内聚蛋白通过促进RNA Pol II与病毒基因的结合来促进HSV-1的裂解转录gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

单纯疱疹病毒I型(HSV-1)是一种大型双链DNA病毒，可进入上皮细胞的生产性感染并重组宿主细胞核。内聚蛋白是由SMC1、SMC3、SCC1 (Mcd1/Rad21)、SCC3 (SA1/SA2)组成的间期和有丝分裂染色体的主要组成部分，具有多种功能，包括姐妹染色单体内聚、DNA双链断裂修复、转录控制等。内聚蛋白在HSV-1溶性感染中的作用尚不清楚。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

我们使用RNAi方法通过消耗内聚素成分SMC1或Rad21来测量对HSV-1转录、基因组拷贝数和病毒滴度的影响，随后进行免疫荧光、qPCR和ChIP实验，以深入了解内聚素在HSV-1转录和复制中的功能。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这里，我们报道了聚合亚基SMC1和Rad21被招募到溶解的HSV-1复制室。敲低导致病毒转录、蛋白表达和病毒复制区室成熟的降低。SMC1和Rad21的敲除导致RNA pol II总体占用水平降低，但增加了RNA pol II ser5磷酸化与病毒基因的结合。与此一致的是，基因敲除增加了这些基因上H3K27me3的修饰。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些结果表明，内聚蛋白通过促进RNA Pol II的转录活性和防止染色质在病毒基因组上的沉默来促进HSV-1的裂解转录。gydF4y2Ba

DNA病毒家族的疱疹病毒可分为嗜神经性或α型疱疹病毒，如HSV和VZV，它们潜伏感染感觉神经元;嗜淋巴性疱疹病毒，包括EBV、KSHV和CMV，它们在淋巴细胞中形成潜伏感染。最初的疱疹病毒感染开始于上皮细胞，然后转移到注定会潜伏感染的细胞类型[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．单纯疱疹病毒I型(HSV-1)是一种线性双链DNA病毒，具有152 kb的大基因组，编码约80个基因。它在上皮细胞中进入生产性感染，并可在神经节感觉神经元中作为非整合的、核小体相关的外集体建立潜伏感染，以定植宿主核。在溶出感染过程中，HSV-1组装其染色质并依次合成病毒即早蛋白(IE)、早期蛋白(E)和晚期蛋白(L)。由此产生的HSV-1的生产感染导致口腔疱疹、病毒性角膜炎和生殖器疱疹，这是一种严重的疾病，影响18%的美国成年人。gydF4y2Ba

细胞RNA聚合酶II负责病毒基因转录，CTD ser5P (c端结构域ser5磷酸化)修饰形式在转录调控中至关重要[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．宿主染色质组装因子、宿主组蛋白和组蛋白变体也被用于组装HSV-1染色质[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．潜伏期疱疹病毒基因组通常被认为以与宿主染色质相似的方式装入染色质[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]，由紧密排列的修饰组蛋白H3K27me3和H3K9me3组成。gydF4y2Ba

内聚蛋白复合物由SMC1、SMC3、SCC1/Rad21和SA1/2组成，对于染色单体的内聚和分离过程至关重要[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．除了其介导姐妹染色单体内聚的决定性活性外，内聚蛋白在DNA双链断裂修复、转录控制和远程染色体相互作用中也很重要[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．内聚蛋白还涉及病毒与宿主细胞之间的相互作用，其中它与几种DNA病毒相互作用或调节，包括EBV, KSHV和HPV [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．例如，Rad21维持KSHV延迟;其缺失或切割导致KSHV阳性胸腔积液淋巴瘤细胞潜伏感染的KSHV溶性感染[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．内聚蛋白，而不是CTCF，在潜伏期感染中抑制KSHV溶解基因的激活[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在KSHV裂解感染过程中，内聚蛋白和CTCF最初促进病毒转录，但随后抑制KSHV裂解转录。在EBV中，CTCF和内聚蛋白高度富集在LMP1和LMP2A基因中，并通过表观遗传调控促进其转录[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．然而，内聚蛋白在HSV感染中的作用尚未被探讨。gydF4y2Ba

