MBZM-N-IBT对单纯疱疹病毒1型感染的抑制作用:硅体和体外研究gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

对现有药物的耐药和交叉耐药的出现，要求开发针对单纯疱疹病毒(HSV)的新抗病毒药物。因此，我们设计了本研究来评估1-[(2-甲基苯并咪唑-1-基)甲基]-2-氧-吲哚-3-亚烯]氨基]硫脲(MBZM-N-IBT)对HSV-1的抗病毒活性。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

分子对接评价MBZM-N-IBT对HSV-1靶标的亲和力。这是通过斑块试验，RNA和蛋白质水平的估计以及体外添加实验的时间来验证的。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

分子对接分析显示MBZM-N-IBT对HSV-1有抑制作用。这是由废除HSV-1感染性病毒颗粒形成IC支持gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值为3.619µM。UL9和gC的病毒mRNA水平也分别降低了72%和84%。MBZM-N-IBT还显著降低了gC和ICP8的蛋白合成。虽然ICP8的mRNA没有受到明显影响，但其蛋白质合成减少了47%。加入时间实验显示MBZM-N-IBT对Vero细胞早期和晚期HSV-1感染均有抑制作用。在HSV-1感染后的Raw 264.7细胞和BHK 21细胞中也观察到MBZM-N-IBT的类似作用。在硅晶片数据的支持下，这可以归因于对多个HSV靶点的可能干扰，包括ICP8、ICP27、UL42、UL25、UL15和gB蛋白。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些结果以及缺乏急性口服毒性和显著的抗炎作用表明其适合作为HSV的非核苷抑制剂进一步评估。gydF4y2Ba

单纯疱疹病毒(HSV)是一种双链DNA病毒gydF4y2BaHerpesviridaegydF4y2Ba家庭。由单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1型和HSV-2型)引起的感染在世界上非常普遍，约67%的人口患有这种疾病(gydF4y2Bahttp://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs400/en/gydF4y2Ba)．感染后通常会形成终生潜伏期，导致感染复发[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．虽然在许多情况下，感染不会危及生命，但在免疫功能低下的人群中可诱发严重疾病[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．它还会引起中枢神经系统感染，导致严重后果[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

由单纯疱疹病毒(HSV)引起的感染主要通过核苷衍生物治疗，包括阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦和泛昔洛韦[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．然而，耐药性的出现对其疗效提出了严峻的挑战。耐药机制一般归因于HSV胸苷激酶(TK)或DNA聚合酶的突变[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．由于这类药物的其他药物也具有类似的作用模式，因此在耐药菌株之间报告了交叉耐药[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．作为一种替代策略，已经努力开发HSV的非核苷抑制剂。人载脂蛋白E模拟二聚体肽经局部应用可在小鼠眼模型中抑制HSV-1 [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba磷甲酸是一种阴离子焦磷酸盐的结构类似物，可以阻断焦磷酸盐与病毒DNA聚合酶的结合，从而抑制HSV。由于它不依赖于病毒蛋白激酶，因此可被认为对抗无环韦的HSV有效。然而，磷甲酸酯耐药性的出现[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba鼓励进一步探索抗HSV的新型非核苷类抑制剂。gydF4y2Ba

硫氨基脲衍生物长期以来一直与抗病毒特性有关[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．它们也被广泛报道具有抗HSV的抗病毒作用[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．虽然大多数化合物的抗病毒作用模式尚不清楚，但少数化合物包括5-氨基-1-甲酰基-4-甲基异喹啉硫代氨基脲(MAIQ)已被报道通过抑制病毒Ribo核苷酸还原酶(RNR)来减少HSV-1的复制[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．然而，考虑到它们广泛的抗病毒特性，不能排除其他模式的抗病毒作用。尽管到目前为止，硫代氨基脲的临床疗效有限，但它仍然是开发抗病毒化合物的重要基团之一。为了提高其治疗效果，已经采用了几种优化方法。最近，我们开发了isatin-β-硫代氨基脲(IBT)和2-甲基苯并咪唑的杂化物MBZM-N-IBT [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．这表明基孔肯雅病毒(CHIKV)的复制显著抑制不同于IBT的原型(甲基沙酮)。对CHIKV感染各阶段均有干扰，选择性指数良好(CC50/IC50 = > 21)。它对CHIKV的抗病毒特性可能不能保证它对HSV的抗病毒作用。然而，甲基沙酮被证明对HSV感染有作用[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．考虑到MBZM-N-IBT对CHIKV的活性明显高于methisazone [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，看看它是否也具有抗hsv活性会很有趣。基于这些考虑以及寻找抗HSV新靶点的需要，本研究评估了MBZM-N-IBT抗HSV-1的潜力。gydF4y2Ba

