人疱疹病毒- 6,7,8病毒的多重实时PCR定量:在输血中的应用

背景

近年来，荧光定量聚合酶链反应检测病毒DNA的方法在世界范围内得到广泛应用。然而，考虑到新型疱疹病毒在人群中的广泛分布，我们构建了一种同时检测HHV-6、7和8的方法。

方法

采集了74例献血者和45例玫瑰糠疹患者的血样。构建包含U67、U36和orf65的重组质粒，优化PCR反应体系。HHV-6正向引物和反向引物探针序列分别为TAAATATCGATGCCGCTCTG、ACGTTCTAGCCATCTTCTTTG、CGCAAACGACAAAGCCA。HHV-7正向引物和反向引物探针序列分别为TTAGACATCTTACACGACAGC、cagcttcgaacttgtcac、TTCATCGGGTACGTCCA。HHV-8正向引物和反向引物探针序列分别为:GCGACATATTTCCCTGATCC、CCAACTTTAAGGTGAGAGACC、CATGCGAGCCACCAG。通过管家基因检测、DNA测序、PCR反应体系优化，构建了三重荧光定量PCR检测体系。对输血人员和玫瑰糠疹患者的血样进行了检测。

结果

HHV-6、7、8的单、多重PCR相关性分别为0.980、0.987、0.965。在74份献血者样本中，HHV-6和HHV-7的阳性率分别为16.2%和55%(病毒载量为> 3 log10拷贝/ml)。在45例疑似玫瑰糠疹(PR)感染者中，HHV-6感染者占40%，阳性者占73.3%。

结论

输血安全是公众关注的焦点，该方法在输血筛查中具有良好的特异性和敏感性。

根据世界卫生组织的建议，各国应制定国家政策，对所有捐献的全血和单采血液进行输血传播感染的筛查[1］．输血可以挽救生命，但风险也随之而来。所有捐献的血液都要接受有质量保证的输血传播感染筛查，包括艾滋病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒螺旋体(梅毒)以及在相关情况下对血液供应安全构成威胁的其他感染，如克氏锥虫(南美锥虫病)和疟原虫(疟疾)]，以及血型和相容性测试[2］．

输血相关致命疾病曾被认为是严重免疫抑制个体的一种临床现象。医院输血实验室需要考虑人群感染的流行病学。尽管为献血者设定了一些常规诊断，但“不可避免”的因素仍然存在。基于目前对人类疱疹病毒(HHV)的认识，有必要构建一个疱疹病毒筛查系统。

HHV是一种在人群中广泛感染的流行病毒。其中，玫瑰病毒可在初次感染后以潜伏形式存在，并可在免疫抑制期间被重新激活，特别是在免疫缺陷受体和患有神经系统疾病的患者中[3.，4，5］．

许多新型疱疹病毒已被描述[6，7，8］．这些病毒是红疹病毒，包括HHV-6、7和8。HHV-6和HHV-7是普遍存在的嗜淋巴疱疹病毒，并与巨细胞病毒(CMV)一起归入乙型疱疹病毒亚家族。HHV-8与eb病毒(EBV)一起被归为γ疱疹病毒。

多项临床和实验证据表明，HHV-6和HHV-7可能是一种加速因子，特别是在免疫功能受损的宿主中[9，10，11］．早在2006年，恩格斯和他的同事就提供了HHV-8通过输血传播的证据[12]，提示免疫功能低下患者应该进行HHV-8血液筛查。输血患者较高的发病率和死亡率往往与疱疹病毒感染的再激活有关[13］．

为了构建和完善HHV-6、7、8的筛选体系，我们采用多重实时荧光定量PCR方法，研究了74份健康献血者的血样和45份疑似玫瑰糠疹(PR)感染患者的血样。

菌株

用于测定的标准菌株为HHV-6 (U1102 A型菌株和Z29 B型菌株)、HHV-7 (RK菌株)、HHV-8 (GK菌株)标准菌株;美国马里兰州)。利用这些标准菌株获得重组质粒，并检测引物和探针的特异性。

此外，从湖北省疾病预防控制中心(HBCDC，武汉，湖北，中国)获得的人类巨细胞病毒和单纯疱疹病毒1/2 (HSV-1/2)标准株作为阴性对照。

由于国内有少数研究机构关注HHV-6、7、8，我们从标准株中扩增出了HHV-6、-7、-8的特异性靶基因片段。我们在10处处理HHV-6、7和8质粒⁶浓度作为阳性对照。转染和转化过程已简单提到下面。利用这三种质粒检测多重实时PCR检测方法的重复性。