我们研究了两个核心内聚蛋白亚基SMC1和Rad21在HSV-1溶性感染中的作用，发现内聚蛋白被招募到HSV-1复制室，其敲除抑制复制室的形成，提示内聚蛋白促进了HSV-1复制室的形成。进一步的分析表明，内聚蛋白促进了HSV-1裂解基因的转录，因为SMC1和Rad21的下调导致了即早和晚期基因表达的降低。SMC1和Rad21基因敲除均可降低病毒基因组拷贝数和病毒产量。我们进一步证明，内聚蛋白敲除减少了RNA pol II在裂解基因上的占用，但增加了RNA pol II CTD磷酸化ser5的占用率。在染色质水平上，SMC1和Rad21的敲除导致HSV-1基因组H3K27me3富集的升高。这些结果表明，内聚蛋白通过促进RNA Pol II募集到病毒基因来促进病毒的复制和转录。gydF4y2Ba

内聚蛋白SMC1、SMC3和Rad21被HSV-1复制区室招募gydF4y2Ba

为了确定复制的HSV-1基因组是否与内聚蛋白复合物相互作用，我们首先在感染后6小时，即HSV-1复制中心组织良好的时间点，用抗病毒蛋白ICP4的抗体进行了双重免疫染色，以标记人原代成纤维细胞BJ细胞中的病毒复制区室和抗SMC1、SMC3和Rad21的抗体。我们发现所有测试的内聚蛋白成分，SMC1, SMC3和Rad21，都被招募到由ICP4标记的HSV-1复制区区(图4)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．当没有或很少有HSV-1小复制区室时，SMC1、SMC3和Rad21没有形成明显的聚集灶。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA-c黄色箭头)。当HSV-1形成发育良好的病毒区室时，SMC1、SMC3和Rad21与ICP4完全重叠(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA-c白色箭头)。这些数据表明，内聚蛋白被招募到HSV-1复制室，并提示内聚蛋白可能在HSV-1感染中发挥作用。gydF4y2Ba

内聚蛋白敲除导致HSV复制室形成缺陷gydF4y2Ba

受感染细胞核中病毒复制区室的数量和大小以及形成这些区室的细胞百分比是产生性感染的指标。为了研究内聚蛋白是否在病毒复制中发挥作用，我们在BJ细胞中测量了SMC1和Rad21对病毒复制间隔形成的抑制作用。慢病毒介导的敲低在BJ细胞中的作用如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa.在MOI为5时，用HSV-1感染对照细胞和敲除细胞6 h。shrna敲低SMC1或Rad21导致在6 hpi显示IE基因ICP4标记的弥散灶的细胞比例增加(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab(白色箭头和黄色箭头)，而HSV-1倾向于在对照细胞中形成较大且发育良好的隔室(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB，红色箭头和黄色箭头)。数字gydF4y2Ba2gydF4y2Bac(左)显示SMC1或Rad21敲除的例子，显示了ICP4标记的病灶结构、小灶细胞和成熟灶的破坏。我们通过计数ICP4灶形成细胞的百分比和ICP4阳性但扩散染色细胞的百分比来量化敲除的影响(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab, c)，从ICP4阳性细胞的百分比(对照细胞84%，SMC1敲除细胞75%，Rad21敲除细胞79%)可以看出，SMC1或Rad21敲除对HSV-1感染效率有一定影响。然而，通过ICP4位点测量，SMC1或Rad21的敲除损害了HSV复制区室的形成，从对照细胞的72%到SMC1敲除细胞的平均50%和Rad21敲除细胞的54% (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。一致地，ICP4阳性和病灶阴性细胞相应增加，对照细胞增加28%，SMC1和Rad21敲除分别增加44%和46% (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05，图;gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).敲除导致BJ细胞中HSV-1复制中心的形成失败，即使ICP4蛋白表达。在阴性对照细胞中，病毒复制室从扩散状态到明显病灶的成熟速度要快于内聚蛋白敲除细胞，这表明内聚蛋白促进了HSV-1复制中心的形成。gydF4y2Ba

