多基因靶向sirna下调Ie2和DNA聚合酶基因介导的新型大鼠巨细胞病毒(株All-03)抑制

背景

巨细胞病毒(CMV)是一种机会性病原体，可引起先天性感染的新生儿和无免疫功能的个体严重并发症。开发一种有效的疫苗是一项重大的公共卫生优先事项，目前的药物正在应对对接受者的耐药性和副作用。在本研究中，为了探索对抗巨细胞病毒复制的新策略，研究人员鉴定了几种靶向IE2和DNA聚合酶基因区域的抗巨细胞病毒sirna，并将其联合用于抗病毒治疗。

方法

在CMV ALL-03株感染大鼠胚胎成纤维细胞(REF)之前，用多种siRNA转染。采用组织培养感染剂量(TCID50)、细胞病变效应(CPE)和液滴数字PCR (ddPCR)检测病毒生长抑制，实时荧光定量PCR检测IE2和DNA聚合酶基因敲除。更昔洛韦(Ganciclovir)作为对照，以各自siRNAs的抗病毒活性为基准。

结果

MTT比色法分析REF细胞上的所有siRNAs组合均未发现明显的细胞毒性(P> 0.05)。与对照组相比，RCMV ALL-03感染细胞的细胞病变效应(CPE)明显减少，发展速度也慢得多。目标基因的表达被成功下调，结果显著降低(P病毒mRNA和DNA拷贝数< 0.05)(dpb + dpc: 79%， 68%;Dpb + ie2b: 68%， 60%;Dpb + dpc + ie2b: 48%， 42%)。流式细胞仪分析显示，与对照组相比，联合sirna处理的细胞有更大比例的存活和早期凋亡。值得注意的是，靶向基因区域的siRNAs被测序，没有遇到突变，从而避免了具有潜在耐药病毒的突变体的形成。

结论

在结论。该研究展示了一种巨大的创新方法，即部署同时针对多个基因的组合sirna，以控制宿主细胞中的CMV复制。

巨细胞病毒往往体贴如沉默的公共卫生负担，通常感染后不产生任何症状。主要原因是一旦病毒复制被宿主免疫系统控制，病毒就有能力进入无症状感染[1，2］．然而，CMV在免疫功能低下的移植手术患者、诊断为艾滋病患者和三度烧伤伤者以及一定程度上的老年人中可引起危及生命的情况[3.，4，5］．不幸的是，未出生婴儿的免疫系统不成熟，容易感染巨细胞病毒，引起小头畸形、智力迟钝和听力丧失等并发症[6，7］．在广泛的真核生物中，RNAi一词通常被理解为由双链rna触发的转录后沉默的进化保守机制。这个系统最初是在线虫中发现的秀丽隐杆线虫(8］．慢慢地，RNAi的应用成为一种更广泛的进步浪潮，已被用作许多传染病、癌症和神经功能障碍的治疗方法[9，10，11，12，13，14，15］．引入合成的21-23个siRNA核苷酸可特异性抑制细胞mRNA，以控制基因表达[16］．迄今为止，已有多项研究报道，通过传递siRNA，抑制越来越多的人类感染性病毒的病毒复制和基因表达有前景[12，17］．这表明，更多地关注siRNA可能会产生有趣的发现，更多地解释siRNA作为未来治疗的抗病毒策略的利用。越来越多的研究工作证明，无论RNA或DNA，无论单链或双链结构，RNAi都能抑制或抑制大部分病毒。针对不同保守区域的RNAi组合有望有效降低病毒逃逸的机会。例如，在其他单一疗法中，序列特异性RNAi面临的问题是，由于靶区突变导致病毒逃逸，导致病毒突变体生长[18，19，20.］．这一说法得到了脊髓灰质炎、HIV和HCV等少数研究的证实，在这些研究中，单个siRNA的病毒活性效率下降[19，20.，21］．病毒进化到通过编码“抑制RNAi沉默”(SRS)来逃避宿主RNAi，这是单独使用siRNA的另一个缺点。针对病毒基因组不同区域的SiRNA鸡尾酒降低病毒突变形成的几率，防止病毒逃逸[22，23，24，25］．然而，除了病毒感染之外，siRNAs还可以用来同时沉默多个基因，这可能有利于治疗涉及多个基因改变的脑肿瘤，也可以靶向合适的凋亡基因作为治疗方法[26，27］．此外，维持包括朗格汉斯胰岛在内的多种细胞的可用性可以为sirna用于糖尿病研究提供强大的基础[28，29］．因此，探索sirna组合作为马来西亚CMV分离物的潜在治疗方法已经为治疗目的地做好了准备[30.］．有趣的是，这种局部毒株(RCMV ALL-03)已被发现穿过胎盘感染幼崽，使其适合于动物模型上的先天性感染[31］．该病毒全基因组序列的获得为其致病性研究和抗病毒药物的开发增添了更多的优势[32，33］．因此，本研究旨在筛选siRNA组合抑制RCMV ALL-03病毒复制和基因表达的效果。