临床标本标本采集

2019年8月至12月，在湖北省中医院献血中心采集了74名献血者的血液样本。此外，本研究还收集了另外45份疑似感染PR的成年人的血液样本。根据纳入标准选择患者(躯干或四肢皮肤病变，可能是一个2±1厘米椭圆形鳞状斑块，中心区域为鲑鱼色或许多更小的区域[14]，椭圆形，红斑，鳞片状，轻微瘙痒斑)。

这项前瞻性研究总共对119份血液样本进行了研究(74份来自献血者，45份来自疑似PR感染的患者)。所有参与者都签署了研究知情同意书。所有的血液样本都储存在含有柠檬酸钠作为抗凝血剂的试管中。

为了避免溶血对DNA提取的影响，我们没有将全血低温保存。作为替代方法，DNA被立即提取，然后存储在−70°C。

DNA提取

为了避免样本间的污染，我们采取了特别的保护措施:DNA提取和处理使用了不同的房间和专用设备。此外，在PCR设置和分析中，所有移液管尖端都有气溶胶保护过滤器。

从每个全血样本中抽取一毫升来提取DNA模板。根据制造商的协议，使用QIAamp DNA血液迷迪试剂盒(QIAGEN，上海，中国)进行DNA提取。血液样本红细胞压积均在正常范围内(男性0.40 ~ 0.50，女性0.37 ~ 0.45)。使用QIAamp 96病毒试剂盒(QIAGEN, Shanghai, China)提取HHV-6、7和8标准株的病毒DNA。

提取后，用50 μl无菌水悬吊DNA。最后将DNA保存于-70℃，待PCR检测。

引物和探针

根据以往的研究[15，16]、U67、U36、ORF65分别作为HHV-6、7、8的靶基因。从NCBI GenBank序列数据库下载HHV-6A和HHV-6B的U67序列、HHV-7的U36序列和HHV-8的ORF65序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

用于HHV-6、7和8的引物和TaqMan-LNA探针使用信标设计器(PREMIER Biosoft International, Palo Alto, CA)设计。虽然HHV-6、7和8是外源基因，但仍然选择人CCR5基因作为“管家”基因进行扩增，并作为内部控制来确保每个样本中提取的DNA的质量和PCR的适用性。根据布罗克罗的报告[17]，正向引物5 ' -CAAAGCCAATTATCCAGAGCG-3 '，反向引物5 ' - cgctggttgaggatgcga -3'，探针5 ' -6FAM-TACGCAACGC CAACAGACCTAGCGA-BHQ-3'。

HHV-6、7和8引物和TaqMan-LNA探针(表21)由上海生工生物技术有限公司(中国上海)合成。通过BLAST搜索数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。没有发现显著的相似性。

重组质粒

从上海生工获得HHV-6、7、8质粒(分别含有76 bp U67扩增子、147 bp U36扩增子和108 bp ORF65扩增子)和CCR5质粒(含有133 bp CCR5扩增子)。

利用上述质粒构建HHV-6、7、8的单次实时PCR和多重实时PCR标准曲线。人CCR5基因的质粒在每次实验中都被扩增，表明在核酸扩增反应和HHV-6、7和8病毒载量的正常化过程中没有发生完全抑制。

单次实时PCR

为了扩大和量化质粒，我们准备了称职的大肠杆菌DH5α，质粒在其中繁殖。使用QIAamp质粒Midi Kit纯化了4个质粒(HHV-6、7、8和CCR5)，并使用紫外分光光度计测量光密度(OD)260进行定量(SHIMADZU, Tokyo, Japan)。用6.02 × 10计算提取质粒的拷贝数²³(张/摩尔)×A260 (ng / ml)÷(DNA长度×660)=拷贝/毫升。质粒从1 × 10稀释10倍⁷到10²以拷贝数/μl作为检测限，建立标准曲线。每个稀释剂(5 μl)也加入到单个实时PCR反应混合物中。