内聚蛋白被敲除导致病毒产量下降gydF4y2Ba

由于内聚蛋白被招募到HSV-1复制室并促进复制中心的形成，我们研究了内聚蛋白在HSV-1复制中的作用。我们在BJ和HeLa细胞中敲除SMC1或Rad21，在MOI为0.1时进行HSV-1感染，并通过qPCR监测病毒基因组拷贝数，在感染后10 h内的多个时间点检测HSV-1基因组复制。我们发现，早在6 hpi时，SMC1或Rad21缺失细胞的病毒拷贝数比对照细胞要少，到10 hpi时，敲除细胞的病毒DNA拷贝数比对照细胞低约两倍(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa, b).敲除SMC1和Rad21在BJ细胞和HeLa细胞中的作用相似。这些结果表明，内聚蛋白对病毒的复制和生长很重要。我们进一步研究了在SMC1和Rad21敲除的HeLa细胞中长达40小时的HSV-1滴度。我们发现在初次感染16小时后，在SMC1和Rad21敲除的细胞中，病毒产量显著降低，达到一个数量级。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).这些结果表明，内聚蛋白是支持HSV-1感染的重要因素。gydF4y2Ba

内聚素在溶解感染期间促进HSV-1的转录gydF4y2Ba

为了研究内聚蛋白如何影响HSV-1复制室发育和病毒转录，我们在人原代成纤维细胞BJ细胞中分析了SMC1和Rad21敲低对代表每个动力学类别(即早期、早期和晚期)的病毒基因转录的影响，包括ICP0、ICP4和ICP8在感染后6小时。我们发现，通过RT-qPCR敲除后，所有三类病毒基因的RNA水平都有所下降(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).在HeLa细胞中，这些基因在0、3、6和9 hpi的时间过程实验也显示了一致的结果，即敲除后ICP0、ICP4和ICP8的表达显著降低(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).这些数据表明，内聚蛋白在调节病毒基因转录中起重要作用，从而参与病毒复制和转录/复制区室的形成。gydF4y2Ba

内聚蛋白和CTCF被独立地招募到HSV-1复制室gydF4y2Ba

CTCF是一种重要的染色体组织者，在细胞核中具有许多重要功能[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．之前我们发现CTCF可以被招募到HSV-1的复制区，并在调节HSV-1的转录和复制中发挥重要作用[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．内聚蛋白和CTCF经常在组织细胞染色质结构和调节基因表达方面合作[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．内聚蛋白依靠CTCF与许多基因组位点结合来发挥转录功能，而CTCF结合的阻断会导致内聚蛋白募集的丢失[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．由于我们发现了内聚素在HSV-1基因表达和病毒生长中的作用，我们想知道内聚素向HSV-1复制区室的招募是否依赖于CTCF。为了验证这一点，我们在BJ细胞中敲除CTCF 48小时，然后在MOI为5的情况下使细胞遭受HSV-1感染6小时。ICP4染色监测HSV-1感染情况。我们发现SMC1被招募到ICP4病灶，并且在存在HSV-1感染时可以与CTCF完美重叠(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, c)，并且这种招募不受CTCF敲低的影响(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab, d).接下来，我们做了互反实验，测试内聚蛋白敲低是否会影响CTCF向HSV-1复制室的募集。在实验中，SMC1或Rad21在BJ细胞中敲除48小时，然后在MOI为5的情况下使HSV-1感染6小时。我们发现，在SMC1或Rad21被敲除后，在存在HSV-1感染的情况下，CTCF仍然被招募到ICP4病灶。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae, f).这些结果表明，内聚力和CTCF被独立地招募到HSV-1复制室。gydF4y2Ba