细胞病毒抗体和药物gydF4y2Ba

Vero细胞(非洲绿猴肾上皮细胞)和BHK 21细胞(婴儿仓鼠肾上皮细胞)在Dulbecco 's改良Eagle 's培养基(DMEM;PAN生物技术，Aidenbach，德国)添加5%胎牛血清(FBS, PAN生物技术，Aidenbach，德国)，0.1%庆大霉素和1%青霉素链霉素(PAN生物技术，Aidenbach，德国)。Raw264.7细胞(小鼠单核/巨噬细胞系)保存在RPMI-1640 (Himedia Laboratories Pvt. Ltd, Mumbai, India)中，添加2.0 mM l -谷氨酰胺、青霉素100 U/mL、链霉素0.1 mg/mL和10%胎牛血清(FBS;PAN生物技术，德国)在37°C加5% CO的加湿培养箱中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．HSV-1病毒株KOS, GenBank登录号JQ673480.1 [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba是苏格兰格拉斯哥大学的罗杰·埃弗雷特博士慷慨赠予的。本课题组合成MBZM-N-IBT [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba阿昔洛韦采购自Sigma (Sigma, USA)。抗icp8 (ab201194)、抗gc (ab6509)单克隆抗体和GAPDH抗体分别购自Abcam (Cambridge, UK)和Abgenex ptt . Ltd. (Bhubaneswar, India)。gydF4y2Ba

分子对接gydF4y2Ba

MBZM-N-IBT的分子对接按照之前报道的方法进行[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．简而言之，从蛋白质数据库中恢复了具有良好结构的HSV进入、复制、包装和释放的靶蛋白。通过使用Discovery studio可视化包软件(Discovery studio 3.5)从催化位点提取任何共晶配体和水分子来优化蛋白质的结构。配体几何结构使用Argus Lab包软件(Argus Lab 4.0.1)进行优化，并使用AutoDockVina软件与大分子对接[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．使用PyMOL分子图形系统(PyMOL 1.3)对配体与大分子之间的相互作用进行了可视化。与喷昔洛韦共结晶的HSV胸苷激酶(PDB ID: 1KI3)的结构作为对照。将Penciclovir从晶体结构中移除，并使用AutoDockVina软件进行对接。将最稳定的结合模式与实验报道的相互作用模式进行比较，以验证重复性。以目标分子的直接抑制剂(只要有)作为结合亲和力比较的标准。gydF4y2Ba

1型单纯疱疹病毒感染gydF4y2Ba

在感染前一天，将Vero/BHK 21/Raw 264.7细胞接种到6孔细胞培养皿中(TPP, Trasachingen, Switzerland)。第二天，如前所述，在100%融合感染多重性(MOI) 1细胞中进行HSV-1感染[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在显微镜下(放大20倍)观察感染细胞，并于感染后24 h拍照，检测细胞病变效应(CPE)。gydF4y2Ba

RNA提取和RT-PCRgydF4y2Ba

为了定量病毒RNA, Vero/BHK/Raw 264.7细胞感染HSV-1 (MOI -1)并进行药物处理。24hpi后收集细胞，使用Trizol (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA)从细胞中提取总RNA。cDNA由第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas, Vilnius, Lithuania)按照制造商的方案生成，病毒基因(UL9, ICP8, gC和gD)与GAPDH作为对照，使用补充表中提到的引物进行扩增gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．所有波段的强度用Image J (NIH, Bethesda, MD, USA)软件测量。gydF4y2Ba

