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人巨细胞病毒株TB40/E变异株在成纤维细胞和上皮细胞中繁殖的基因组序列

摘要

全基因组测序的出现揭示了常见的人类巨细胞病毒(HCMV)实验室菌株有主要的遗传缺陷,这是由成纤维细胞的连续传代引起的。特别是上皮细胞和内皮细胞由于基因突变而失去嗜性UL128UL130,或UL131A,它编码病毒粒子相关五聚体复合体(PC)的亚单位,对病毒进入这些细胞很重要,但对进入成纤维细胞不重要。内皮细胞适应菌株TB40/E具有相对完整的基因组,并已成为与野生型病毒非常相似的实验室菌株。然而,TB40/E存在多个异质种质和克隆变体,它们显示出一系列的序列和向性特性。在这里,我们报道了使用PacBio测序来阐明在ARPE-19上皮细胞上传代TB40/E株时发生的遗传变化,无论是在共识水平上还是在亚群内。长读数据也有助于检查突变之间的联系。与低效的ARPE-19细胞进入一致,在适应之前,至少83%的病毒基因组包含影响PC亚基的变化。相比之下,与PC进入内皮细胞和上皮细胞的重要性一致,适应后的基因组缺乏这些或其他影响PC亚单位的突变。序列数据还揭示了6个倒置重复区域的单个非编码替换,基因中的单个非同义替换UL26UL69US28,UL122,以及移码截断基因UL141.在影响蛋白质编码区域的变化中,只有在UL122被强力选中。这一变化导致编码蛋白IE2中D390H的取代,此前已涉及呈现另一种病毒蛋白UL84,这是病毒在成纤维细胞中复制所必需的。这一发现表明,IE2及其与UL84的相互作用对HCMV在上皮细胞中的复制具有独特的重要功能。

人巨细胞病毒(HCMV;物种人类乙型疱疹病毒5)在细胞培养中导致从小的替换、插入或缺失到大规模的缺失、重复和重排的突变。有些突变似乎是随机的,而另一些突变则持续破坏特定的基因,并在某些细胞类型或生长条件下赋予生长优势[123.].特别重要的是,突变总是在成纤维细胞的传代过程中出现,并改变三个相邻基因中的一个或多个,UL128UL130,而且UL131A1].这些突变阻止了病毒粒子表面由UL128、UL130和UL131A蛋白与糖蛋白H和L复合物组成的五聚体复合体(PC)的组装,该复合体对进入上皮细胞和内皮细胞很重要,但对进入成纤维细胞是可有可无的[45678].

许多常用的实验室菌株具有大量缺失以及各种破坏PC表达的额外突变,从而使病毒非上皮性和非内皮性[9].因此,研究已经转向使用遗传上更真实的菌株,如内皮细胞适应菌株TB40/E [10].然而,“TB40/E”这一名称被不加区别地应用于从原始TB40/E繁殖而来的异质砧木[10],以及由这些菌种所产生的细菌人工染色体(BAC)克隆所衍生的各种病毒[1112].这些病毒的序列和向性可能彼此之间以及与原始TB40/E株有显著差异。例如,克隆Lisa,一种从TB40/E原液中空斑纯化的病毒[13],有一个1bp插入UL128密码子69后产生移码[13],而广泛使用的BAC克隆TB40-BAC4在内含子之间携带单核苷酸取代UL128降低剪接效率、降低编码蛋白水平和降低上皮细胞感染效率的外显子2和3 [3.].相比之下,最近构建的BAC克隆TB40-KL7-SE没有明显的突变影响PC表达,同时具有内皮性和上皮性[12].

为了开始解决TB40/E储备的多样性和使用不同细胞类型繁殖的影响,TB40/E储备在原代人包皮成纤维细胞(HFF;TB40/EF,库存31,519)和进入视网膜色素上皮细胞(ARPE-19;ATCC®CRL-2302),效率较差[14]在ARPE-19细胞中传代了5次,产生了能够以类似效率感染HFF和ARPE-19细胞的原液(TB40/EE,原液SE2) [14].尽管有效进入,感染TB40/EE的ARPE-19细胞产生的无细胞病毒数量始终比HFF细胞产生的低100- 1000倍,这表明存在上皮细胞特异性的进入后限制。TB40/EE还表现出在ARPE-19细胞群中形成多核合胞体的倾向增加,这表明在感染期间诱导细胞-细胞融合的能力增强[14].