内聚蛋白敲除导致RNA Pol II募集减少，H3K27me3与HSV-1基因结合增加gydF4y2Ba

内聚蛋白的敲除导致HSV-1基因表达大幅下降，表明内聚蛋白在转录水平上支持病毒生长。因此，我们使用染色质免疫沉淀(ChIP)和qPCR分析测试了内聚蛋白敲除对RNA pol II与HSV-1基因组结合的影响。如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa, SMC1或Rad21的敲除降低了包括ICP0、ICP4、ICP8和UL36在内的可溶性基因对RNA pol II的总体占用，这表明内聚蛋白通过促进RNA pol II的募集来促进HSV-1的转录(图3)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa). RNA Pol II的大亚基具有7个残基肽重复序列CTD，其中这些重复序列中的丝氨酸5可被CDK7磷酸化，丝氨酸2可被CDK9磷酸化[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．分子和全基因组分析表明，Ser5P形式(RNA pol II Ser5P)代表pol II暂停，而Ser2P代表延长形式[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．这些修饰形式的RNA Pol II基因启动子的组成表明转录活性。为了测试内聚蛋白是否也影响病毒基因中总RNAP II的活性和RNA pol II的修饰，我们通过ChIP-qPCR检测敲低SMC1或Rad21后总RNAP II和RNA pol II ser5P的富集情况，发现敲低降低了总RNAP II的富集，同时增加了RNA pol II CTD荧光体ser5的占用(图5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab).总RNAP II的减少以及与病毒基因启动子上游和内聚蛋白敲低细胞编码序列结合的RNA pol II ser5P的增加表明内聚蛋白阻止暂停形式的RNA pol II在病毒基因上的沉积，从而促进转录活性形式的RNA pol II与病毒基因的结合。gydF4y2Ba

这一结果也表明，内聚蛋白可以阻止病毒基因沉默染色质的形成。为了确定内聚蛋白是否也限制了病毒基因组上非允许染色质的占用，我们分析了病毒感染期间内聚蛋白缺失对HSV1基因组上形成多梳相关H3K27me3修饰的影响。ChIP-qPCR结果显示，SMC1或Rad21的敲除增加了病毒基因H3K27me3的整体修饰，包括ICP0、ICP8、VP16和胸苷激酶(TK)(图)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).这些结果表明，内聚蛋白可以通过控制HSV-1染色体的状态来调节宿主细胞与HSV-1之间的相互作用。gydF4y2Ba

在这里，我们证明了内聚素成分SMC1, SMC3和Rad21被招募到HSV-1复制室。SMC1和Rad21在感染早期可促进HSV-1复制室的发育，敲低SMC1和Rad21可导致HSV-1复制和病毒拷贝数下降。SMC1和Rad21通过增加总水平RNA Pol II的募集和阻止沉默染色质标记H3K27me3的富集来促进病毒基因转录。这些结果表明，内聚蛋白通过促进病毒复制室发育和病毒转录促进HSV-1的溶出感染。gydF4y2Ba

内聚素在有丝分裂过程中通过形成环状结构介导姐妹染色单体内聚[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]并通过在多个位点形成长周期循环来调控基因转录[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．内聚蛋白在整个基因组中与CTCF共享许多结合位点[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]，它们一起发挥边界元素的作用，形成大的染色质域[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．内聚蛋白和CTCF共同定位于KSHV基因组的潜在转录本区域，并调节溶解的K14/ORF74转录本[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．它们还结合EBV潜伏期膜蛋白LMP-1和LMP-2A区域的相似位点，并且对于DNA环的形成与质粒复制(OriP)增强子的起源非常重要[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．我们和其他人发现CTCF被招募到HSV-1基因组的多个结合位点，并定位于病毒复制区区的一个子结构[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．在这里，我们发现内聚蛋白组分SMC1、SMC3和Rad21也被招募到HSV复制区，这一结果与其他数据iPOND (Isolation of proteins on DNA)一致，表明内聚蛋白与复制HSV-1基因组相互作用[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．除了直接参与转录外，内聚还可以通过参与DNA修复过程和染色质组织间接促进病毒生长。由于内聚蛋白参与DNA修复过程[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，它可以帮助病毒在复制过程中，解决病毒基因组的复制应激和DNA损伤，抑制病毒的转录和复制。CTCF的独立招募和病毒复制间隔的内聚支持了这种可能性。另外，我们发现内聚素的下调会影响HSV-1复制室的发育，表型与我们在CTCF下调的HSV-1复制中观察到的相似，内聚素也可以在HSV-1复制过程中通过基因组组织发挥支持功能。gydF4y2Ba

