肯尼亚内罗毕低风险自愿献血者HBV的血清流行率和基因型特征

背景

乙型肝炎病毒(HBV)在全球范围内造成显著的发病率和死亡率，这主要是由于它能够引起肝炎、肝硬化和肝细胞癌。肯尼亚国家输血服务机构使用化学发光微粒免疫分析法筛查乙型肝炎抗体。该检测不提供病毒的基因型特征或血液中病毒的实际存在情况。因此，本研究试图确定内罗毕自愿献血者中传播的HBV的血清学和基因型概况。

方法

在普通和EDTA真空器中收集血液样本，并检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。从血浆中提取HBV DNA，扩增其重叠的P/S基因并测序。所得序列用于分析P和S基因的循环基因型和突变。采用双变量统计分析确定人口统计学因素与HBV感染之间的相关性。

结果

血清阳性率为2.3% (n = 7)。19 ~ 28岁年龄组与HBV感染显著相关。9例HBV DNA阳性;其中2例HBsAg阳性，7例HBsAg阴性。基因型A，亚基因型A1被发现普遍存在，同时在S基因的主要亲水区域的“A”决定片段中报告了一些与抗体逃逸相关的突变。检测到RT突变，包括P基因中的突变rt181T，对拉米夫定和其他ʟ-核苷药物产生耐药性。

结论

在这些献血者中，隐匿性HBV感染的患病率很高，因此目前使用的检测平台需要修订。

在全球范围内，约有20亿人感染了乙型肝炎病毒(HBV)，其中约3.6亿人面临因感染而出现并发症的风险。在20亿感染者中，居住在非洲的6500多万为慢性感染者，因此面临HBV相关并发症的风险。这些并发症包括肝硬化和肝细胞癌。撒哈拉以南非洲的乙肝病毒流行率在非洲最高，各国的流行率各不相同[1，2，3.］．在肯尼亚，对不同风险群体的研究报告显示患病率在5%至30%之间[4］．到目前为止，肯尼亚的研究群体包括吸毒者、孕妇、到产后诊所就诊的儿童、艾滋病毒/艾滋病感染者、献血者和全国特定地区的患者。

乙型肝炎病毒主要通过直接接触受感染的血液或其他体液传播。因此，输血前筛查血液乙型肝炎病毒和其他输血传播感染(TTIs)以避免医源性传播的风险已成为标准程序。肯尼亚目前筛查的TTIs除乙型肝炎病毒外，还包括人体免疫缺陷病毒(HIV)、梅毒、丙型肝炎病毒(HCV)，根据地理区域的不同，一些区域还筛查疟疾。肯尼亚目前对献血者血液中HBV的筛查包括使用化学发光微粒免疫分析法(CMIA)对乙肝表面抗原(HBsAg)进行血清学检测，HBsAg是活动性感染的标志。这种检测不提供诊断后的基因型特征，因此让那些被诊断的人私下进行，如果他们愿意这样做的话。此外，这种方法和其他血清学方法的阴性检测结果并不能完全排除病毒的实际存在。

乙型肝炎病毒感染的特点是在经历交替的复制和非复制周期的情况下，呈增减趋势。乙型肝炎病毒感染者可出现急性症状，并可获得对病毒的完全免疫清除，从而获得终身免疫[5］．另一方面，受感染者的另一种命运是发展成一种慢性疾病。感染的三个主要阶段是免疫耐受期、免疫清除期和失活载体期。非活性载流子状态可以发生交替再激活或不发生。

受感染的个体在其血液中仍保持乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性和高浓度的HBV DNA。HBeAg是一种分泌蛋白，表达于肝病毒科虽然它的表达并不是维持感染所必需的[6］．在一些受感染的个体中，症状可能不会出现，甚至在肝脏中经历最小的组织学活动。免疫耐受期是最具传染性的阶段，持续约2-4周。最后一个阶段包括免疫清除阶段，在进入带菌者阶段之前可能会持续几个月或几年。载体期的特征是血清中HBeAg转化为HBeAb, HBV DNA可能变得无法检测[5，7，8］．

