血凝素-神经氨酸酶蛋白特异性单克隆抗体定义新城疫病毒基因型2特异性中和表位。来自埃及gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

新城疫是一种由强毒性新城疫病毒(NDV)引起的家禽毁灭性疾病，尽管加强了疫苗接种，这是一种副粘病毒，在世界许多地区流行。系统发育分析揭示了主要循环基因型2的持续进化。VII，潜在抗原漂移的相关性正在讨论中。为了研究负责受体结合的蛋白(即血凝素-神经氨酸酶(HN)刺突蛋白)的中和敏感表位的变异，我们对建立基因型特异性单克隆抗体(mab)感兴趣。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

梯度纯化的NDV基因型2的hn富集部分。7was prepared and successfully employed to induce antibodies in BalbC mice that recognize conformationally intact sites reactive by haemagglutination inhibition (HI). For subsequent screening of mouse hybridoma cultures, an NDV-ELISA was established that utilizes Concanavalin A (ConA-ELISA) coupled glycoproteins proven to present conformation-dependent epitopes.

结果gydF4y2Ba

HI活性表明，9个所选单克隆抗体中有6个能够阻断受体结合。一种单克隆抗体仅识别同源病毒中存在的表位，而其他四种单克隆抗体对所选的其他基因型表现出弱反应性。另一方面，一种广泛交叉反应的单抗与所有测试的基因型反应，类似于基因型特异性多克隆抗体制剂的反应性，这表明测试的NDV基因型之间存在微小的抗原差异。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些结果表明NDV HN分子中同时存在可变表位和保守表位。所描述的方案应该有助于生成针对各种NDV菌株的单克隆抗体，并能够对不同基因型的抗原谱进行深入分析。gydF4y2Ba

新城疫病毒(synavian orthoavulvirus -1);禽副粘病毒-1 (APMV-1)是原avulavirus属副粘病毒科的一员，与Meta属和副avulavirus属同属Avulavirinae亚科[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．与单单核病毒目其他成员一样，NDV是一种具有负极性RNA基因组的包膜病毒。基因组大小为15,186、15,192或15,198个核苷酸[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]编码六种结构蛋白[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]与两个外刺糖蛋白，血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)，促进附着和随后进入宿主细胞。后者蛋白被翻译为前体分子(F0)，并被细胞蛋白酶裂解为二硫键连接的亚基F1和F2 [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．两种刺突蛋白都具有免疫原性，可诱导宿主产生保护性免疫[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．然而，病毒粒子的主要结构蛋白是核蛋白(NP)，它将病毒RNA包裹成螺旋状衣壳，并与磷(P)蛋白和大(L)蛋白一起形成病毒聚合酶复合体。基质(M)蛋白位于病毒膜下方，被认为可以稳定病毒粒子结构。此外，两种调节蛋白V和W被整合到病毒粒子中[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在家禽中，毒力很强的新城疫菌株可诱导新城疫，这是一种全身感染，鸡的死亡率可高达100%。在20世纪40年代末引入无毒的APMV-1株作为ND疫苗是保护鸡和火鸡免受疾病的标志[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，今天，新城疫疫苗接种是保护全世界家禽的基础。然而，这种疾病在世界许多地区流行。最近，已建立但陈旧的疫苗毒株对目前流行的新城疫毒株的保护不足被提出[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．这一假设得到了遗传分析的支持:流行的NDV菌株显示出巨大的异质性，菌株可分为两个遗传类(1-2)，一个(1.I)和21 (2. i)。I - 2.XXI)分别识别的基因型[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．而所建立的疫苗株属于基因2型。I和2。II、基因型2。7dominates the current panzootic in Asia and the Middle East [17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．F和HN刺突蛋白两种基因型之间的同源性，负责在宿主中引发保护性免疫反应[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，在核苷酸水平上分别为75-79%和71-75%，在氨基酸水平上分别为85-89%和84-88%。尽管遗传变异，抗原性NDV仍然形成单一的同质血清型[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．基于血凝抑制试验(HI)，多克隆血清可以在Avulavirinae亚科的血清型之间进行区分，HI可以检测到阻止病毒与红细胞唾液酸受体结合的hn特异性抗体或血清中和试验[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]但无法区分新城疫病毒的基因型[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．然而，通过单克隆抗体(MAbs)，已经认识到特定表位的差异[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．对1526株NDV分离株培养抗NDV- ulster 2c(基因型2. i .2)和鸽型副粘病毒(基因型2. vi)的单克隆抗体进行分析，可以区分不同的群体，但也显示出组内相当大的异质性[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．进一步对NDV澳大利亚-维多利亚(AV)(基因型2.I.1.1)中和单克隆抗体的研究发现HN蛋白中有7个不同构象依赖的抗原位点。两个位点仅表达病毒中和(位点3和4)，而与其他位点结合的单克隆抗体仅抑制HA活性(位点1和14)或同时抑制HA和NA活性(位点2、12和23)[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．对病原株NDV-D26(基因型2.I.1.1)建立的单克隆抗体的研究建立了三种对单克隆抗体HI和NI活性敏感的表位，并在分析逃逸变异时将这些位点映射到不同的氨基酸上[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．同样地，hi阳性单抗AVS-I，对抗无毒LaSota疫苗株(基因2.II型)[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]映射到一个残基570，该残基与其他所描述的表位很接近，但不是它的一部分[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．这表明NDV株可能表达至少略有不同的中和表位模式。NDV基因型2的表位信息。VII不可用。gydF4y2Ba