空斑实验gydF4y2Ba

如前所述，传染性病毒颗粒释放的定量是通过空斑试验进行的[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．简单地说，在24 hpi收集感染者和MBZM-N-IBT或阿昔洛韦处理的上清液和细胞。用连续稀释的样品感染100%融合细胞，3-4天后观察斑块。每个样品的斑块数量以斑块形成单位/mL (PFU/ mL)计算，并用Prism软件生成条形图。每3次独立实验分别从2个培养皿中计数斑块，数据表示每个独立实验的平均值(一式两份)±标准差(SD)。gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

根据前面描述的程序，通过Western blot分析检测宿主细胞中的病毒蛋白表达[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在感染后不同小时(hpi)收集细胞进行ICP8和gC，然后用含有300 mM NaCl、1% NP-40、0.1% SDS、0.5%脱氧胆酸钠和50 mMTris (pH 8.0)的RIPA缓冲液进行裂解。等量的蛋白质(60µg)在10%的sds -聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到PVDF膜上。用抗icp8单抗、抗gc单抗检测病毒蛋白，以GAPDH作为负载对照。采用Image J软件对各波段的强度进行量化。gydF4y2Ba

免疫荧光分析gydF4y2Ba

Vero细胞在玻璃罩上培养，并按上述方法感染。如前所述，在18 hpi时，对盖片进行共聚焦显微镜处理[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．简而言之，封面用冷PBS洗了两次。用新鲜制备的4%多聚甲醛在PBS (pH 7.4)中固定细胞，在rt下固定30分钟。接下来，用0.5% Triton X100在PBS中渗透盖片5分钟。洗三次后，用3%牛血清白蛋白(BSA;用10 mM甘氨酸(阻断溶液，Sigma)在PBS中静置过夜。用抗icp8单抗在静置孵育1小时。洗涤后，用AF 488偶联抗小鼠抗体(1:15 000)孵育45分钟。然后，用抗褪色(Invitrogen)安装盖单以减少光漂白。荧光显微图像采用Leica TCS SP5共聚焦显微镜(Leica Microsystems, Heidelberg, Germany) 20倍物镜获取，并使用Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LASAF) V.1.8.1软件进行分析。gydF4y2Ba

Flowcytometry(流式细胞仪)gydF4y2Ba

对于流式细胞术检测HSV-1抗原(ICP8)，细胞处理和获得如前所述[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．简单地说，在15 hpi时收集感染病毒和有或没有药物的模拟Vero细胞，在4%多聚甲醛中RT固定10分钟，并在冰冷的1X PBS中洗涤两次以去除多余的多聚甲醛。然后将细胞重新悬浮在FACS缓冲液(1X PBS, 1% BSA, 0.01% NaN)中gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)， 4°C保存至染色。对于HSV-1抗原(ICP8)的细胞内染色(ICS)，细胞在渗透缓冲液(1X PBS + 0.5% BSA + 0.1%皂素+ 0.01% NaN)中渗透gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)，然后在1% BSA(渗透缓冲液)中在室温下封闭30分钟。细胞用渗透缓冲液洗涤后，用小鼠抗icp8一抗孵育30 min。然后用相同的缓冲液清洗细胞3次以去除未结合的一抗，然后在抗小鼠Alexa Fluor®488共轭IgG (H + L)二抗中孵育。ICS时以正常小鼠IgG为同型对照。染色后，将细胞重新悬浮在含有1%多聚甲醛(w/v)的FACS缓冲液中，并在4°C保存，直到获取样品。然后用BD FACS Calibur获得细胞gydF4y2Ba™gydF4y2Ba流式细胞仪(BD Biosciences, CA, USA)，并使用CellQuest Pro软件(BD Biosciences, CA, USA)进行分析。每个样品共获得约1万个细胞。在同型对照的基础上，设置点图象限进行分析。gydF4y2Ba