HBV基因组是一个松散的环状DNA (rcDNA)，部分是双链的。基因组由4个重叠的开放阅读框(orf)组成，每个都翻译成病毒结构的不同组成部分。编码区域的重叠结构有助于在复制过程中高效利用HBV基因组[9］．HBV目前被分为十种不同的基因型，A-J基于HBV基因组中存在的超过8%的核苷酸差异[10，11，12］．两种基因型(A和D)被进一步划分为亚基因型。这是基于全基因组中4-8%的组间核苷酸差异，并有良好的引导支持[13，14］．研究表明，不同的基因型和亚基因型具有明显的地理分布。例如，十种基因型中的三种，A, D, E，在非洲更为普遍，而基因型C在一些非洲人群中也有描述，尽管与其他三种相比不那么普遍。

在肯尼亚，基因型A、D和E已被报道，基因型A在大多数被研究人群中占主导地位。根据Webale等人。[15]， HBV基因型A，亚基因型A1被发现在HIV-1感染的成年人中有很高的患病率。这些发现与2015年之前进行的研究相似。之前在全国范围内的自愿献血者中进行的一项研究发现，基因型A，亚基因型A1和基因型D，亚基因型D4是最普遍的[4］．由于病毒的遗传多样性表现出时空变化，本研究试图确定肯尼亚内罗毕自愿献血者中循环的HBV基因型。

研究背景

这项研究是在内罗毕地区输血中心(NrBTC)的自愿献血者中进行的。该中心提供来自自愿献血者和替代献血者的血液采集，对不同的血液制品进行筛选和处理。该中心的HBV筛查遵循国家指南，其中包括使用CMIA作为主要方法和酶联免疫吸附试验(ELISA)作为备份来检测HBsAg。经过测试的血液和加工产品随后被分发到不同的医院，供病人输血。

研究人口和伦理因素

这是一项横断面研究，在符合国家指南献血标准的自愿献血者中进行。这项研究得到了肯雅塔大学伦理和审查委员会(KU-ERC)的批准。自愿献血者参加这项研究没有受到强迫，也没有得到报酬。

入选标准

所有符合肯尼亚国家输血服务机构(KNBTS)献血要求的献血者都有资格纳入这项研究。这些要求包括;

• 捐赠者的年龄必须在16岁到65岁之间，但纳入研究的年龄必须在18岁到65岁之间。

• 捐献者的体重必须不少于50公斤。

• 受试者血红蛋白不低于12.5 g/dl，并知情书面同意参加研究。

排除标准

不符合KNBTS问卷中规定的献血资格的人被排除在研究之外。这些包括;

• 小于16岁和大于65岁的人以及小于18岁和大于65岁的人不被允许参与这项研究。

• 体重低于50公斤者。

• 血红蛋白低于12.5 g/dl和未签署参与研究同意书的个体。

样本量测定

最小样本量(n = 178)采用修正的Fischer公式[16]根据Kerubo等人的研究，内罗毕献血者的HBV血清流行率为13.3%。[1］．然而，我们收集了更大的样本量(n = 300)并进行分析，以保证每天收集10-15个样本的统计能力。

样品采集与处理

参与者是从不同的献血地点随机选择的，因为他们是由NrBTS不时确定的。向他们解释了研究方案，并在获得书面同意后;研究人员向他们发放了调查问卷，以了解他们的人口特征。献血后，立即从献血者的血袋延长管中注入5mls到普通真空吸尘器中，然后再注入5mls到EDTA真空吸尘器中。然后对样本进行保密编码。收集的普通管和EDTA真空器样品在1500 rpm离心10 min后分别获得血清和血浆。然后将得到的血清和血浆倒入低温瓶中，在−80°C保存，等待进一步处理。

乙肝病毒血清学

根据制造商的说明，使用Architect i2000 SR系统，通过化学发光微粒免疫分析法(CMIA)对所有样本的血清进行HBV感染筛查。

DNA提取

从所有收集的血浆样本的200µl中提取HBV DNA试剂盒DNeasy DNA提取试剂盒(试剂盒,Hilden，德国)根据制造商的说明。

PCR和测序

使用先前描述的嵌套PCR方案对所有样本进行重叠的HBV P和S基因扩增[17］．第一轮反应在含有DreamTaq DNA聚合酶、优化的DreamTaq缓冲液、MgCl的25 μ l DreamTaq PCR master mix(美国赛默飞飞科学公司)中进行₂和核苷酸。样品在94°C初始变性2分钟，然后进行35个循环，包括94°C变性45秒，53°C退火30秒，72°C拉伸30秒。最后在72℃下延长2 min。取第一轮PCR产物5µl作为模板，在相同的反应条件下进行嵌套PCR，但使用内引物。每次试验均采用阳性对照和阴性对照。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，并在紫外光下进行解释。然后用虾碱性磷酸酶外切酶I (ExoSapI)纯化HBV PCR阳性扩增物，并在3500xl遗传分析仪(Applied Biosystems, CA, USA)上直接使用Sanger方法测序。