为了鉴定循环NDV基因型2的抗原位点。7，we generated genotype-specific MAbs that are able to block biologically active sites of the HN protein, i.e. antibodies that are able to neutralize infectivity and/or block HA activity. For this approach biophysically enriched HN protein fraction of purified virus proved to be an efficient antigen and the applied Concanavalin A (ConA)-ELISA technique that binds antigen not directly on the plate but coupled by the lectin, provided a high throughput system suitable to detect antibodies to conformation sensitive sites. The resulting MAbs were used to recognize unique neutralizing epitopes of NDV genotype 2.VII.

病毒和血清gydF4y2Ba

NDV鸡株/EGY/NR730/2016 (NR730;基因库Acc。不。MH899939)是从埃及患有呼吸窘迫的ND接种鸡群中分离出来的。该病毒具有快速致病性，脑内致病性指数(ICPI)为1.8，属于基因型2.VII.1.1(原2.VIIb) [gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．鸽型副粘病毒-1(鸽/德国/R75/1998)，基因型2。VI，是从FLI的ND参考实验室(Acc。不。KJ736742)和NDV/克隆30，基因型2。II，源自一种商业疫苗(MSD，新泽西州，美国)。以无特异性病原体(SPF)鸡卵黄液作为多克隆参考抗体的来源，用特定灭活NDV抗原反复免疫。单特异性兔α-NDV-HN血清和α-NDV-F血清[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]，采用western blot (WB)方法特异性检测NDV-HN蛋白。按照合法批准的方案(MV-LALLF- 7221.3-2.5-010/10)进行免疫接种。gydF4y2Ba

病毒的繁殖与纯化gydF4y2Ba

病毒在SPF鸡胚(ECE)中繁殖，如所述[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba(VALO BioMedia GmbH, Osterholz-Scharmbeck，下萨克森州，德国)。感染后第3天(dpi)收获氨基尿囊液(AAF)，用蔗糖梯度超离心纯化。简单地说，通过低速离心(10976 × g下30分钟;10,000 rpm转子JA-10;贝克曼库尔特，布雷亚，加利福尼亚州，美国)。用超离心(96,281 × g 1.5 h;28000转，32Ti转子，贝克曼Coulter)。将6个试管中的病毒球重新悬浮在总共45 mL含1 M KCl (KCl-PBS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.2)中，然后在不连续的蔗糖梯度(30-60%，KCl-PBS)上添加15 mL病毒悬液。超离心过夜后形成可见条带(96,281×gydF4y2BaggydF4y2Ba；28000转，32Ti转子;收集Beckman Coulter)，在KCl-PBS中1:5稀释，然后超离心1.5 h (96,281×gydF4y2BaggydF4y2Ba；28000转，32Ti转子;贝克曼库尔特)。收集总共228 mL AAF的最终病毒颗粒，并重新悬于1.5 mL KCl-PBS中。获得的病毒悬液的蛋白质浓度根据Bradford使用Roti®-Quant蛋白质定量法(Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Baden-Württemberg，德国)按照生产商的说明进行测定。根据标准程序，使用血凝试验测定血凝活性[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．在制备鸽型副粘病毒(PPMV-1) R75/98和疫苗型APMV-1克隆抗原时，分别进行30纯化，但病毒在PBS中重悬。gydF4y2Ba

HN蛋白的富集gydF4y2Ba

NDV刺突蛋白的分离由[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．简单地说，在KCl-PBS中将纯化病毒的蛋白浓度调整为1.5 mg/mL，然后加入0.1 mL Triton X-100 PBS (20% (v/v))，轻轻混合，室温(RT)保存20分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba， 9703 rpm, A-4-81-11 Rotor， (Eppendorf, Hamburg, Germany))，所得颗粒(p1)重悬于1ml PBS (0.01 M, pH 7.2)中，保存用于分析，上清进一步用高速(2000,000 × 1 h)超离心清除gydF4y2BaggydF4y2Ba， 55,000 rpm转子TSL 55 (Beckman Coulter, Brea, California, USA)) 1小时。再次，在0.2 mL PBS中重新悬浮后，将颗粒(p2)保存以进行分析。收集上清液，在0.01 M磷酸盐缓冲液中透析，以去除净化过程中使用的缓冲液中的氯化钾。透析过程中形成的沉淀物均采用离心(10000 ×离心20 min)沉淀gydF4y2BaggydF4y2Ba， 9703 rpm, A-4-81-11转子(Eppendorf，汉堡，德国))，颗粒在0.1 mL PBS中重新悬浮(p3)。透析材料(s3)的上清是随后用作免疫抗原的部分。gydF4y2Ba