为排除PCR过程中污染的可能性，阳性对照(10⁶HHV-6、7、8的拷贝/孔质粒)、阴性对照(从HSV-1、2、CMV和无菌水中提取的DNA)和1 × 10的标准DNA⁷到10²在每个实验中扩增副本/反应。

为了优化PCR条件，每个试剂的浓度应归一化(表2)。优化反应条件后，在相应条件下对每种病毒进行PCR。将提取的DNA (5 μl)加入到反应混合物中，使最终反应体积为50 μl。每个样本都对每种病毒进行了重复分析。

退火温度分别为55、58、61、64℃，退火时间分别为25、30、35、40、45、50 s。最佳循环条件为94°C 10 min, 94°C 30 s, 58°C 40 s，循环40次。结果以每毫升全血的基因组当量拷贝数(EqCop)表示。

多重实时PCR

标准DNA为1 × 10⁷到10²每个反应混合副本，并用于构建标准曲线。同样，阴性对照(从HSV-1、2、HCMV和无菌水中提取的DNA)在每个实验中每5个样本进行扩增，包括除标准DNA样本外的所有试剂。

根据单次PCR优化结果，采用PCR (1 ×)缓冲液，4 mM MgCl，反应体积为50 μl，进行多重实时PCR₂、0.48 mM脱氧核苷酸混合物、0.5 U Hotstart Taq DNA聚合酶、0.29 μM HHV-6引物、0.29 μM HHV-7引物、0.31 μM HHV-8引物、0.24 μM HHV-6探针、0.26 μM HHV-7探针、0.24 μM HHV-8探针和5 μl DNA模板。

为了最终计算DNA拷贝数，我们生成了已知数量的标准曲线(10²到10⁷从HHV-6(变异株A U1102和变异株B Z29)、7株(RK株)、8株(GK株)中分离并定量。每个点重复三次，并重复每个点的标准曲线。每个样本和病毒的DNA拷贝数的最终计算由ABI Prism 7500仪器提供的软件进行。

DNA测序

根据S.Yalcin的描述[18]，采用巢式PCR扩增HHV-6 DNA，基本如前所述。设计PCR扩增HHV-6的IE (U90)区域。第一次PCR引物为5 ' -TTCTCCAGATGTGCCAGGGAAATCC-3 '和5 ' -CATCATTG TTATCGCTTTCACTCTC-3 '。第二次PCR引物为5 ' - AGTGACAGATCTGGGC GGCCCTGATAACTT-3 '和5 ' - aggtgctgagtgatcagtttcataaccaaa -3 '。PCR产物大小分别为506 bp(第一次)和363 bp(第二次)。每个样品(5 μl)加入45 μl含有32.5 μl无菌水、5 μl KOD缓冲液、0.2 mM脱氧核苷酸混合物、200 nM引物和1.25 U KOD DASH DNA聚合酶(Promega, Madison, WI)的反应混合物中。第一个PCR循环条件为94°C持续6 min，然后在94°C持续30 s, 62°C持续5 s, 72°C持续15 s进行30个循环扩增。条件与第一次PCR相同，只是使用了内部引物。

根据Yalcin的描述[18]，采用巢式PCR扩增HHV-7 DNA。设计PCR扩增HHV-7主要衣壳蛋白基因。首次PCR引物为5 ' -AGTTCCAGCACTGCAATCG-3 '和5 ' -CACAAAAGCGT CGCTATCAA-3 '。第二次PCR引物为5 ' -CGCATACACCAACCCTACTG-3 '和5 ' - gactcattatggggatcgc -3 '。每个样品(5 μl)加入含有32.5 μl无菌水、5 μl KOD缓冲液、0.2 mM脱氧核苷酸混合物、200 nM引物和1.25 U KOD DASH的反应混合物45 μl中。第一个PCR循环条件为94℃6 min，然后在94℃30 s, 60℃5 s, 72℃16 s下扩增30个循环。用内引物进行第二轮40个循环。