在目前的研究中,我们使用长读PacBio测序详细检查了可能与上皮细胞适应相关的基因变化。如前所述,从TB40/EF和TB40/EE无细胞病毒粒子中分离DNA [15].如前所述,HiFi SMRTbell文库的构建和测序在弗吉尼亚联邦大学的Genomics Core进行[16].使用PacBio SMRT-Link命令行包中的工具处理数据(https://www.pacb.com/support/software-downloads/)。TB40/EF(25,124)或TB40/EE(8,364)的双模聚合酶reads使用pbindex进行索引,使用数据集生成子读计数的XML文件,TB40/EF生成16,920个HiFi reads, TB40/EE使用CCS生成6,985个HiFi reads。与TB40/EE reads相比,TB40/EF约三倍的差异与DNA浓度的三倍差异是一致的,这反过来反映了TB40/EE感染的ARPE-19细胞释放的游离病毒水平降低[14].最终HCMV基因组组装通过参考引导从头组装,使用LoReTTA v0.1 (https:/bioinformatics.cvr.ac.uk/software/;[16TB40/E克隆Lisa (13;GenBank登录号KF297339.1)作为参考。然后使用小地图v2.17-r941将HiFi读取映射到各自的最终程序集[17],并且使用Integrative Genomics Viewer对reads比对进行可视化[18].共识基因组序列保存在GenBank中,登录号为MW439038 (TB40/EF)和MW439039 (TB40/EE),中位覆盖深度分别为202和43 reads/核苷酸。确定了这些序列之间的差异,并通过计算它们在reads中的出现次数来量化这些和其他在读比对中注意到的主要异质性。

HCMV基因组(236 kbp)由独特的长(Ul)和唯一短(U年代)区域,每个区域的两侧都有倒置的重复序列ab- ul-bʹʹcʹ- u年代-ca(质数表示的反向重复一个b,c).比较TB40/EF和TB40/EE一致性基因组序列,在非编码区域发现了12个单核苷酸取代和1个单核苷酸缺失一个b,或c反向重复序列(表1).其中7个基因在反向重复序列中被复制(每一个在/ʹ/b / bʹ,c / cʹ),这些基因座只代表六个独特的差异。尽管这些突变位于非编码区,但显著的富集水平表明它们可能在ARPE-19细胞中提供了选择优势。然而,据报道,倒置重复序列在HCMV传代过程中特别容易发生突变,变化通常在所有副本中复制,这可能是重组的结果[1].

表1 TB40/EF与TB40/EE非编码区核苷酸差异

TB40/EF和TB40/EE一致性基因组序列的比较和read比对的检查也发现了编码区域的变化(表4)2).鉴于TB40/EF观察到的上皮细胞进入效率低,突变破坏UL128UL130,UL131A(分别编码PC亚基蛋白UL128、UL130和UL131A)。事实上,TB40/EF的靶向测序之前已经发现了一种抑制基因替代,可将UL128停止密码子(TGA)到TTA(编码亮氨酸),从而将UL128延长19个残基[14].尽管TB40/EF的一致基因组序列没有反映这种突变,但对读取频率的检查显示存在一个亚群体,其中30%的TB40/EF基因组包含这种抑制突变。进一步检查确定了另外两个亚群:一个含有2 bp的缺失,导致移码UL128并导致UL128(44%的基因组)的截断,其中一个包含单核苷酸取代UL130导致UL130中的C207S取代(9%的基因组)(表2).没有证据表明亚群体突变UL131A。PacBio读取的长度不仅连接两个基因座UL128,两者相隔107 bp,但也有UL130轨迹814 bp外;在连接的reads中,包含一个突变的reads不包含其他突变。因此,与TB40/EF储备的低上皮细胞进入效率一致[14],这些发现表明累积83%的TB40/EF基因组含有可能影响PC组装或功能的突变。相比之下,与高效上皮细胞进入相一致[14], TB40/EE中不存在影响PC亚基的突变。

表2 TB40/EF与TB40/EE编码区核苷酸差异

虽然尚未证明UL128抑制基因替代会破坏PC的功能,但间接证据表明UL130 C207S替代可能会产生负面影响。PC的晶体结构表明C207和C172之间存在二硫键[19],而反向突变C172W已被报道发生在HCMV株IgKG-H2的连续成纤维细胞传代过程中,同时伴有上皮细胞取向性的丧失[16].此外,在HCMV菌株Towne中,有一个移码UL130密码子203将11个c端残基(包括C207)替换为26个新残基后,导致突变蛋白快速降解,内皮细胞向性丧失[20.].这些发现表明,C172-C207二硫键对UL130的功能或稳定性至关重要,并在PC形成和上皮细胞进入中发挥重要作用。奇怪的是,TB40/EF中影响PC亚基基因的三个突变与克隆Lisa或TB40- bac4中的突变不同,在TB40/EE的reads中未检测到。因此,在现有的TB40/E谱系中,迄今为止已经确定了至少5个针对PC亚基基因的不同突变。