SDS-PAGE和western blotgydF4y2Ba

蛋白质在10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶中变性条件下使用minigel系统(Biorad, Hercules, California, USA)根据标准指南(gydF4y2Bahttp://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdfgydF4y2Ba)．简言之，将样品稀释在样品缓冲液中(Roti load®(Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Baden-Württemberg, Germany))，在100°C下加热5分钟，然后在每个通道中加入16µL到凝胶袋中。应用恒压设定(200v)进行蛋白质分离，凝胶用考马斯蓝染色(Biorad, Hercules, California, USA)或将蛋白质涂抹在硝化纤维膜上(Amersham™protan, Cytiva, Marlborough, MA)。用于western blot分析，用1%脱脂奶粉在0.025% Tween 20的PBS (PBS-Tween)中堵塞膜1小时，随后与目标特异性抗体在4℃下孵育一夜。用PBS-Tween清洗三次后，将印迹与过氧化物酶(POD)标记的物种特异性抗免疫球蛋白G (IgG)或免疫球蛋白Y (IgY)偶联物(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)孵育1小时。清洗三次后，使用SuperSignal West Pico化学发光底物(Thermo Scientific™)进行化学发光观察过氧化物酶活性。Waltham, Massachusetts, USA)和Chemi Doc XRS +成像系统(Bio-Rad, Hercules, California, USA)。gydF4y2Ba

小鼠接种和单克隆生产gydF4y2Ba

两只雌性BALB/c小鼠用20µg纯化蛋白组分(S3)与等量GERBU佐剂MM (GERBU Biotechnik, Heidelberg, Germany)混合腹腔免疫5次，为期26周，在第一次给药后第4周、第7周、第11周以及提取脾脏前4天进行增强免疫。在第一次免疫(dpi)后第35、49和84天，以及实验结束时第183 dpi时，从下颌下静脉采集血液样本。在最后一次刺激小鼠安乐死4天后，在无菌条件下取出小鼠脾脏，脾细胞被收获到无血清rmii -1640培养基中(Invitrogen, Carlsbad, California, USA/Thermo Scientific™)。沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)通过使用细胞过滤器(BD生物科学，富兰克林湖，美国新泽西州)。在聚乙二醇1500 (Roche Applied Science, Penzberg, Germany)存在下，分离的脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞按照稍微修改的标准方案融合[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]细胞与细胞的比例为1:4。融合脾脏细胞以三种不同的细胞密度(每孔30,000、15,000和7,500个脾脏细胞，每个密度2个板)在96孔平底板(Greiner bio-one, Kremsmünster，奥地利)中进行种子接种，并使用完全rmi -1640培养基(10% FCS (Fischer Scientific, Hampton, New Hampshire, USA)， 1 × MEM非必需氨基酸，2 mM l -谷氨酰胺，1 mM丙酮酸钠(Invitrogen, Carlsbad, California, USA/Thermo Scientific™)，孵育10天(37°C, 90% RH, 5% CO2)。Waltham, Massachusetts, USA)补充1 × BM Condimed H1(杂交瘤克隆补充，Sigma-Aldrich)。为了选择生长中的杂交瘤克隆，在完整培养基中添加1 × HAT培养基补充剂(50×) hybrid - max™(Sigma-Aldrich)。采用Con-A ELISA、IF、HI等方法检测生长培养物中特异性抗体。采用血凝抑制试验(HI)按标准程序测定血凝抑制活性[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．为了产生产生单抗的细胞克隆，阳性培养的细胞在完整的rmi -1640培养基中通过限制稀释(每孔0.1个细胞)克隆至少两次，培养基中添加1 × HT培养基补充剂(50 ×) hybrid - max™(Sigma-Aldrich)。最终的克隆在没有任何进一步补充的情况下适应于完整的RPMI-1640培养基。gydF4y2Ba