根据Tisdale等人的描述[19]，采用巢式PCR扩增HHV-8 DNA，基本如前所述。设计PCR扩增HHV-8的ORF 75区。首次PCR引物为5 ' - tattcgcggccttggcaac -3 '和5 ' - aagatgcgca CCGCGTTGTC-3 '。第二次PCR引物为5 ' - acgtacagcaggccgagatg -3 '和5 ' - GGAGCTGTCGCGATAGAGGT-3 '。每个样品(5 μl)加入含有32.5 μl无菌水、5 μl KOD缓冲液、0.2 mM脱氧核苷酸混合物、200 nM引物和1.25 U KOD DASH的反应混合物45 μl中。第一个PCR循环条件为94°C持续6 min，随后在94°C持续30 s, 66°C持续8 s, 72°C持续15 s进行40次扩增循环。第二个PCR循环条件为94°C, 6 min，然后在94°C, 30 s, 59°C，和72°C, 12 s，扩增40个循环。

用0±8%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色对PCR产物进行分辨和目视检测。HHV-6、7和8的扩增产物长度分别为423、264和245 bp。HHV-6、7、8 DNA PCR产物及相应内正向引物由生工提供。单方向DNA测序。使用Mega 3.1软件(Mega software, Tempe, AZ, USA)对序列进行校准、检查并纠正分析仪可能的错误。在NCBI Blast项目中与GeneBank数据库中的参考菌株进行了比较。

统计分析

基于HHV-6、-7、-8质粒标准曲线跨度10⁷到10²拷贝数，计算病毒载量，以拷贝数/ml表示。使用ABI PRISM 7500提供的软件计算标准曲线的相关系数(R)值。使用SPSS 16.0统计软件包(SPSS Inc.， Chicago, USA)计算该检测方法的临床敏感性、特异性、绝对一致性和kappa值、标准的变异系数以及多重和单一实时PCR检测病毒载量之间的相关性。所有测试均在5%显著性水平下进行。由于样本量有限，仅提供描述性统计。

内部控制检测

通过内部控制检测方法的重现性。在进行标本的同时，也使用CCR5的内部控制引物进行了相同的实验。所有样本均检出CCR5基因，CT值均低于35阈值。因此，在核酸提取过程中没有发生明显的DNA损失。以CCR5为内对照的实时荧光定量PCR检测结果具有较高的重复性。当比较健康献血者与疑似玫瑰糠疹患者的CCR5含量时，没有观察到差异P> 0.05(数据未显示)。

实时TaqMan-LNA PCR检测的特异性及序列鉴定

如前所述，阳性对照(10⁶每次实验均扩增HHV-6、7、8的拷贝质粒)和阴性对照(从HSV-1、2、CMV和无菌水中提取的DNA)。PCR产物的特异性经凝胶后PCR分析证实。实时TaqMan-LNA PCR检测HSV-1、2或CMV均为阴性结果(CT值> 35)，表明对HHV-6、7、8具有特异性(数据未显示)。

real-time PCR后，电泳也证实了HHV-6、-7、-8标准质粒的产物。但由于电泳的局限性，只有高浓度质粒(> 10⁴副本)是可见的。DNA测序结果显示，HHV-6 (U67)、HHV-7 (U36)、HHV-8 (ORF65)基因片段与各基因对应的GenBank序列相似度为100%。阳性标本的产物相似度为100%。

多重实时PCR检测标准曲线及动态范围

为了构建标准曲线，将HHV-6，-7，-8标准DNA进行十倍稀释，从10⁷到10²采用多重实时荧光定量PCR法，测定其线性度和灵敏度。对于每个点，CT值测量为三次。动态范围约为6 log (1.0²到10⁷相关系数分别为0.9991 (HHV-6)、0.9951 (HHV-7)、0.9926 (HHV-8)。正如预期的那样，拷贝数每减少10倍，CT值平均增加-3.4 (HHV-6为-3.45,HHV-7为-3.34,HHV-8为-3.41)(图5)。1)。HHV-6、HHV-7和HHV-8的实时PCR反应具有相似的敏感性，并且每孔的检测限为100个拷贝。

嵌套PCR的动态范围

为了比较多重实时PCR与巢式PCR的敏感性，阳性对照(10⁶将HHV-6、7、8的拷贝质粒稀释成1、2、3、4、5和6 (log10拷贝/反应)倍。巢式PCR和实时PCR均扩增出相同的DNA拷贝。靶基因超过10个^3.第一轮PCR后显示10个拷贝¹第2轮PCR后显示基因拷贝。