重要的是，内聚蛋白可以通过调节RNA聚合酶II活性直接促进基因表达，在全基因组范围内靶向基因[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．内聚成分Rad21的降低导致暂停Pol II向伸长转变的减少[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．在KSHV中，内聚蛋白在潜伏期间抑制KSHV溶解基因的表达，Rad21缺失将KSHV溶解基因ORF45启动子RNA pol II的暂停形式转换为RNA pol II的延伸形式[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．我们之前报道CTCF可以通过促进CTD丝氨酸2磷酸化形式的RNA Pol II的结合和防止病毒基因组染色质的沉默来促进HSV-1的转录[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．在本研究中，我们发现内聚蛋白敲除导致HSV-1溶出基因转录下降，这与CTCF对HSV-1基因表达的影响相似。我们发现RNA Pol II募集的减少和RNA Pol II暂停形式的积累，以及沉默的染色质标记H3K27me3与HSV-1基因结合的增加。因此，内聚蛋白在HSV-1溶性感染中的促进作用不同于在KSHV和EBV中的促进作用。这可能是因为HSV-1通常在初次感染后进入上皮细胞的溶性感染，而KSHV倾向于在B细胞和内皮细胞中建立潜伏感染。HSV-1在上皮细胞中复制迅速，因此与HSV-1感染相关的实验大多在感染后不久进行。KSHV的溶出感染可能需要数天时间，大规模染色质构象可能发挥更大作用。gydF4y2Ba

综上所述，我们发现内聚蛋白促进HSV-1复制和转录，拓宽了对染色质组织者在病原体生命周期中如何发挥作用的理解，并证明了宿主蛋白在病毒与宿主相互作用中的功能多样性。gydF4y2Ba

在本研究中，我们发现内聚蛋白亚基SMC1和Rad21是HSV-1裂解复制所必需的。内聚蛋白的缺失导致病毒转录降低，病毒复制区室成熟和病毒繁殖。内聚蛋白阻止暂停形式的RNA聚合酶II和H3K27me3标记的抑制性染色质招募到病毒基因。这些结果表明，内聚蛋白通过促进RNA Pol II的转录活性和防止染色质在病毒基因组上的沉默来促进HSV-1的裂解转录。gydF4y2Ba

这些方法是根据批准的准则进行的。gydF4y2Ba

细胞和病毒gydF4y2Ba

BJ、HeLa、293T和Vero细胞最初来源于American Type Culture Collection。细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 μg/ml)的DMEM (Gibco)中，5% CO加湿gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba大气温度37℃。HSV-1 17 +由福建医科大学郑春福博士赠予。如前所述，在Vero细胞上培养并滴定病毒[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．在指定的MOI进行病毒感染。简单地说，用无血清DMEM替换培养基，然后加入病毒孵育1 h，然后用普通DMEM替换培养基，加入10%胎牛血清和1%抗生素。所有实验均在昆明动物研究所伦理委员会批准的指导方针下进行，所有实验方案均经中国科学院昆明动物研究所伦理委员会批准。gydF4y2Ba

抗体gydF4y2Ba

抗ICP4单克隆抗体是由Wistar研究所Gerd Maul的实验室赠送的[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．抗SMC1 (ab9262)、SMC3 (ab9263)、Rad21 (ab992)、RNA Pol II (ab5408)、RNA Pol II Ser5P (ab5131)、H3K27me3 (ab6002)和IgG (ab46540)抗体均来自Abcam。CTCF多克隆抗体购自Abcam (ab70303)， CTCF单克隆抗体购自Millipore(17-10044)。Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG (H + L)抗体和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG (H + L)抗体来自Life Technologies。gydF4y2Ba