添加时间gydF4y2Ba

用HSV-1感染细胞(MOI 0.001, 2和5)后，在0、4、8、12、16、20 hpi时向细胞中添加MBZM-N-IBT(200µM)，并在24 hpi时收集细胞和上清液。病毒滴度由空斑试验根据前面提到的程序确定。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

在Graph Pad Prism 5.0软件中使用单向方差分析(非参数和Dunnett’s multiple comparison test)进行统计分析。实验数据的统计分析采用三个独立实验(n≥3)的平均值±标准差。的gydF4y2Ba假定值gydF4y2Ba，小于0.001被认为具有统计学意义。gydF4y2Ba

MBZM-N-IBT对HSV-1多种药物靶点的亲和力gydF4y2Ba

以HSV胸苷激酶(PDB ID: 1KI3)与喷昔洛韦共结晶的晶体结构作为对照进行分子对接。通过分子对接得到的最稳定配合物的结合残基与实验发现的结合位相进行了比较。实验分解结构中的活性位点残基包括Arg-176, tir -172, Gln-125, he -58和Glu-83也被发现在预测姿势中以类似的方式与penciclovir相互作用(补充文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图1)。由于共结晶配体在其他靶结构中不存在，因此不可能对每个靶进行单独控制来比较分子对接。因此，我们以HSV胸苷激酶(PDB ID: 1KI3)的结合亲和力(-7.3 kcal/Mol)为临界值来筛选MBZM-N-IBT的HSV靶点(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

发现与已知在HSV进入、复制、包装和释放中起作用的靶蛋白具有较高的亲和力。这鼓励了进一步筛查，以发现其对HSV的疗效。gydF4y2Ba

MBZM-N-IBT对HSV-1感染的抑制作用gydF4y2Ba

MBZM-N-IBT(50 ~ 800µM)对Vero细胞的细胞毒作用之前进行了测试，CC50值被认为为> 800µM [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．为了评估MBZM-N-IBT对HSV-1的抗病毒性能，感染和未感染的Vero细胞都用100µM, 150µM和200µM浓度的MBZM-N-IBT处理24小时。使用阿昔洛韦(44.4µM)作为阳性对照[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．在未感染的Vero细胞中，无论是否接受药物治疗，均未观察到形态学变化(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, I-IV)，而HSV-1感染时观察到形态学变化(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, V和VI)。随着MBZM-N-IBT浓度的增加，这种情况有所降低(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, II-IX)表示该分子对HSV-1的抑制作用。gydF4y2Ba

为了了解MBZM-N-IBT在HSV-1感染中的作用，用HSV-1和病毒抗原感染Vero细胞，共聚焦显微镜下观察到ICP8明显降低(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab, c).为了评估MBZM-N-IBT对其他细胞的抑制作用，将BHK 21和Raw 267.4细胞株感染HSV-1，并通过空斑试验和RT-PCR观察到类似水平的病毒抑制(补充文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba细胞毒性实验未显示MBZM-N-IBT对BHK 21和Raw 267.4细胞有任何毒性作用。因此，数据表明MBZM-N-IBT在体外能显著抑制HSV-1感染。gydF4y2Ba

MBZM-N-IBT对HSV-1的IC50值为3.619µMgydF4y2Ba

接下来，用HSV-1感染Vero细胞，用不同浓度(2.5µM、5µM、10µM、50µM、100µM、150µM、200µM和250µM)的MBZM-N-IBT处理，测定MBZM-N-IBT的IC50值。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba不同浓度的MBZM-N-IBT处理后，感染性病毒颗粒数明显减少。使用GraphPad Prism 8程序通过使用浓度对归一化响应的对数来绘制非线性回归(剂量响应)曲线。使用GraphPad Prism 8程序中可用的不同选项进行曲线拟合，以生成剂量反应曲线(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图2)，IC50值为3.619µM。gydF4y2Ba

