谱系统中，采用C18色谱柱(Waters BEH C18 4.6 × 250 mm, 5 μm)进行分离，柱温50℃。在UV 214 nm下监测洗脱物。每分钟收集一管，并组合成10个馏分。大部分组分在真空下干燥，然后，在0.1% (v/v)甲酸(FA)水中重组。

样品注入自制的C18纳米捕集柱(2 cm × 75 μm, 3 μm)。然后在自制的分析柱(15 cm × 150 μm, 1.9 μm)中采用线性梯度洗脱法进行分离。通过Q Exactive HF-X质谱仪(Thermo Fisher)对分离的肽进行分析。采用Nanospray Flex™(ESI)离子源，2.5 kv喷雾电压，320℃温度离子输送毛细管。

数据分析

从每个部分得到的光谱分别在牛牛数据库(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-99/fasta/bos_taurus/dna/Bos_taurus.ARS-UCD1.2.dna_rm.toplevel.fa.gz)．所鉴定的蛋白质包含至少1个FDR小于1.0%的独特肽。iTRAQ定量采用报告定量法(iTRAQ 8-plex)。蛋白定量结果经Mann-Whitney检验进行了统计和正确分析。由于实验组与对照组部分蛋白的定量结果存在显著差异(p < 0.05, FC > 1.5或< 0.67 ([fold change, FC])，因此将这些蛋白定义为差异表达蛋白(DEPs)。

生物信息学分析

所有差异蛋白被映射到基因本体论数据库(http://www.geneontology.org/)使用interproscan-5程式[10]，计算每一项的蛋白质数量，然后进行超几何检验，发现与所有蛋白质背景相比，GO条目中差异蛋白含量显著丰富[11］．使用KEGG Mapper平台中的搜索路径工具提取路径分析(http://www.genome.jp/kegg/mapper.html) [7］．StringDB蛋白质相互作用数据库(http://string-db.org/)用于鉴定蛋白的相互作用分析。然后对差异蛋白序列进行blast比对，提取序列得到相应的相互作用信息，从而构建网络图[12］．

mdbk中BVDV NADL感染的确认

成功的BVDV NADL感染通过观察细胞病变效应(CPE)得到验证。结果如图所示。1．MDBK细胞感染后，在12 hpi倒置显微镜下观察到细胞聚集，即将发生更明显的细胞病变。在感染后24 hpi，观察到严重的细胞病变，包括细胞聚集和变圆，一些细胞脱落导致网络拉扯。病毒感染细胞的时间越长，细胞病变的变化就越严重，最终所有细胞都死亡并脱落(图。1)．

iTRAQ LC-MS /MS鉴定差异表达蛋白

考虑到宿主对病毒感染反应的动态变化，我们收集了MDBK细胞12 hpi, 24 hpi和48 hpi的全细胞裂解液。本研究检测了差异表达蛋白，并分析了其相对变化率。在BVDV nadl感染组和模拟感染组中共发现3191个蛋白质(附加文件)1:表S1)。通过控制折叠变化大于1.5或小于0.67且p值< 0.05，我们获得了BVDV nadl感染MDBK细胞中差异表达的蛋白(附加文件2:表S2)。在感染后表现出显著不同表达水平的蛋白质中，357、101和66个蛋白质在12、24和48 hpi相对于未感染的MDBK细胞表达差异。在12 hpi的357个dep中，187个蛋白上调，170个蛋白下调。在12 hpi和24 hpi感染48 h的MDBK细胞中，有354和108个蛋白表达差异。此外，我们还展示了分层聚类分析和c均值聚类图如图。2a、b。

差异表达蛋白的GO分析

为了了解失调蛋白在BVDV NADL感染中可能的生物学功能，我们对12、24和48 hpi上调和下调的蛋白进行了基因本体(GO)分析(附加文件)2:表S2)。结果表明，在12、24和48 hpi时，生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)分别富集320个、165个和94个。尤其在12 hpi时，MBDK细胞的过程最为活跃。对于12 hpi的失调蛋白，大部分差异表达蛋白集中在生物过程(BP)和细胞过程(BP)的调节、信号转导(BP)、染色体部分(CC)和分子功能调节(MF)(图。3.a).而细胞表面受体信号通路(BP)、中间纤维(CC)、细胞外间隙(CC)和snRNA结合(MF)主要富集于24 hpi(图。3.b).然后在48hpi的差异蛋白中，富集最多的GO项是细胞外区(CC)、中间丝(CC)和半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性(MF)(图。3.c).另一方面，感染早期(Cp_12hpi)与感染晚期(Cp_48hpi)的差异表达蛋白集中在细胞通讯(BP)、单生物信号(BP)和细胞核(CC)(图。3.d)。