一个ELISAgydF4y2Ba

ELISA程序根据先前发表的方案进行[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．简单地说，ELISA板(Immunolon II, Thermo Scientific™)。Waltham, Massachusetts, USA)用ConA (Carl Roth GmbH)预处理，每孔加入50µl Con-A(50µg/mL PBS)。RT孵育1小时后，用PBS-Tween冲洗三次，涂上50µL(20µg/mL)预处理过的抗原。为了制备抗原，将浓度为200µg/mL的梯度纯化病毒原液用TritonX100 (1% v/v)在RT下孵育45分钟，随后用PBS 1:10稀释，覆盖培养皿1小时。随后，用PBS- tween洗涤三次，用1% FCS在RT中堵塞30分钟。以指定稀释度的测试血清(50µL/孔)在RT下孵育30分钟，用PBS- tween洗涤三次后，用POD标记的物种特异性抗igg或IgY偶联物(50 μ L/孔)在室温下孵育30分钟。用pbs -吐温洗涤三次后，用邻苯二胺二盐酸盐(Sigma-Aldrich)孵育观察结合的抗体。(50µL/(100µL/孔，1 mg/mL在0.05 M磷酸柠檬酸缓冲液中)20分钟。用2.5 M H停止显色反应gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba．使用Sunrise™、Tecan的microplate reader (Männedor)和optical f (Zürich，瑞士)在492 nm处测量井密度。gydF4y2Ba

间接免疫荧光(IF)gydF4y2Ba

免疫荧光检测使用感染NDV/NR730/16的LMH细胞(ATCC CRL-2117™)在96孔板(美国纽约康宁公司)中培养至70-80%融合度。感染板在孵育24小时后用3.7%的甲醛固定，并在4°C保存4周。使用时，清空培养皿，用TritonX-100 (1% v/v)在PBS (100 μ L/孔)中处理30分钟，在RT下擦去上清后，用1%胎牛血清在PBS中堵塞30分钟。随后，用单抗抗体或指示血清(50 μ L/孔)在RT中孵育1小时。用PBS- tween洗涤三次后，用fitc偶联的抗物种特异性IgG或IgY偶联(Sigma-Aldrich, Sigma-Aldrich)孵育孔。最后用PBS-Tween清洗三次后，用甘油在1:5的水中安装孔，并在显微镜下观察(Eclipse TS100, Nikon, Minato, Tokyo, Japan)，使用适当的过滤器(激发495 nm，发射525 nm)。gydF4y2Ba

血清中和试验(SNT)gydF4y2Ba

连续稀释(loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)，从浓缩上清开始，与等体积的NDV/NR730/16(100µL)混合，含有400组织培养感染剂量50 (TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)．每个稀释行，最后一个井保留无血清作为病毒控制。每次试验均采用热灭活(56°C, 30分钟)NDV参考血清作为阳性中和对照。在37°C下孵育30分钟后，50 μ L抗体/病毒混合物三份转移到100 μ L LMH细胞中，这些细胞在96孔板(康宁)中以密度10培养，没有胎牛血清，但使用TPCK处理的胰蛋白酶(2µg/mL) (Sigma-Aldrich)gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．培养皿在37°C和5% CO孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2BaSNT滴度通过测定最后一次没有细胞病变效应的稀释度(cpe)来确定，并根据Reed和Muench [gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

血凝抑制试验(HI)gydF4y2Ba

根据标准程序进行血凝抑制试验，应用4个血凝单位，并给予HI滴度作为抑制凝集的最后一次血清稀释度(log2) [gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．为了分析多克隆血清的抗原差异，试验分为三次，并在三个独立的实验中重复进行。结果用Sigma Plot 11 (Systat Software, INC)分析，并应用Kruskal-Wallis单向秩方差分析。R值根据Archetti和horfall计算[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba] R: 0.5、0.25、0.13和0.06，分别表示滴度差为1、2、3和4。gydF4y2Ba

HN抗原制备gydF4y2Ba

用于抗原制备，使用从AAF中获得的梯度纯化病毒(228 ml)，其产量为1.5 ml, HA活性为15 (loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)，总蛋白质含量为1.9 mg/mL。纯化的病毒制备以SDS-PAGE为主，随后的考马斯氏染色条带为55 kD，可能代表NP (53 kD)、P (53 - 56 kD)和F1 (55 kD)的共迁移蛋白(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).该蛋白部分也被NDV接种鸡的抗体识别为病毒粒子中的主要免疫原性部分(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).此外，考马斯色染色可见HN蛋白呈~ 70kd条带(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)和western blotting(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB)如图中*所示。在WB分析中，使用HN单特异性高免疫血清可以证实观察到的~ 70kd条带的HN蛋白的身份(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).同样，考马斯色染色检测到在~ 40 kD处有一个小带，代表M蛋白(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)和western blot分析的鸡多克隆抗体(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).用Triton破坏病毒并随后离心(p1)后，55 kD条带的蛋白质是球团的主要部分。在这条带中嵌入的是F1蛋白，它被f特异性高免疫血清特异性检测到(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)。随后的微球(p2和p3)以及最终的上清液(S3)通过考马斯色染色检测到仍然含有55 kD带的蛋白质(图3)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)和western blot分析(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).但与这些组分中的其他蛋白相比，55kd带不太突出。在所有离心步骤中，HN蛋白也被拉下，但逐渐成为用于免疫(S3)的最终上清液中的主要部分，并保持HA活性为13 (loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)．另一方面，用f特异性血清进行western blot分析(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)表明F1蛋白不再存在于包括最终上清液在内的这些后期馏分中。gydF4y2Ba