siRNA组合的选择

siRNA组合是根据抑制RCMV ALL-03复制和基因表达的单个siRNA的连续百分比来选择的(数据未显示)。测试的siRNA组合为dpb + dpc、dpb + ie2b、dpc + ie2b和dpb + dpc + ie2b，其中dpb和dpc siRNA靶向DNA聚合酶区域，而ie2b靶向Immediate early 2区域。设计的siRNAs序列见表1．

细胞培养、转染及病毒感染

在添加DMEM营养液的10%胎牛血清中培养大鼠胚胎成纤维细胞。细胞保持在5%的CO₂37°C的培养箱。在转染siRNA之前，将细胞播种在6个孔板上，达到70-80%的合流水平。24 h后，将组合siRNAs与lipofectamine 3000转染试剂(1.5 μl/孔)一起转染。在每个孔中，将sirna混合以产生最终浓度为300 pmol/孔。在24小时孵育后，还纳入了适当的治疗和非治疗对照。同时，在培养过程中，转染后6 h更换不含抗生素的DMEM培养基，避免污染。然后用大鼠子宫和胎盘分离的RCMV ALL-03感染细胞[30.] MOI为1。培养皿孵育1小时，然后用冷PBS清洗细胞，然后加入添加10%血清的新鲜DMEM培养基。然后连续监测细胞CPE的发生情况，并在适当的时间点收集培养的细胞进行所有分析。治疗组以更昔洛韦为阳性对照，以scramble siRNA为阴性对照，未治疗组以未感染细胞为阳性对照，未感染细胞为阴性对照。每个siRNA组合被复制，并独立执行两次。

细胞活力测定

优化密度的细胞，1 × 10⁵在96孔板中添加DMEM培养基和10% FBS。细胞在37°C下孵育24小时。一旦建立细胞用于处理，就丢弃培养基，用冷PBS冲洗融合细胞。转染组合siRNAs并在37°C下孵育，不感染病毒。分别于24、48和72 h的时间间隔从培养箱中取出。采用MTT法检测细胞活力。所有细胞用PBS洗涤两次，然后加入(5mg /ml) MTT(四氮唑染料，3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴化物)试剂，37ºC孵育4小时。MTT添加过程在黑暗区域进行，由于MTT对光的敏感性，在4小时的孵育过程中，板上覆盖铝箔。随后小心丢弃MTT试剂，每孔加入200 μl二甲亚砜。然后，再次用铝箔覆盖在盘子上，在室温下放置20分钟。这是为了确保甲醛染料的结晶完全溶解成紫色。 Lastly, the results were obtained from the measured absorbance at 570 nm using a spectrophotometer microplate reader. Each assay was performed in triplicates and the cytotoxicity was calculated from an average of 3 replicates. The final results are presented as mean ± standard deviation.

用TCID 50滴定有效组合siRNAs

采用TCID50研究在感染后不同时间间隔(第10天和第18天)，联合sirna对控制RCMV ALL-03滴度的影响。转染组合sirna后，REF单层细胞被MOI 1 RCMV ALL-03感染。分析每个组合sirna转染样本的TCID50，并与之前报道的未转染病毒对照组的TCID50进行比较[34］．所有治疗均进行三次重复，结果以均数±SE表示。

流式细胞术分析细胞凋亡

采用流式细胞术检测活细胞率、早期凋亡细胞率;siRNA组合处理组和对照组晚期凋亡细胞和坏死细胞。样品采用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(Nacalai Tesque, Japan)制备。首先，用冷PBS清洗细胞两次，然后胰酶化，将细胞从培养板上分离出来。简单地说，1 × 10⁶细胞/ml重悬于Annexin V结合液(1×)中。然后，100µl悬浮细胞与5µl Annexin V-FITC Conjugate和5µl碘化丙啶(PI)在室温下孵育。15 min后，在样品溶液中加入400µl Annexin V结合液(1×)，使用FACSCalibur流式细胞仪(BD, Bioscience, USA)进行分析。