MBZM-N-IBT降低了病毒DNA和少量病毒mRNA水平gydF4y2Ba

为了评估对HSV-1 mRNA水平的影响，进行了RT-PCR。与DMSO对照相比，UL9(72%)和gC(84%)显著降低(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa, b, d)。在定量PCR中也发现了类似的趋势(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baf).在BHK 21和Raw 267.4细胞中也显示出类似的病毒mRNA水平降低(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图6B和D)，但MBZM-N-IBT处理后的细胞ICP8和gD未见明显变化(图6B和D)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa, c和e)。GAPDH作为对照。该分子的抑制活性也得到了病毒拷贝数显著减少的支持，如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bag.这表明MBZM-N-IBT对少数mRNA水平和病毒DNA有显著影响。gydF4y2Ba

MBZM-N-IBT可降低ICP8蛋白水平gydF4y2Ba

由于MBZM-N-IBT处理影响少量HSV-1 mrna水平，因此采用Western blot和FACS分析研究ICP8和gC蛋白表达水平。Western blot分析显示ICP8降低87%，gC蛋白水平降低66%(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba模拟)。流式细胞术数据点图分析显示，在100µM浓度下，HSV-1 + DMSO阳性细胞百分比为27.7±0.35(平均值±SEM)， HSV-1 + MBZM-N-IBT阳性细胞百分比为22.0±0.85(平均值±SEM)。此外，在200µM浓度时，它降低到14.9±0.33(平均值±SEM)(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba此外，平均荧光强度(MFI)分析也表明，与DMSO对照相比，MBZM-N-IBT存在时，ICP8以剂量依赖的方式降低(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag).综上所述，MBZM-N-IBT可降低HSV-1特异性蛋白的表达，但未显著影响其mRNA水平。gydF4y2Ba

MBZM-N-IBT可能干扰HSV-1生命周期的早期和晚期gydF4y2Ba

为了解MBZM-N-IBT影响HSV-1感染的可能阶段，进行加药时间实验。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，观察到，在0 ~ 16 hpi添加MBZM-N-IBT后，约97%的感染性病毒颗粒释放被取消。即使在以20 hpi的速度添加药物后，病毒颗粒释放的减少量也发现为64%，这表明短时间的暴露足以显著减少病毒颗粒释放(MOI 0.001)。MOI 2和5的病毒感染也有类似的趋势。这些发现以及MBZM-N-IBT也显著抑制ICP8蛋白的表达水平(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa, e-g)提示MBZM-N-IBT可能干扰HSV-1生命周期的早期和晚期。gydF4y2Ba

甲沙酮是硫氨基脲类抗病毒药物的原型，较早时已被证明有效[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．然而，研究发现它对CHIKV无效[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．然而，我们报道了具有相似药效团的MBZM-N-IBT通过干扰CHIKV生命周期的多个阶段在体外显著抑制CHIKV [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．尽管这种抑制活性可能不能确保它对其他病毒的有效性，但人们认为它是否也能对疱疹起作用值得一试。在此基础上，通过分子对接的方法确定MBZM-N-IBT对HSV-1多个靶点的结合亲和力。由于结合体位对HSV胸苷激酶(PDB ID: 1KI3)预测成功，因此以该体位的结合亲和力评分作为分值。结果显示，对各种靶标具有更高的结合亲和力(> 7.3 kcal/Mol)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，表明其有抑制HSV的潜力。早期发现宿主毒性较低，因为CC50为> 800µM [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．根据OCED-423指南进行的口服急性毒性研究(数据未显示)也表明了其安全性(5类:> 500 mg/kg)。此外，在体内具有明显的抗炎作用(数据未显示)。这些被认为是补充抗病毒作用，因为炎症是HSV感染进展的关键。这促使我们验证它对这种病毒的抑制特性。gydF4y2Ba

由于早先报道MBZM-N-IBT的CC50超过800µM，因此在Vero、BHK 21和Raw 267.4细胞系中，以100、150和200µM的测试浓度对HSV-1进行了筛选。虽然在这个水平上没有发现毒性，但在所有细胞系中都发现了显著的抑制作用(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2BaPgydF4y2Ba0.05gydF4y2Ba)．在此之后，用不同的测试浓度(2.5 μ M至250 μ M)进行筛选，发现IC50值为3.619 μ M(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图2)。然而，进一步的动物模型验证可以揭示其是否适合转化为临床应用。gydF4y2Ba