另外5个影响编码区域的变化也被确定(表2).其中包括基因中的单个非同义替换UL26(导致UL26中的E98K),UL69(UL69中的H492Q),UL122(IE2中的D390H),以及US28(C320W in US28),基因中有两个核苷酸插入UL141引入移码截断UL141。对读取频率的检查显示,这些变化大多增强到边缘或中等水平:UL26(从53%到100%),UL69(从44%上升到52%),UL141(从44%上升到69%)US28(从88%到100%)。因此,尽管这些变化可能与ARPE-19细胞复制的改善有关,但它们可能是随机效应的结果。而且,这两种变体UL69而且UL141此前已报道TB40/E菌株的一致序列,即TB40/E的部分序列(GenBank登录号为AY446866.1)、克隆Lisa (KF297339.1)和BAC克隆TB40- bac4和TB40- kl7 - se(分别为EF999921.1和MF871618.1) [9111213].在UL69克隆Lisa和TB40-BAC4编码Q492, TB40-KL7-SE编码H492。在UL141,克隆Lisa不存在移码,但在TB40/E部分序列、TB40- bac4和TB40- kl7 - se中存在移码。因此,亲本TB40/E株似乎包含这两个基因的两个变体,在克隆Lisa的基因组中捕获了TB40- bac4和TB40- kl7 - se中的一个或另一个等位基因。相比之下,IE2中D390H取代的患病率从5%显著增加到87%2),表明在ARPE-19适应过程中,强烈的选择压力有利于该等位基因。D390等位基因是TB40/E株所特有的,存在于目前报道的所有TB40/E衍生序列中,而H390等位基因在所有其他序列公开的HCMV株中是保守的。考虑到这种基因,这一观察结果就更加有趣了UL84在IE2 H390等位基因存在的情况下,已被确定为体外成纤维细胞复制所必需的,但在D390等位基因存在时则不是必需的[21].

总之,全基因组测序确定了影响IE2和PC亚基UL128和UL130的变异,这些变异在HCMV株TB40/E适应上皮细胞生长过程中可能被选择。缺乏破坏性突变的病毒基因组的富集UL128而且UL130与检测到的上皮细胞进入效率的提高相一致[14],并且,由于PC与细胞-细胞融合的增加有关[22232425],亦可能解释合胞体形成增加的报告[14].目前尚不清楚IE2中的D390H多态性如何决定成纤维细胞复制过程中对UL84的需求,或者这种现象是否也延伸到上皮细胞,但编码H390等位基因的基因组的选择表明,IE2及其与UL84的相互作用可能提供了上皮细胞中HCMV复制所特有的重要功能。为了进一步阐明UL84在IE2 H390或IE2 D390中所起的作用,科学家们正在构建和鉴定包含这些基因变化的病毒突变体。

数据和材料的可用性

基因组序列可从GenBank获得,登录号为MW439038 (TB40/EF)和MW439039 (TB40/EE)。

缩写

:血巨细胞病毒

人类巨细胞病毒

PC:

Pentameric复杂

BAC:

细菌人工染色体

高频电炉:

人包皮成纤维细胞

Ul

独特的长

U年代

独特的短

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确认

作者感谢德国乌尔姆大学医学中心的Christian Sinzger提供TB40/E的种子库,以及弗吉尼亚联邦大学基因组学核心的Gregory Buck和Vladimir Lee进行PacBio测序。

资金

资金支持由PacBio SMRT赠款(MAM)、美国国立卫生研究院赠款R01AI128912 (MAM和LH)和Wellcome赠款204870/Z/16/Z (AJD)提供。资助机构在研究设计、数据收集、分析、解释或撰写手稿方面没有任何作用。

作者信息

作者及隶属关系

作者

贡献

LH、MAM构思研究,LH、MAM、MS、AJD监督工作,MV、AA、AO准备和提供资料,AAQ、SC组装、注释和分析序列数据,LH、MAM撰写初稿,所有作者投稿并批准最终稿。

相应的作者

对应到Michael A. McVoy劳拉·赫特尔

道德声明

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

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Al Qaffas, A., Camiolo, S., Vo, M.。et al。人巨细胞病毒株TB40/E变异株在成纤维细胞和上皮细胞中繁殖的基因组序列。性研究J18, 112(2021)。https://doi.org/10.1186/s12985-021-01583-3

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  • 人类巨细胞病毒
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