数据分析

收集到的所有人口统计数据(性别、教育程度和年龄)被制成表格并输入Microsoft Excel®电子表格，然后导出到SPSS version 20 (IBM，芝加哥，伊利诺伊州，美国)进行分析。供体中HBV的血清流行率由CMIA检测呈阳性的个体所占的比例确定。采用双变量统计分析确定人口统计学因素与HBV感染之间的相关性。这些变量被认为与乙型肝炎病毒感染有关p值< 0.05。

研究样本的HBV连续核苷酸序列使用BioEdit ver 7.2.5手动组装和编辑[18]，然后使用MEGA X中实现的ClustalW与参考序列(基因库登录号KP168426.1)对齐[19］．然后用MEGA X软件采用最大似然法构建系统发育树[20.］．通过1000次自举重复评估树的稳健性[21］．使用两种在线工具gengen2pheno HBV数据库(HBVdb)对获得的HBV序列进行分析，以确定其基因型，并评估可能的耐药性和免疫逃逸突变(https://hbv.geno2pheno.org/)和HBVseq项目，来自HIV斯坦福数据库(https://hivdb.stanford.edu/HBV/HBVseq/development/HBVseq.html)．所得到的序列存入基因库，登录号为MT185642-MT185650。

研究人群

研究共招募了300名自愿献血者，其中大多数是男性;59.3% (n= 178)， 0.7% (n不愿意透露自己的性别。大部份研究对象受过高等教育，占69% (n= 207)， 18% (n= 54)受过中学教育，2.3% (n= 7)为小学学历，10.7% (n没有透露他们的教育水平。大多数研究参与者，50.67% (n= 152)，年龄在19至28岁之间，占33.3% (n= 100)，年龄在29至38岁之间，而11% (n年龄在39岁到48岁之间。其余的2.6% (n=8)，年龄介乎49至58岁，1.0% (n=3.)，年龄介乎59至68岁，1.3% (n=4)，他们不愿意公布自己的年龄，但愿意参与这项研究。

血清学

基于化学发光微粒免疫分析(CMIA)结果，97.6% (n= 293)样本HBsAg阴性，2.3% (n测试呈阳性。这些结果表明，内罗毕献血者的HBV血清流行率为2.3%。

人口统计学因素及其与HBV感染的关系

在献血者中，教育程度与HBV血清阳性无相关性(p= 0.993) HBV血清状态与性别之间也无相关性(p= 0.658)。但HBV血清阳性与年龄有显著相关性。年龄在19至28岁之间的参与者更有可能是HBsAg阳性(p= 0.001)。

流行的HBV基因型

HBV DNA扩增在7个HBsAg阳性样本中只有2个成功，在293个HBsAg阴性样本中有7个可能，因此隐匿性HBV感染(OBI)的患病率为2.4%(7/293)。在成功扩增的9份HBV DNA样本中，3份来自男性，6份来自女性。系统发育分析显示，所有病毒都属于A基因型，如图所示。1．进一步分析表明，两者均属于A1亚基因型，核苷酸水平相似度为96 ~ 100%，平均相似度为96.48%(表1)1)．

HBsAg逃逸突变

表中显示了S基因主要亲水区域(MHR)以及MHR以外的逃逸突变2．这些突变与血清学检测不佳有关。在S区共发现6个突变。其中3个突变位于s基因“a”区域内，分别为T143M、M133T、D144G; 3个突变位于MHR内但在“a”区域外，分别为T114P、A159V、F158L。在MHR以外的S区发现3个突变，即Y206E、A194V、S207K。

耐药突变

本文描述了HBV P基因突变与耐药的相关性。在一些样品中检测到耐药突变。在一个样本中描述了对拉米夫定(Zeffix®)、阿德福韦(Hepsera®)和Telbivudine (Tyzeka®& Sebivo®)具有耐药性的突变rt181T。对拉米夫定耐药的M129L和V163I突变在所有9个样本中描述的RT基因中最为普遍。RT区描述的其他突变为S202G、N122P、Y126H、S109P、N122H、S202R、S202P和M204R(表23.)．