建立ConA ELISA检测体系gydF4y2Ba

在对2只BALB/c小鼠进行S3部分(20µg/只)的首次免疫后，在血液样本中检测到NDV特异性抗体(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa). HI反应性(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Baa，填充符号)表明诱导抗体能够阻断受体介导的病毒与红细胞的结合，表明抗原制备代表了HN蛋白构象完整的表位。用ConA ELISA法检测抗体反应性(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA，透明符号)。然而，为了验证ConA ELISA也检测构象依赖表位的抗体，使用MAb 617/161检查了该测试系统[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．该单抗具有抗基因型2的HI活性。VI而不是基因型2。II或2。7，而且does not react with denatured viral protein in western blot analyses. Hence, it is directed against a conformation-dependent epitope. In ConA-ELISA of plates coated with NDV genotype 2.II (clone 30), genotype 2.VI (pigeon/ DEU/R75/98) or genotype 2.VII chicken/EGY/ NR730/2016), the polyclonal reference antibody preparation was reactive with all three antigens (Fig.3.gydF4y2Baa).相比之下，但与HI数据一致的是，MAb 617/161仅与基因型2发生反应。VI抗原(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).在确定ConA-ELISA适用于检测NDV HN蛋白构象表位的抗体后，选择该方法进行杂交瘤培养上清的筛选。gydF4y2Ba

单克隆抗体的制备gydF4y2Ba

为了制备杂交瘤细胞，在第4次加强免疫后4天采集两只小鼠的脾细胞，合并，一半细胞用于融合。从总共10个96孔板中，30孔的上清在Con a - elisa中反应，OD值大于0.2(0.2 - 0.7)，通过IFT可以确认病毒特异性反应性。30个孔中有6个孔的上清也显示出对NDV NR730(基因型2.VII)的HI反应性(HI滴度(log2)在1至5之间)，并被选择用于亚克隆和进一步鉴定。此外，选择三种hi阴性培养。用有限稀释法克隆两轮后获得的杂交瘤培养物的最终上清液随后用于表征。6个hi阳性杂交瘤菌落经ConA-ELISA检测显示有反应性(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)并在单细胞克隆后保留HI反应性(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

交叉反应性分析揭示了基因2型HN独特的表位模式。7gydF4y2Ba

对这些单克隆抗体的初步分析探讨了它们在不同测试系统中的反应性，并考虑了它们与新城疫疫苗株克隆30、基因型2.II的交叉反应性。大多数单克隆抗体与基因2型同源物特异反应。VII病毒(NR730)(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．此外，其中一种hi阳性单抗(4E11)也能阻断克隆30的血凝，尽管只有2对数对数gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与同源NR730抗原相比，滴度降低了一步。IFT证实了对NR730感染细胞的特异性反应(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)和对克隆30的交叉反应性(表4E11)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．通过ConA-ELISA检测，hi阳性单克隆抗体对同源NR730基因型VII病毒表现出较强的反应性(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)，同样只有MAb 4E11与异源疫苗克隆30株发生交叉反应(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．相比之下，三种hi阴性单抗的ConA-ELISA反应性较低(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).有趣的是，两种单克隆抗体(5B4, 6F2)只与同源基因型2反应。VII病毒(NR730/16)，而第三种单抗(1B6)也与基因型2反应。II疫苗株(clone30)。酶联免疫吸附试验(ELISA)可观察该反应谱gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)并经western blot分析证实(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Baa):所有三种hi阴性单克隆抗体都能与NR730的~ 55 kD迁移的病毒蛋白反应，与ELISA类似，只有单克隆1B6表现出与克隆30的交叉反应。然而，由于NP、P和F1在SDS-PAGE凝胶上共迁移，因此无法从我们的western blot结果中得出关于单克隆抗体特异性的结论。相反，通过western blot分析，hi阳性单克隆抗体均无反应。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).最后的实验探讨单克隆抗体是否能够阻断NR730在LMH细胞中的感染。通过SNT, 6个HI阳性单克隆抗体中有4个中和了病毒的传染性，滴度与HI试验相当。与此相反，与55 kD蛋白反应的3种单克隆抗体均不能中和同源NDV NR730。gydF4y2Ba