差异表达蛋白的KEGG通路分析

为了实现不同的特定生物学功能，基因产物之间需要有秩序地相互配合。因此，KEGG数据库中丰富的通路信息将有助于我们了解蛋白质在系统层面的功能，如代谢通路、遗传信息传递和一些复杂的生物学功能，如细胞过程。图中显示了前20条路径。4．例如，在差异表达蛋白中，类固醇生物合成、神经活性配体-受体相互作用、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、肾素-血管紧张素系统和其他蛋白在BVDV nadl感染的MDBK细胞中处于12 hpi(图。4a). 24 hpi时BVDB nadl感染的MDBK细胞中涉及糖鞘脂生物合成-神经节系列、鞘脂代谢、醚脂代谢、其他糖基降解等(图。4b). BVDV nadl感染的MDBK细胞在48 hpi时参与了泛醌和其他萜类醌生物合成、泛酸盐和辅酶a生物合成、神经活性配体-受体相互作用、醚脂代谢等(图。4c).与感染48 h的MDBK细胞相比，BVDB nadl感染的MDBK细胞在24 hpi时含有抗坏血酸和赤氨酸代谢、甾体生物合成和组氨酸代谢(图。4d)。

差异表达蛋白的亚细胞定位分析

在感染后表达水平有显著差异的蛋白中，有357、101和66个蛋白存在差异表达。统计分析各组不同蛋白的亚细胞定位比例，如图所示。5．结果显示，在BVDV NADL感染后12 hpi, 36.48%的差异表达蛋白为细胞核定位，17.60%为细胞质定位，8.85%为线粒体定位，8.15%为细胞外定位，7.73%为内质网定位(图2)。5a). 24 hpi时差异表达蛋白在细胞核中占31.08%，在细胞质中占20.27%，在线粒体中占14.86%，在外细胞中占6.67%(图。5b). 48 hpi时差异表达蛋白在细胞核中占24.49%，在细胞质中占22.45%，在胞外占20.41%，在内质网占12.24%。5c)。

蛋白质-蛋白质相互作用网络

我们利用STRING数据库对BVDV NADL感染后不同时期的差异表达蛋白进行网络分析，了解它们在BVDV发病中的相互作用。这些不同蛋白质之间的相互作用可以通过细胞景观软件可视化。从网络中，我们可以直观地发现一些被称为关键蛋白分子的蛋白质与许多其他蛋白质相互作用，从而了解某些蛋白质的重要性(图。6a - c)。

结果表明，BVDV感染nadl后不同阶段的调节细胞因子存在差异。FAU泛素样蛋白与核糖体蛋白S30融合蛋白(FAU)、热休克蛋白家族A (Hsp70)成员8 (HSPA8)、纤溶酶原(PLG)分别在12、24和48 hpi时相互作用最强。在12 hpi时，参与核糖体途径的FAU与7种显著不同的蛋白质相互作用(图。6a).而HSPA8作为MAPK信号通路细胞因子的一员，在24 hpi与其他8个下调蛋白相互作用。有一组强相互作用的蛋白质参与RNA加工、核酸结合、RNA聚合酶II启动子转录负调控和蛋白结合以应对BVDV NADL感染，包括ptbp1 - hnrnpmhspa1a - prpf8 - hexim1 - hnrnpul1(图2)。6b).在48 hpi时，参与神经活性配体-受体相互作用通路的PLG与11个上调蛋白相互作用。两组蛋白相互作用较强，分别为参与蛋白水解和半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性的PLG-CCNB2-KNG1-ALB-SERPINA1和参与丝氨酸型内肽酶活性、蛋白水解、蛋白均聚、核酸结合的PLG-KNG1-CCNB2-PRNP-HNRNPUL1-SRSF2-PRPF8(图)。6c)。