为了了解MBZM-N-IBT的有效性并了解其可能的作用方式，我们研究了MBZM-N-IBT对病毒mRNA表达和蛋白质合成的影响。考虑到HSV表达的蛋白数量众多，在这一阶段很难对每一种进行研究。因此，我们分别研究了参与复制和包装/出口的两种非结构蛋白(ICP8和UL9)和两种结构蛋白(gC和gD)的mRNA表达情况。UL9的mRNA水平下降72%，gC的mRNA水平下降84%。而ICP8和gD mRNA水平的降低不显著。考虑到MBZM-N-IBT对gC mRNA的高度抑制作用，进一步研究MBZM-N-IBT对其蛋白合成的影响。由于分子对接分析显示ICP8具有很强的亲和力(PDB ID: 1URJ)，这也被认为是估计病毒蛋白合成的方法。结果表明，gC和ICP8蛋白合成分别被抑制66%和84%。与gC的mRNA表达相比，gC对蛋白质合成的抑制程度相对较低，这表明gC可能不是MBZM-N-IBT的直接靶点。这也得到了我们分子对接研究的支持，表明MBZM-N-IBT对gC蛋白同源模型的亲和力较差(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图3A)由本课题组按照既定方法开发[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．与此相反，预测ICP8 (PDB ID: 1URJ)具有更高的绑定亲和力(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图3B)。这也得到了体外实验数据的支持。ICP8蛋白被高度抑制，尽管其mRNA水平的降低不显著。流式细胞分析进一步证实了这一点，结果显示ICP8减少了47%。这表明抗病毒作用可能部分是通过抑制ICP8介导的。这一观察结果与病毒拷贝数也显著减少的事实是一致的(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．然而，ICP8是否是MBZM-N-IBT的靶点之一还需要进一步的研究。gydF4y2Ba

随后，加入时间实验显示MBZM-N-IBT在感染早期和晚期都有抑制HSV-1的能力(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．因为UL9是复制起始蛋白[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]而ICP8是单链dna结合蛋白[gydF4y2Ba24gydF4y2BaUL9 mRNA水平和ICP8蛋白水平的降低可以部分解释MBZM-N-IBT在早期的抑制作用。类似地，gC mRNA表达的降低可能有助于观察到HSV-1在其生命周期后期的抑制。考虑到MBZM-N-IBT抑制早期和晚期HSV-1感染的事实，HSV-1的靶点不能局限于上面提到的几个。很难通过实验阐明MBZM-N-IBT与所有可能靶标的相互作用，以证明在HSV生命周期的不同阶段具有抑制作用。然而，分子对接数据可以用来预测HSV感染中可能的干扰模式，通过确定与重要HSV靶标的结合亲和力和最稳定的结合位姿，这些靶标具有有效的结构。虽然MBZM-N-IBT对HSV-1胸苷激酶(PDB ID:3FOT)和衣壳蛋白(PDB ID: 1NO7)的亲和力较差，但它对表中列出的其他靶标具有良好的亲和力gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．它显示了良好的交互(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图4A)与ICP27 (PDB ID: 5BQK) c端结构域连接，ICP27是已知人类HSV-1中保守的多功能蛋白[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．此外，它表现出良好的交互性(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图4B)与HSV-1的DNA聚合酶UL42 (PDB ID: 2GV9)。除了ICP8的抑制外，这可以部分证明在HSV-1生命周期复制阶段观察到的抑制作用。虽然对主要衣壳蛋白的亲和力较差，但与包括UL25、DNA包装蛋白(PDB ID: 2F5U)和DNA包装电机pUL15 c端核酸酶结构域(PDB ID: 4IOX)在内的包装蛋白的相互作用良好(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图4C和d)。此外，估计与gB (PDB ID: 2GUM)的胞外结构域也有良好的相互作用(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图4E)参与病毒附着和融合。然而，这需要实验验证。由于这些蛋白质与HSV-1的包装和释放有关[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]，它们可能被MBZM-N-IBT抑制，可以被认为是在HSV-1生命周期晚期观察到抑制的一个因素。与HSV-2蛋白酶(PDB ID: 1AT3)的结合亲和力相对较低，但与HSV-2表面包膜糖蛋白D的结合亲和力较高(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图5)。这表明MBZM-N-IBT也可能抑制HSV-2。然而，需要进一步的调查来支持这些建议。此外，这些发现还需要在临床分离株以及多个HSV毒株中进行验证。然而，这一发现确立了MBZM-N-IBT作为对抗HSV的新打击。它对CHIKV和HSV的作用使其成为进一步研究开发新的抗病毒疗法的有趣候选药物。gydF4y2Ba