目前的研究表明，内罗毕献血者中乙肝病毒的血清流行率为2.3%。与肯尼亚纳库鲁和滕韦克教会医院使用ELISA检测报告的同一人群5.6%的血清流行率相比，这一流行率较低[222014年使用Murex HBsAg版本3(一种快速而敏感的酶免疫测定法)收集的样本中，2016年尼耶里献血者中报告的比例为2.4% [23］．另一方面，这一患病率高于2018年埃尔多雷特报告的0.4% [24]，低于2018年基苏木、荷马拜和西亚亚县的3.46% [25］．这些血清流行率的差异可能归因于地理位置的差异以及不同研究中用于检测HBsAg的筛查技术的敏感性。

在28岁及以下的献血者中，乙型肝炎表面抗原的流行率明显较高，这与自2001年该国引进乙型肝炎疫苗以来可能会降低的预期相反[26］．然而，这一发现与最近在肯尼亚进行的研究不同，后者记录了较高年龄组的HBV流行率较高。Kiyeng等。[24]的研究发现，31岁至40岁年龄组的HBV流行率较高，且随着年龄的增加，HBV阳性反应显著增加。在他们的研究中，Bartonjo等人。22]记录了Tenwek大多数患有TTIs的捐赠者年龄在36到40岁之间。这一发现可能归因于HBV基因组S基因B细胞表位(aa106-aa117、aa122-aa148和aa160-aa207)和T细胞表位(aa94-aa105、aa106-aa117和aa136-aa155)的突变。这些表位区的突变可改变其Pre-S、S和聚合酶的体液和细胞免疫表位，甚至在接种疫苗的人群中也可导致HBV感染[27］．本研究检测到的常见b细胞和t细胞表位突变包括S109P、T114P、N122P、N122H、Y126H、M129L、M133T和T143M。这些突变可能发生在研究对象身上，也可能感染了免疫逃逸突变体。

本研究发现献血者中流行的基因型是A亚基因型A1，这与Owuor等人报道的类似研究结果一致。[4］．目前的研究没有发现任何其他基因型，尽管其他研究发现了基因型D [4，28和E [29］．先前在肯尼亚不同群体中进行的其他研究也证实了A型基因在当地的主导地位[15，28，30.，31］．

最近进行的研究表明，血清学测定的敏感性主要受S基因HBsAg部分突变的影响。这些突变发生在主要亲水区域(MHR)的“a”决定区域(aa124-aa147)，该区域由aa99-aa169衍生而来，当单独使用HBsAg进行HBV筛查时，可能导致假阴性。在这项研究中，在s基因的“a”决定区域确定了三个突变。在两个不同的样品中发现了T143M，在一个样品中也发现了M133T和D144G。在这三个突变中，T143M影响了样本中HBsAg的检测，因为该突变仅在HBsAg阴性的样本中检测到。这一发现与Nyairo等人此前报道的一项研究相似。[33］．T143M突变是一种已知的突变，以前曾被描述为改变变体HBsAg的抗原性。它还与诊断分析中的问题以及逃避疫苗和HBIg治疗有关[32，33］．

发生在MHR下游的两个突变，即S207K、A194V和其他两个在MHR区域内但在“a”决定因素区域外的突变;T114P, F158L也影响了HBsAg的检测，因为在这些突变的样本中没有检测到抗原。这些发现与先前的研究一致，即S基因的“a”决定区域以及其他区域的突变可以影响疫苗逃脱的乙型肝炎感染的诊断和检测[34］．因此，从该人群的HBsAg阴性样本中提取HBV DNA可归因于带有突变的病毒循环，这些病毒在血清学分析中干扰了抗体对HBsAg的识别。在一个样本中还检测到两个逃逸突变，M133T和D144G，分别与检测和疫苗/治疗相关。然而，没有HBV疫苗接种或具有这些突变的特定供体的治疗史的信息。