MDBK细胞目前广泛应用于BVDV的研究，很少有研究人员对BVDV感染MDBK细胞的蛋白质组学进行研究。BVDV的研究和开发处于相对滞后的状态。通过研究BVDV感染MDBK细胞的差异表达蛋白，我们可以系统地了解病毒与宿主细胞之间的相互作用，寻找BVDV感染的宿主细胞免疫调节相关蛋白。此外，本研究也可为BVDV的防治提供新的思路，并为其它猪瘟病毒属病毒的研究提供参考。迄今为止，通过世界各地的研究，BVDV有许多不同的亚型[13］．由于所有这些类型的研究都比较困难，我们选择了中国畜牧业常用的BVDV-1 NADL [14］．

目前，各种蛋白质组学方法已被广泛用于研究病毒与宿主细胞之间的相互作用[8，15］．等压相对和绝对定量标签(iTRAQ)是美国应用生物系统公司ABI开发的一种肽体外标记技术。iTRAQ作为一种新的蛋白质组定量技术，可以比传统的蛋白质定性技术进行更准确有效的高通量蛋白质组分析。近年来，基于itraq的蛋白质组学技术已多次应用于病毒学研究。

病毒与宿主细胞的相互作用是一个非常复杂的过程，涉及大量的蛋白质表达变化和信号转导[16］．本研究采用iTRAQ结合串联质谱(LC-MS /MS)技术，分析了BVDV NADL感染3个不同时间点MDBK细胞的蛋白表达谱。在本研究中，基于折叠变化> 1.5或< 0.67和p值< 0.05，在12、24和48 hpi共鉴定出357、101和66个dep。从我们的结果来看，宿主细胞中的蛋白质存在显著差异。这表明DEPs在BVDV nadl感染的MDBK细胞中起着重要的调节作用。大量蛋白质在每个时期都有上调。同时，上调蛋白的表达量远高于下调蛋白，这在48 hpi时表现得尤为明显。这表明宿主在不同时间点对BVDV NADL感染具有抵抗作用。进一步分析这些蛋白的功能有助于了解MDBK细胞与BVDV NADL之间的关系。为宿主细胞对BVDV NADL感染的反应及疫苗的研制提供了理论依据。

基于GO注释对这些失调蛋白进行功能分析，GO项在12 hpi、24 hpi和48hpi的顺序完全不同。研究还表明，在BVDV NADL感染的不同时间点，感染细胞的反应也不同。实际上，大量的差异表达蛋白集中在生物过程(BP)和细胞过程的调控以及12 hpi的信号转导中。在24 hpi时，氧化石墨烯含量最高的是细胞表面受体信号通路、中间纤维和细胞外间隙。但在感染后期，生物学过程中差异表达蛋白没有明显富集。GO注释和通路分析表明，这些蛋白处于多种细胞生物学过程中，包含代谢通路、蛋白在内质网的加工、ECM受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架规则等。通过蛋白相互作用网络分析，我们推测MAPK信号通路可能在BVDV nadl感染细胞中发挥作用。本研究结果为进一步研究BVDV的发病机制和抗病毒靶点的选择奠定了基础。

1. 1.

   参与免疫系统的差异表达蛋白

非特异性免疫系统是指人体固有的正常生理防御功能，能对各种病毒的感染做出相应的免疫反应。模式识别受体(Pattern recognition receptor, PRRs)是先天免疫中免疫受体的代表，可识别细胞质中的病毒RNA [17］．它实际上在抗病毒自然免疫中起着重要作用[18］．在本研究中，大量DEPs参与toll样受体(TLR)、核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体(NLR)和MAPK信号通路，包括无名指蛋白31 (RNF31)、ANTXR细胞粘附分子2 (ANTXR2)、肿瘤蛋白p53结合蛋白1 (TP53BP1)、caspase 8 (CASP8)和胰岛素受体(INSR)。MAPK家族在细胞生长、分化和炎症等生理和病理过程中发挥调节作用。许多研究表明，RLR(视黄酸诱导基因-Ι(RIG-I)样受体)、TLR和NLR信号通路在黄病毒感染细胞中起着重要的调控作用[19，20.］．

我们发现，在BVDV NADL感染后，一些参与免疫反应的蛋白质的表达发生了改变，如干扰素调节因子(IRFs)。IRFs是一种多功能转录因子，可特异性结合干扰素(IFN)基因启动子和干扰素刺激反应基因(ISG)中的干扰素刺激反应元件(ISRE)。因此，IRFs在人体抗病毒感染和调节细胞生长方面具有重要意义。从我们的研究数据来看，干扰素调节因子2 (IRF2)的表达明显上调。IRF2是乳腺癌侵袭转移的重要调控因子;但其在抗病毒过程和免疫调节中的作用还有待进一步研究。

1. 2.