免疫荧光gydF4y2Ba

在感染前24小时将细胞接种在24孔板的玻璃盖上，并在指定的MOI处进行感染。在5.5 hpi时，用4%多聚甲醛在4℃下固定细胞60分钟，用0.2% Triton X-100在PBS中提取细胞10分钟。用Hoechst33342染色观察细胞核，用特异性抗体染色标记蛋白。图像使用尼康80i拍摄。不同的样品采用不同的通道拍摄图像。图像采用Image J [gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

SMC1, Rad21和CTCF敲除gydF4y2Ba

对于HeLa细胞，sirna被用来敲低指示蛋白。简单地说，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000 (Life Technologies, 11668019)将用于SMC1的sirna GCAAUGCCCUUGUCUGUGAUU，用于Rad21的sirna AUACCUUCUUGCAGACUGU，用于CTCF的sirna GUAGAAGUCAGCAAAUUAA转染到HeLa细胞。对于BJ细胞，用慢病毒传递的shrna敲除指示蛋白。简要地说，SMC1的shRNA ccgggccgggacactgtattcagtatactcgagtatactgaatacagtcccggcttgacagtgtcaactcgagttgacactgtcaacaattagc克隆到pLKO中。1的向量。此外，通过共转染pLKO对慢病毒进行包装。1vector and pRSV-Rev, pMD2.G(VSV-G), pMDLg/pRRE package vector into HEK293T cells. Virion was collected from the medium by centrifuge at 48 h and 72 h after transfection and titrated by qPCR. HSV-1 infection was done after knockdown for 48–72 h.

分离宿主和病毒基因组DNA和RNA进行qPCR和qRT-PCR分析gydF4y2Ba

细胞在MOI为5时感染HSV-1，并在不同时间点收获细胞。使用基因组DNA纯化试剂盒(DP304-03，天根)进行基因组DNA纯化。RNA纯化使用TRIzol (Ambion, 15596-018)。用Prime ScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, DRR047A)反转录1 μg RNA， - 20℃保存。使用FastStart Universal SYBR Green Master (Roche, 04913914001) ABI7900HT，用50 ng cDNA或50 ng基因组DNA进行实时PCR，重复3次。所用引物序列见附加文件1:表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba．每个时间点的病毒DNA或RNA水平相对于0 hpi样本通过ΔCt方法进行量化。为了确定不同时间的相对DNA或RNA含量，将ICP0、ICP4、ICP8和UL30基因的平均Ct值减去18 s的平均Ct值。校准器值(HSV样品0 hpi)减去18 s Ct值。将Ct值减去输入时间点的Ct值，得到ΔΔCt值。ΔΔCt = (CtgydF4y2Ba_{测验gydF4y2Ba}−CtgydF4y2Ba_{参考gydF4y2Ba}) - (CtgydF4y2Ba_{0 hpi样品gydF4y2Ba}−CtgydF4y2Ba_{0 hpi 18 sgydF4y2Ba})．折叠富集值为2gydF4y2Ba^{−ΔΔCtgydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