对于6个hi阳性单克隆抗体，我们扩展了我们的交叉反应性分析与6个额外的毒株，代表1类和2类病毒(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．很明显，MAb 4E11识别的表位存在于所有测试的基因型中，并且代表了一个很好的保守位点。对于其他5种hi阳性单克隆抗体，反应谱对基因型2高度特异性。VII，即使一种单抗(5C2)对来自其他基因型的病毒具有剩余反应性。这包括Herts 33/56，一种非常早期的NDV毒株，在2类病毒中不属于特定的基因型，因此被称为基因型2.0。此外，还观察到对PPMV-1病毒(基因型2. vi)和最近的基因型2病毒的低水平反应性。XIV来自尼日利亚。显然，也在基因2型内。7there are antigenic differences: While three MAb (5C2, 5D1 and 7C12) were reactive with a second genotype 2.VII virus tested, reactivity of MAb 5C9 was fourfold lower with the heterologous virus. For MAb 7C12 reactivity to heterologous dropped to 1 log2. In contrast, polyclonal antibody preparations raised against genotypes 2.I, 2.II, 2.VI, 2.VII and 2.XIV were reactive with all antigens tested (Additional file1gydF4y2Ba:图S1)。对于大多数抗原，血清滴度差异在2 log范围内gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba步骤。然而，抗基因2型血清升高。我,2。VI和2。XIV的HI滴度差异(dHI)分别为> 2 (loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)的特异性抗原，这种区别不存在于其他血清中。这反映在分析5个抗原/血清对(基因型2)的抗原关系时。我,2。二世,2。第六,2。7而且2.XIV) by calculating the R values according to Archetti and Horsfall [45gydF4y2Ba］．大多数R值在0.9之间(基因型2。I /2. ii)和0.25(基因型2。VI / 2.XIV)(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。最高R值为0.15(基因型2)。I /2.VI)，近似dHI接近3。gydF4y2Ba

富集hn病毒抗原诱导的构象表位抗体gydF4y2Ba

我们报道了识别基因型2的NDV单抗的生成。VII HN蛋白的特异性表位。通过在用于小鼠免疫的抗原制备中富集HN蛋白部分，我们能够获得六种对HI有反应的杂交瘤培养物，即能够阻断HN蛋白在红细胞上的受体结合位点，其中四种在LMH细胞培养物中中和了病毒的感染性。此外，进一步选择的三种杂交瘤培养物既没有显示HI也没有中和活性。通过western blot分析，这些单克隆抗体显示出对在55 kD迁移的病毒蛋白的反应性，因此不针对HN。过去，针对新城疫病病毒的抗体是通过使用整体的、主要是梯度纯化的病毒制剂制备的[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．通过这种方法，Lana和同事报告了5个杂交瘤融合实验，产生了20个NDV特异性单克隆抗体，其中只有3个对HI有反应。早前报告[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]从总共184个维持的杂交瘤培养物中获得了单抗，这些杂交瘤培养物通过HI与同源病毒特异反应。所描述的获得足够数量与ND刺突蛋白反应的单克隆抗体的问题可能部分是由病毒颗粒的组成所解释的，该病毒颗粒由充满整个内部病毒粒子的高免疫原性NP蛋白所主导[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．此外，病毒粒子中含有大量在病毒膜下形成阵列的M蛋白[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．通过纳米lc MALDI-TOF/TOF质谱分析，这两种蛋白在梯度纯化病毒制剂中占病毒特异性分子质量的30%左右，只有约10%的病毒粒子是HN分子[11;卡格个人交流]。通过Triton X-100(2%)和1 M KCl破坏梯度纯化的病毒，Nishikawa和同事可以增加HI反应的hn特异性单克隆抗体的比例，从21个单克隆抗体中提取9个[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．我们的方法也使用了Triton X-100和KCl破坏，但我们随后应用了超离心富集HN并耗尽M和NP蛋白。这一过程能够拉下包括NP在内的55 kD带迁移的高比例蛋白质。随后的步骤进一步降低了55kd蛋白的比例，但不足以去除所有蛋白:考马斯染色仍可见一条轻微的条带(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)并与来自ND接种鸡的多克隆抗体制剂反应(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).这可能是HN蛋白与NP蛋白通过基质蛋白相互作用不完全分离的结果[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．因此，经western blot检测，其中3个单克隆抗体在55kd条带上具有反应性(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．然而，western blot与f特异性血清(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)发现F1蛋白的很大一部分存在于抗原制备的第一个颗粒中，表明F蛋白不是抗原的一部分。这将与免疫共沉淀实验的结果一致，表明F和NP以及HN和M的直接相互作用[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．因此，这三种hi阴性单抗很可能是针对NP或P蛋白的。对蛋白质特异性的进一步研究将不得不解决这个问题，并评估诊断方法的潜在效力。更苛刻的颗粒破坏条件可能会改善核衣壳蛋白的损耗，但同时可能会使HN变性并破坏HI表位构象。gydF4y2Ba