在7个HBsAg阴性样本中提取HBV DNA, OBI患病率为2.3%。因此，这项研究证实了OBI在这一人群中的存在。这可以归因于S基因中描述的突变。一般来说，所有7个OBI阳性样本都在S基因的MHR区域和MHR下游区域发生突变，而只有一个HBsAg阳性样本发生突变。这些样本被宣布为阴性，并释放血液用于输血，而实际上他们的HBV感染呈阳性。虽然本研究报告的流行率与Langat等人之前的研究结果相比更高，后者报告献血者中没有隐性感染，但本研究与Mabeya等人后来进行的研究一致，后者报告艾滋病毒患者中OBI的流行率为2.25% [35，36］．然而，与Jepkemei等人报道的8.3%至30.8%的患病率相比，该患病率较低。[37]在不同HBV感染高危人群中[37］．

本研究中描述的P基因的大多数突变是原发性耐药突变，降低了对核苷类似物的易感性。在这些序列中，有一个突变A181T赋予拉米夫定(LMV)抗性。这种突变影响病毒复制所需的HBV逆转录酶活性，从而导致潜在的耐药和肝病的进展[38］．LMV在肯尼亚被广泛用于艾滋病毒治疗以及暴露前和暴露后预防。虽然尚未确定该患者过去是否接触过该药物和其他核苷类似物，但rt181突变已在全球不同队列的antiretroviral-naïve个体中广泛描述。RT基因中M129L和V163I突变最为普遍。这些突变在之前的治疗naïve和LMV患者中都有描述，这些患者与基因型a有很强的相关性[39，40］．本研究中发现的几种突变以前被描述为对特定药物产生耐药性。正如Choi等人。[38]的记录中，本研究中检测到的Y126H突变已被描述为对阿德福韦酯(ADV)产生耐药性，而S202G突变也被描述为对恩替卡韦和拉米夫定产生耐药性。突变Q215E先前也被描述为引起对LMV和ADV的耐药性[38］．

研究的局限性

这项研究没有调查HBV病毒载量的数据，更多的血清学标记物和肝酶，特别是受影响的个体。因此，这就排除了将研究结果与受影响患者的临床结果相关联的能力。该研究也没有对个体进行随访，以监测诊断后的进展情况，因此本文没有报道疾病进展模式，特别是在隐匿性感染的个体中。

总之，我们的研究结果证实了基因型A在肯尼亚的流行，并确定了在这一人群中以前没有报道过的隐匿性HBV感染。这些研究结果表明有必要审查国家HBV筛查方案，以确保给予患者的血液和血液制品的安全性。此外，该研究重申了将核酸检测纳入HBV筛查的必要性。

在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在本文及其补充信息文件中。这些序列保存在基因库中，登录号为MT185642-MT185650。

艾滋病:

获得性免疫缺陷综合症

CMIA:

化学发光微粒免疫分析法

背景:

脱氧核糖核酸

EDTA:

乙二胺四乙酸

ELISA:

酶联免疫吸附试验

乙肝病毒:

乙型肝炎病毒

表面:

乙型肝炎表面抗原

肝细胞癌:

肝细胞癌

艾滋病毒:

人类免疫缺陷病毒

KNBTS:

肯尼亚国家输血服务中心

子:

开式阅读架

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

rcDNA:

松弛环状脱氧核糖核酸

SPSS:

社会科学统计包

作者要感谢研究参与者的参与。

这项研究是由个人作者资助的。

作者及隶属关系

1. 内罗毕技术培训学院卫生和应用科学系，肯尼亚内罗毕

   Patrick Okoti Aluora

2. 肯雅塔大学医学检验科学系，肯尼亚内罗毕

   Patrick Okoti Aluora, Margaret Wangui Muturi和George Gachara

贡献

POA、GG和MWM设计研究，POA收集样本和人口统计数据，POA和GG进行实验室分析并分析数据。POA, GG和MWM共同准备了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Patrick Okoti Aluora．

伦理认可和同意参与

该研究由肯雅塔大学伦理与研究审查委员会(KU- errc)批准，申请编号为PKU/826/I892，批准编号为KU/ERC/ approval /Vol.1(161)。此外，还寻求并获得了国家输血服务局的授权，并获得了国家科学、技术和创新委员会的研究许可。此外，研究人员还征求了年龄在18岁至60岁之间的自愿献血者的书面知情同意。自愿献血者参加这项研究没有受到强迫，也没有得到报酬。在数据收集过程中，捐赠者的身份使用特殊号码进行编码，以确保他们的个人数据不会导致他们的身份。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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