   参与细胞骨架和ecm受体相互作用的差异表达蛋白

细胞形态、细胞运动和细胞间粘附是由细胞骨架蛋白维持的。此外，细胞骨架在细胞器定位和囊泡运输中也起着关键作用。值得一提的是，细胞骨架网络在病毒感染过程中也起着促进作用。宿主细胞被病毒感染后，其细胞骨架会断裂甚至解体[21］．在调节肌动蛋白细胞骨架的8个DEPs中，整合素亚基β 5 (ITGB5)、ENAH肌动蛋白调节因子(ENAH)和Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子7 (ARHGEF7)显著上调。

在本研究中，整合素亚基β5 (ITGβ5)、IV型胶原α 1链(COL4A1)和syndecan 1 (SDC1)显著上调。整合素作为细胞外基质细胞与细胞内肌动蛋白骨架之间的跨膜接头，将细胞外基质与细胞内骨架网络连接成一个整体。一系列相关研究表明，ITGβ5的异常表达与各种疾病的病理过程密切相关。ITGβ5在多种疾病中可促进血管的形成。它还能与内皮生长因子受体2 (VEGF2)相互作用，抑制细胞凋亡。胶原蛋白是哺乳动物中数量最多、分布最广的功能性蛋白，在细胞运动、血管生成、组织形成或修复等方面发挥着重要作用。胶原蛋白也是ECM的主要成分，ECM与许多其他疾病有关，包括Ehlers-Danlos综合征、Kniest发育不良、Alport综合征和某些动脉瘤[22］．不同类型的胶原蛋白在BVDV NADL感染中是否具有多种不同的功能，目前尚不清楚。在BVDV nadl感染后，我们发现病毒滴度为48 hpi的细胞发生了很多明显的病理变化。然而，实验结果并未表明MDBK细胞中与细胞骨架和ecm受体相互作用相关的蛋白能够促进BVDV NADL的增殖和释放。

1. 3.

   参与内质网蛋白加工的差异表达蛋白

内质网是蛋白质合成和成熟的重要组成部分。内质网存在于许多分子伴侣中，帮助蛋白质折叠和组装[23］．大量研究表明，病毒感染不仅会改变内质网，还会激活未折叠蛋白反应(UPR)，从而促进病毒复制[24，25］．在我们的研究中，有14个DEPs参与了内质网蛋白的加工。其中，内质网凝集素1 (ERLEC1)和凝集素与甘露糖结合1 (LMAN1)均在48 hpi上调。此外，泛素偶联酶E2J1 (UBE2J1)在12 hpi上调。结果表明，DnaJ热休克蛋白家族(Hsp40)成员A2 (DNAJA2)、热休克蛋白家族A (Hsp70)成员8 (HSPA8)和热休克蛋白家族A (Hsp70)成员1A (HSPA1A)在24 hpi时表达下调，而DnaJ热休克蛋白家族(Hsp40)成员B4 (DNAJB4)在12hpi时表达显著上调。热休克蛋白(Heat shock protein, HSP)是一类高度保守的蛋白家族，其表达在正常情况下受到机体或细胞的抑制，在不良环境因素的刺激下受到抑制[26］．它具有多种生物学功能，包括细胞蛋白自稳定、抗凋亡、抗氧化、协同免疫等。例如，HSP70在各种DNA病毒和RNA病毒感染中高表达，并抑制病毒复制[27，28］．热休克蛋白活性降低会导致遗传性外周运动神经病变、阿尔茨海默病等疾病的发生[29］．本研究发现BVDV NADL感染后24 h HSPA8和HSPA1A明显下调，可能导致宿主出现异常的神经症状。由于热休克蛋白参与蛋白质折叠，内质网应激反应中UPR信号的激活可能在特定的病毒功能中发挥作用。因此，内质网应激蛋白可能对许多病毒的复制也很重要[25］．病毒进入靶细胞是病毒繁殖最重要的步骤之一，因此需要进一步研究这些差异蛋白在BVDV NADL感染后的具体作用。

1. 4.