总的来说，我们的目标是生产能够阻断基因型2的HN蛋白生物活性位点的单抗。VII NDV通过使用富集hn的纯化病毒部分被证明是成功的。我们已经通过一次融合实验获得了足够数量的hi阳性单克隆抗体，三分之二的杂杂瘤培养物产生了能够阻断受体结合的hn特异性单克隆抗体。gydF4y2Ba

ConA-ELISA检测NDV生物学完整的相关抗原位点gydF4y2Ba

由于同四聚体HN蛋白生物学相关表位的复杂结构[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]，生成与生物活性位点反应的单克隆抗体的方法依赖于具有正确构象的天然HN蛋白，理想情况下来自真核细胞中产生的病毒，确保真正的糖基化和折叠。通过用富集的HN制剂免疫的两只小鼠hi阳性抗体反应，获得了令人放心的证据。然而，为了选择合适的抗体，筛选系统必须以其原生构象呈现测试抗原。当使用间接ELISA技术时，将抗原直接固定在板的塑料表面可能会干扰抗原的构象完整性，重要的表位可能会不可预测地被掩盖或暴露[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．为了避免涂层引起的这种结构改变，Russel和同事使用NDV感染和福尔马林固定的细胞，通过间接免疫过氧化物酶试验来观察特异性反应性[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．本试验的优点是，已经染色的图案可以指示单克隆抗体是否指向外部糖蛋白，该试验依赖于人工检查板，更难以标准化;此外，使用福尔马林可能使敏感表位变性。为了能够使用ELISA技术进行高通量筛选，研究人员使用抗体或聚l -赖氨酸包被板捕获并保存病毒蛋白的构象[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．我们的测试系统依赖于ConA的凝集素特性作为抗原的锚点，该系统以前被证明可以保存病毒糖蛋白的构象表位[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．通过使用基因型2。被HI高度反应的VI特异性单克隆抗体[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，我们可以证明ConA-ELISA保留了对受体阻断敏感的NDV表位。应用Con-A-ELISA法对杂交瘤的初始上清进行筛选，随后进行克隆，获得了6个经ELISA和HI反应的单克隆抗体，6个克隆均经IFT验证。然而，这6种HI阳性单抗均未被WB反应，这与之前的研究一致，即变性WB条件破坏了HN分子HI敏感表位的构象。总的来说，比较ELISA反应性和HI滴度，很明显ConA-ELISA更敏感，产生滴度远高于1:3200，而HI滴度最高为1:6 6 6 (8 loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)，但两者之间并无直接关联。引人注目的是，HI滴度最低的单抗(5C2)的ELISA反应性与其他单抗相当，甚至更高。此外，ConA-ELISA能够显示菌株特异性表位，因为6个hi阳性单克隆抗体中有5个只与NDV基因型2反应。VII株NR730，但不与疫苗株克隆30，基因型2。II, HI。因此，使用富含hn的病毒制剂结合保留构象表位的ConA-ELISA系统被证明是有效的，可以产生适合于识别特定NDV基因型生物学相关靶点的特异性单克隆抗体。gydF4y2Ba

hn特异性单克隆抗体区分菌株特异性和广泛的交叉反应表位gydF4y2Ba

为了研究不同基因型ND病毒HN蛋白hi敏感表位的假定保守性，我们将分析扩展到使用代表远亲1类NDV的NDV毒株以及另外7种2类基因型病毒的交叉反应性。只有MAb 4E11对所有8种不同的NDV基因型均有反应，包括1类菌株。另一方面，大多数HN特异性单克隆抗体主要与同源NDV菌株NR730反应，尽管在这组单克隆抗体中有三种不同的反应谱可识别:(a)单克隆抗体5C2显示与其他三种基因型的剩余交叉反应，(b)三种单克隆抗体(5C9, 5D1, 7C12)与两种不同的基因型2特异性反应。VII株和(c) MAb 7A8在两种基因型2之间分化。七世的病毒。总之，这表明一些HI表位具有高度的灵活性，而其他表位似乎保存得很好。从HN分子的结构分析中得到的观察结果证实了这一点:Crenell和同事发现单抗可以干扰受体结合，即使目标不是受体结合袋本身[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．因此，这些位点对分子的功能可能不是至关重要的，而被允许具有更大的结构灵活性。针对这些位点的抗体的内在特性可能会影响反应的特异性，即具有高亲和力的抗体可能能够结合更广泛的病毒株。另一方面，邻近或直接位于受体结合位点的表位是功能关键结构的一部分，必须保持保守。这些表位将代表基因型中保守的抗原位点，正如单克隆抗体4E11所识别的那样，单克隆抗体4E11显示HI和中和活性。在用于免疫小鼠的HN病毒抗原中，这两种类型的位点都具有明显的免疫原性。考虑到获得的单克隆抗体的数量，即5株特异性的单克隆抗体与1株特异性的一个保守位点，可变位点可能对小鼠更具有免疫原性。相比之下，多克隆抗体制备只显示了微小的抗原差异，表明鸡的保守和菌株/基因型特异性抗原位点的平衡呈现。因此，多克隆血清在定位抗原位点的可变性时价值有限。另一方面，鸡免疫后饲养的多克隆血清能够对广泛的不同NDV基因型做出反应(并中和); this in turn may also relate to cross-protection against currently circulating field strains after vaccination with genotypically distant strains.