对HSV的耐药和跨核苷抑制剂的交叉耐药的出现已不再罕见。过去四十年开发的抗病毒药物主要针对DNA聚合酶。然而，DNA聚合酶突变的频繁鉴定强调了开发具有替代靶点的抗病毒药物的必要性。在本研究中，MBZM-N-IBT显示出抗HSV作用，可能是通过多个HSV靶点介导的，包括ICP8、ICP27、UL42、UL25、UL15和gB。因此，确定MBZM-N-IBT对它们的直接抑制能力将是未来重要的工作。基于这些发现及其良好的药物相似性[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]， MBZM-N-IBT可作为优化开发HSV非核苷类抑制剂的新靶点。gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

MBZM-N-IBT:gydF4y2Ba

1-[(2-甲基苯并咪唑-1-基)甲基]-2-氧-吲哚-3-亚烯]氨基]硫脲gydF4y2Ba

HSV:gydF4y2Ba

单纯疱疹病毒gydF4y2Ba

我:gydF4y2Ba

感染多重性gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸盐gydF4y2Ba

DMEM:gydF4y2Ba

改良的鹰媒gydF4y2Ba

的边后卫:gydF4y2Ba

胎牛血清gydF4y2Ba

空斑形成单位:gydF4y2Ba

斑块形成单元gydF4y2Ba

CPE:gydF4y2Ba

细胞病理效应gydF4y2Ba

我们感谢苏格兰格拉斯哥大学的Roger Everett博士赠送了HSV-1病毒。我们也感谢m.m. Parida博士提供Vero细胞株。作者感谢B.S. Sahoo先生在使用LASAF软件进行共焦成像方面的技术支持，以及S. Muduli女士在进行共焦实验方面的技术支持。gydF4y2Ba

这项工作得到了印度政府生物技术部的部分资助。BT / PR15750 /地中海/ 29/1015/2016)。这项工作得到了印度政府科技部生物技术司提供的生命科学研究所核心基金的支持，部分由布巴内斯瓦尔大学Siksha O Anusandhan制药科学学院提供。A.K.得到了印度政府科技部科学与工业研究理事会的支持。资助机构在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写手稿方面没有任何作用。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 生命科学研究所，生物技术部门自治研究所(印度政府)，纳尔科广场，布巴内斯瓦尔，751023，印度gydF4y2Ba

   Abhishek Kumar, Saikat De, Tapas Kumar Nayak, Tanuja Saswat, Ankita Datey, Prabhudutta Mamidi和Soma ChattopadhyaygydF4y2Ba

2. 印度布巴内斯瓦尔Khandagiri广场，751023,Siksha O Anusandhan被认为是大学药学院gydF4y2Ba

   Alok Kumar Moharana, Priyadarsee Mishra和Bharat Bhusan SubudhigydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

构思和设计实验:So.C。，B.B.S., A.K. and S.D. Contributed Reagents / materials/ analysis: So.C. and B.B.S. Performed the experiments: A.K., S.D., A.K.M., T.K.N., T.S., A.D., P.M. and Pd.M. Wrote the paper: So.C., B.B.S., S.D., A.K. and T.K.N. All authors read and approved the final manuscript.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaBharat Bhusan SubudhigydF4y2Ba或gydF4y2BaSoma将挑战gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有利益竞争。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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