   参与翻译的差异表达蛋白

大多数翻译相关蛋白在BVDV NADL感染过程中表达上调。在核糖体蛋白中，糖浆核糖体生物发生因子1(TCOF1)、核转运因子2类出口因子2(NXT2)、核糖体蛋白L37(RPL37)、核糖体蛋白L29 (RPL29)、线粒体核糖体蛋白S18A(MRPS18A)在感染早期均上调。真核翻译起始因子4E结合蛋白1 (EIF4EBP1)、真核翻译起始因子4E (EIF4E)和真核翻译起始因子3亚基F (EIF3F)作为翻译起始因子在BVDV nadl感染过程中上调。我们假设BVDV NADL会利用MDBK细胞的蛋白质合成系统产生大量的病毒蛋白。

1. 5.

   参与代谢过程的差异表达蛋白

研究表明，病毒感染可显著改变宿主细胞的细胞代谢[30.，31］．在我们的研究中，我们发现许多参与代谢过程的蛋白质在BVDV nadl感染的MDBK细胞中表达不同。59个差异表达蛋白(9.14%)被分类为代谢途径。这些蛋白主要参与糖酵解、丙酮酸代谢和柠檬酸循环(TCA循环)。在这些代谢途径中的蛋白质中，丙酮酸脱氢酶E1 β亚基(PDHB)、乙醛脱氢酶7家族成员A1 (ALDH7A1)、乙醛脱氢酶3家族成员A2 (ALDH3A2)和丙酮酸激酶M1/2 (PKM)同时参与糖酵解和丙酮酸代谢。乙醛脱氢酶7家族成员A1 (ALDH7A1)和丙酮酸激酶M1/2 (PKM)在24 hpi时下调。丙酮酸脱氢酶E1 beta亚基(PDHB)、柠檬酸合成酶(CS)、ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)和异柠檬酸脱氢酶(NAD(+)) 3非催化亚基γ (IDH3G)参与了柠檬酸循环(TCA循环)。目前，病毒-宿主代谢的相互作用机制有待进一步研究。特别是代谢途径的关键基因如何调节病毒易感性值得考虑。这一过程为本研究提供了新的方向。 Antiviral drugs can be studied by studying how protein expression in metabolic pathways inhibits virus generation.

总之，通过iTRAQ分析，在BVDV nadl感染的MDBK细胞中鉴定出差异表达蛋白。更重要的是，我们在生物信息学分析的基础上描述和讨论了BVDV nadl感染的相关途径和蛋白。虽然在这项研究中发现的蛋白质的作用没有被研究，但这表明它们的全部或部分都在宿主-病毒相互作用中。因此，MDBK细胞对BVDV感染反应的分析为更好地理解BVDV以及其他黄病毒科病毒的发病机制提供了有价值的信息。

在当前研究期间生成和/或分析的数据集可根据合理要求从通信作者处获得。

BVD:

牛病毒性腹泻

BVDV:

牛病毒性腹泻病毒

DMEM:

杜尔贝科改良的Eagle 's Medium

MDBK:

马丁-达比牛肾

PBS:

磷酸盐缓冲盐水

的边后卫:

胎牛血清

TCID₅₀：

组织培养感染剂量

英国石油公司:

生物过程

答:

蜂窝组件

走:

基因本体论

iTRAQ:

等压标签的相对和绝对定量

KEGG:

京都基因和基因组百科全书

质/女士:

液相色谱-串联质谱法

不适用。

国家自然科学基金[31660718、U1803111]、兵团科技计划[2018BC011、2019AB034]、青年创新人才[2017CB003、CXRC201603、CXRC201806]、绵羊遗传改良与健康生产国家重点实验室基金[MYSKLKF201901]支持此项工作。

作者指出

1. 李亚欣、郭涛、王晓奎对这项工作做出了同样的贡献。

作者及隶属关系

1. 石河子大学生命科学学院，新疆石河子832003

   李亚欣，郭涛，王晓奎，倪伟，胡瑞瑞，崔玉英，米涛涛，胡胜伟

贡献

YXL、TG、XKW、WN和SWH构思设计了实验，对数据进行了分析和解释。YXL, TG, XKW, WN和SWH撰写了手稿。YXL, TG, XKW, RRH, YYC和TTM孵育细胞并收集样品。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到魏倪或Shengwei胡．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称不存在竞争利益。

出版商的注意

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