进一步研究单克隆抗体的表位定位将有助于阐明这些特异性表位。了解基因型特异性抗体是否识别已知的结合位点，但具有不同的氨基酸配置或基因型2将是有趣的。特异性表位由不同的位点形成。总的来说，我们的研究强调了单克隆抗体在分析抗原位点方面的价值。所建立的单克隆抗体是确定基因型2的第一步。7specific neutralizing sites of NDV based on sequence information and should enable phylogenic analysis of antigenic sites in the future, a prerequisite to elucidate whether antigenic drift was the driving factor for evolution of NDV. In addition, well defined MAbs serve as valuable diagnostic tools to specifically detect NDV antigen for example in lateral flow devices or can be used for serological tests. When, for example, applied in blocking ELISA systems genotype specific reagents would allow to differentiate infected from vaccinated individuals (DIVA) by specifically detecting genotype 2.I, 2.II or 2.VII specific antibodies. The presented work flow provides a powerful method to generate and characterize these reagents.

当前研究期间和/或分析期间的数据集可根据合理要求从通信作者处获得。gydF4y2Ba

AV:gydF4y2Ba

Australia-VictoriagydF4y2Ba

ConA:gydF4y2Ba

伴刀豆球蛋白一gydF4y2Ba

F:gydF4y2Ba

融合蛋白gydF4y2Ba

你好:gydF4y2Ba

血凝抑制试验gydF4y2Ba

接下来:gydF4y2Ba

Heamagglutinin-Neuraminidase-proteingydF4y2Ba

济:gydF4y2Ba

HI-titer区别gydF4y2Ba

如果:gydF4y2Ba

间接免疫荧光法gydF4y2Ba

李:gydF4y2Ba

Large-proteingydF4y2Ba

M:gydF4y2Ba

基质蛋白gydF4y2Ba

马伯:gydF4y2Ba

单克隆抗体gydF4y2Ba

NDV:gydF4y2Ba

新城疫病毒gydF4y2Ba

NP:gydF4y2Ba

Nucleo-proteingydF4y2Ba

OD:gydF4y2Ba

Odipical密度gydF4y2Ba

圆荚体:gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

病人:gydF4y2Ba

Phospho-proteingydF4y2Ba

PPMV-1:gydF4y2Ba

鸽型副粘病毒-1gydF4y2Ba

页面:gydF4y2Ba

聚丙烯酰胺凝胶电泳gydF4y2Ba

转:gydF4y2Ba

每分钟轮数gydF4y2Ba

SNT:gydF4y2Ba

血清中和试验gydF4y2Ba

SDS:gydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠gydF4y2Ba

SPF-chicken:gydF4y2Ba

无特定病原鸡gydF4y2Ba

白平衡:gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

我们感谢Cornelia Illing和Sven Sander出色的技术支持。gydF4y2Ba

由Projekt DEAL启动和组织的开放获取资金。这项工作通过FLI的预算得到了德国食品和农业部的支持。Ibrahim Moharam得到了埃及高等教育和科学研究部的支持。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 诊断病毒学研究所，Friedrich-Loeffler-Institute, Südufer 10, 17493, Greifswald-Insel Riems，德国gydF4y2Ba

   易卜拉欣·莫哈拉姆，马丁·比尔，蒂姆·哈德和克里斯蒂安·格伦德gydF4y2Ba

2. 埃及莫努菲亚萨达特市大学鸟兔医学系gydF4y2Ba

   易卜拉欣MoharamgydF4y2Ba

3. 尼日利亚Vom国家兽医研究所病毒疫苗生产司gydF4y2Ba

   Olayinka AsalagydF4y2Ba

4. 德国Greifswald friedrich - loeffler研究所实验动物设施和生物风险管理部gydF4y2Ba

   斯文ReichegydF4y2Ba

5. Freie家禽疾病研究所Universität柏林，柏林，德国gydF4y2Ba

   哈菲兹哈菲兹gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

I.M:调查，数据管理，形式分析;原创作品草案;O.A:调查;s.r.:调查，写作-评论;h.h.:审稿编辑;m.b.:资金获取，写作评论;T.H。:概念化;审稿编辑;c.g.:概念化，监督，验证，可视化，写作。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba基督教的基础gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

按照合法批准的方案(MV-LALLF- 7221.3-2.5-010/10)进行免疫接种。gydF4y2Ba

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不适用。gydF4y2Ba

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