单一和多重实时PCR检测的影响

为了研究单一病毒的单一和多重实时PCR检测之间的影响，将HHV-6、7、8标准DNA连续10倍稀释，范围从10⁷副本至10份²，分别作为单个和多个实时PCR模板。每个点重复三次，避免数据波动。平均数据见表3.．多重实时PCR与单次实时PCR在病毒载量上的相关性未在本表中显示。HHV-6、-7、-8在单、多重PCR中的相关性分别为0.980、0.987、0.965，两者之间几乎没有变化。

应用于献血者及临床样本

共处理119份样品。每个全血样本都是一式两份，一份用于DNA测序，一份用于多重PCR。多重实时PCR与DNA测序的对比如图所示。2(献血者)和图。3.(临床样本)。为了比较样品中的多重实时PCR和DNA测序，我们以敏感性、特异性和约登指数为参考指标，数据见表4．

在75份献血者样本中，HHV-6和HHV-7的阳性率分别为16.2%和55%(病毒载量为> 3 log10拷贝/ml)。共发现HHV6和HHV-7合并感染病例8例。值得一提的是，2个Western Blot样本的HHV-6病毒载量较高(> 7 log10 copies/ml)， 75个WB样本的中位数为7.3(范围从7.2到7.4 log10 copies/ml)。通过DNA测序方法，我们确认所有阳性供体都是HHV-6B变体。

在45例疑似PR感染的患者中，HHV-6感染者占40%，阳性者占73.3%。此外，还检出1例HHV-8阳性样本。临床样本阳性病例病毒载量为5.6 log10 copies/ml，献血者病毒载量为4.2 log10 copies/ml (P< 0.05)。因此，我们得出结论，献血者和PR患者的病毒载量在统计学上有显著差异。

一般来说，血浆或血清中的HHV-6 DNA被认为是活动性感染的一个很好的标记。最近的研究显示，血浆中的HHV-6 DNA并不一定反映远端淋巴组织和器官主动感染所产生的病毒量[20.］．因此，出于本研究的保守目的，只分析了全血样本的结果。

我们发现2例HHV-6高病毒载量病例(> 7 log10拷贝/数目)，认为是染色体整合人疱疹病毒6基因组[21］．

近年来，实时荧光定量PCR技术被广泛应用于β-疱疹病毒的诊断。TaqMan-LNA探针是一种新型的含有2 ' -oxo-4 '碳亚甲基连接的核酸类似物。它限制了核呋喃糖环在这种连接中的灵活性，成为刚性双环。通过这些手段，实时PCR提高了杂交效率和稳定性。与普通的DNA荧光探针相比，单个LNA分子的熔点可达8℃。基于上述原因，设计了基于Taq-Man LNA探针的实时PCR检测方法，并应用于健康献血者HHV-6、7、8的筛查。

在我们的研究中，创建了HHV-6，-7，-8的标准曲线，并表现出良好的线性和相关性。从多重实时PCR与单次实时PCR的对比结果来看，无明显差异(P> 0.05)。

出于隐私的考虑，本研究难以收集病例，病例数量较少。尤其对于HHV-8患者，收集难度较大。有报道显示，HHV-8患者普遍存在于中国少数民族地区。因此，笔者在本研究中分析了由阳性质粒污染引起的HHV-8阳性。

目前临床上针对HHV的诊断手段几乎是空白。同时诊断HHV-6、7、8的手段更少。我们的多重实时荧光定量PCR将有巨大的发展潜力。在我们的报告中，只显示了初步结果。接下来，我们计划通过检测更多的临床样本来进行一些实质性的研究，以监测HHV-6、7和8。

不适用。

巨细胞病毒:

巨细胞病毒

EBV:

巴尔病毒

FQ-PCR:

荧光定量聚合酶链反应

疱疹:

人类疱疹病毒

公关:

玫瑰糠疹

我们要感谢审稿人对这篇论文的有益评论。

一个也没有。

作者及隶属关系

1. 湖北省中医院检验科，湖北武汉430061

   郑毅，赵友云，饶军

2. 湖北省中医药研究院，湖北武汉430074

   郑毅，赵友云，饶军

3. 武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室，湖北武汉430072

   Yefu王

贡献

饶君完成研究设计，郑毅、赵幼云完成实验研究，郑毅、王烨夫完成数据分析，郑毅完成稿件编辑。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Youyun赵或小君饶．

伦理批准并同意参与

我们的研究涉及一个签署了知情同意书的人。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，经湖北省中医院伦理委员会批准。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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