染色质免疫沉淀反应gydF4y2Ba

ChIP检测按照Chromatin Immunoprecipitation Assay Kit (Millipore)的方案进行，并进行了少量修改。简单地说，细胞在MOI为5时被HSV-1感染。在6 hpi时，细胞用甲醛(Sigma，最终浓度1% v/v)固定。然后加入甘氨酸(125 mM)来阻止反应。细胞用冰冷的PBS冲洗3次，然后从培养皿中刮入微移管。离心5000×，收集细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下10分钟。细胞用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解，超声裂解得到长度在200 - 500 bp之间的DNA片段。样品经13000 ×离心澄清gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃15 min，上清液在蛋白酶抑制剂IP稀释缓冲液中稀释10倍。每个染色质上清保留1/20作为输入样品。采用INVITROGEN公司的Dynabeads Protein G磁支架进行免疫沉淀。染色质上清与5 μg总RNA pol II或RNA pol II ser 5特异性抗体或H3K27me3在4℃旋转孵育过夜。用IgG (Abcam, ab2410)作为对照，测定背景结合。4℃旋转洗涤5min，低盐缓冲液洗涤2次，高盐缓冲液洗涤1次，LiCl缓冲液洗涤1次，TE缓冲液洗涤2次。加入210 μl洗脱缓冲液，65℃孵育15 min，洗脱免疫复合物。以13000转/分的速度旋转珠子1分钟，取200 μl洗脱溶液转移到新管中。交联在65℃、最终浓度为200 mM NaCl下孵育7 h。DNA经QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAGEN, Cat。 No 28104) and used as a template for real-time PCR.

不适用。gydF4y2Ba

1型单纯疱疹病毒:gydF4y2Ba

单纯疱疹病毒I型gydF4y2Ba

BJ细胞:gydF4y2Ba

人原代成纤维细胞gydF4y2Ba

如果:gydF4y2Ba

免疫荧光gydF4y2Ba

我:gydF4y2Ba

感染多重性gydF4y2Ba

现病史:gydF4y2Ba

小时感染后gydF4y2Ba

RT-qPCR:gydF4y2Ba

定量逆转录PCRgydF4y2Ba

芯片:gydF4y2Ba

染色质免疫沉淀反应gydF4y2Ba

RNA Pol II:gydF4y2Ba

RNA聚合酶IIgydF4y2Ba

RNA pol II ser5P:gydF4y2Ba

c端结构域丝氨酸5磷酸化形式的RNA聚合酶IIgydF4y2Ba

H3K27me3:gydF4y2Ba

组蛋白H3蛋白的第27个赖氨酸残基三甲基化形式gydF4y2Ba

我们感谢郑春福的病毒和试剂的友好分享。gydF4y2Ba

本研究得到国家自然科学基金项目(NSFC, U1602226)、国家自然科学基金项目(NSFC, 81672040 to JZ, 31601157 to FL)、云南省应用基础研究项目(2019FB017 to XL;2016FB039至FL);中国科学技术部(MOST, 2018YFC2000400, 2018YFE0203700)，中国科学院“西部之光”计划项目(xbzg-zdsys-201909)，昆明医科大学科技创新团队云南省千人外国人才奖学金，CXTD201804, XC国际科技合作项目(2017IB011)，中国国家科学基金青年科学家基金(NSFC，31802026)和中国科学院院长国际奖学金计划(PIFI, 2019VBA0045)到NF。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 李鑫和俞亚芬对这项工作也做出了同样的贡献gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 昆明动物研究所，中国科学院动物模型与人类疾病机制重点实验室/云南省健康老龄化研究重点实验室，云南昆明650223gydF4y2Ba

   李鑫，于亚芬，郎凤超，陈桂军，王二林，李丽红，李卓然，杨丽萍，周菊敏gydF4y2Ba

2. 安徽大学健康科学研究所，安徽合肥230601gydF4y2Ba

   Yafen余gydF4y2Ba

3. 昆明医科大学第二附属医院重点实验室，云南昆明650000gydF4y2Ba

   夏曹gydF4y2Ba

4. 宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院微生物学系，费城，宾夕法尼亚州，19104，美国gydF4y2Ba

   奈杰尔·w·弗雷泽gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

XL进行CTCF敲除，用YY制作慢病毒，敲除SMC1和Rad21。她还设计了击倒相关的实验，并撰写了手稿。YY进行了病毒DNA和RNA分析，显示SMC1和Rad21敲低对病毒转录和RNA pol II与HSV-1结合的影响。FL对HSV-1复制中心的SMC1招募进行了最初的观察并撰写了手稿。GC、LY和EW进行了病毒培养和组织培养实验。LL和ZL帮助分析量化数据。NF和XC帮助设计实验并撰写手稿。JZ设计了实验并撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaJumin周gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

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