液滴数字PCR

液滴数字PCR是一种新兴的第三代核酸检测方法，可以对任何目标序列进行绝对定量，不需要标准曲线。在ddPCR实验开始前，针对DNA多聚区设计引物和探针，采用IDT技术按照标准程序合成。引物序列为CCGAAGTACCAGATTCAA(正向引物)、GACGAGAGGGAGTATATT(反向引物)和FAM-CGGACGGTGAACTCGTTTTT-TAMRA (Taqman探针)。实验开始时，每个反应制备11 μ l的反应混合物。然后，在反应混合物中分别加入1.98 μ l正向引物和反向引物，然后加入0.55 μ l探针。样品的标签如表所示2．然后加入5.49 μ l无dnase水。然后通过上下移液将所有成分正确混合。在每个反应管中均匀分配21µl。然后在PCR管中加入相应的1µl DNA样本。反应再次适当混合，并允许在室温下平衡约3分钟。一旦反应混合物准备就绪，20µl PCR反应混合物然后装入DG8™Cartridge的样品井中，70µl液滴生成油装入油井中。将装有样品的墨盒放置在Q × 200液滴发生器内，对样品进行分离，使液滴产生2分钟。然后将得到的液滴小心地转移到一个干净的96孔板中。然后用P × 1 PCR板封口机用箔纸封板。进行PCR热循环，将密封的96孔板置于Q × 200液滴仪中，检测阳性液滴和阴性液滴。使用QuantaSoft™软件对所得结果进行分析。

RCMV ALL-03的细胞病变率

病毒的复制可以通过正常细胞的物理外观变化间接地识别出来。它也被称为细胞病变效应(CPE)监测。为了确定组合sirna的疗效，使用尼康Eclipse TS100倒置显微镜(尼康仪器公司，纽约，美国)对转染孔进行病毒诱导的CPE监测至感染后18天。比较并记录所有转染组合sirna的图像以及其他对照组的图像。

实时RT-PCR处理样品

通过CFX96TM实时PCR检测系统(Bio-Rad, USA)，使用优化设计的Taqman探针对处理后的组合sirna进行基因表达研究。由于组合siRNAs具有两个不同的基因靶点:IE2和DNA poly，因此每个组合siRNAs都对这两个基因的表达进行了分析。所有引物和探针都进行了优化，并生成了相应的标准曲线(附加文件1:图S1)。使用GENEzol™TriRNA Pure试剂盒(Geneaid, UK)进行轻微修改，从对照样品和siRNA处理样品中提取RCMV ALL-03 mRNA。RNA最终在30 μ l无rnase水中洗脱，并保持在−70°C下进行进一步分析。采用Nanodrop 1000分光光度计(Thermo Scientific™)对提取RNA的数量和质量进行分光光度计测定。接下来，按照制造商的说明，使用Tetro cDNA合成试剂盒(Bioline，英国)在热循环仪(BioRad，美国)上合成互补DNA。将制备好的cDNA保存在−20℃下进行后续分析。最后，利用CFX96™实时PCR检测系统(Bio-Rad, USA)设计的Taqman探针对处理后的组合siRNAs进行基因表达研究。每个siRNA区域使用特定的引物和探针，如表所示3.．为了使表达分析规范化，我们使用甘油醛3-磷酸脱氢酶(甘油醛3-磷酸脱氢酶)作为内控基因，量化所有处理过和未处理过的组合sirna的mRNA表达。以cDNA为模板，各正向和反向特异性引物浓度400 nM，探针100 nM, 1 × SensiFast探针Hi-Rox mix，适量核酸酶游离水，建立反应。按照循环条件生成标准曲线(数据未显示)，从三次重复中获得平均定量循环值(cq)，并使用Bio-Rad, CFX管理软件3.0版(Bio-Rad，美国)进行记录。

基因表达定量的数据分析

评估了四种组合sirna: dpb + dpc、dpb + ie2b、dpc + ie2b和dpb + dpc + ie2b抑制RCMV ALL-03的IE2和DNA多基因表达的有效性。用siRNA处理的基因与未处理的对照组进行相对折叠变化比较，相对折叠变化采用−ΔΔCT法计算。采用Bio-Rad, CFX管理软件3.0版(Bio-Rad, USA)，对管家基因GAPDH的靶区进行归一化，计算fold变化的量化，如前所述[35］．

计算拆卸效率

击倒效率百分比的计算方法为−ΔΔCT，略有修改[36］．将siRNA处理后的靶基因表达水平归一化为非靶基因GAPDH作为内参基因，如下式所示:

接下来，每个生物复制的ΔCt以指数方式转换为ΔCt表达式，然后确定标准偏差。方程如下:

将均值归一化为siRNA处理后的样本与非靶向siRNA样本的表达量，得到ΔCt的表达水平。击倒率计算公式如下:

RCMV ALL-03对siRNA联合治疗的耐药性

当病毒具有发展耐药性的能力时，耐药性是需要解决的重要问题。在联合治疗中，研究了RCMV ALL-03通过靶区突变产生耐药性的能力。siRNA组合转染后感染RCMV ALL-03, 14 d后收获细胞外子代病毒。收获的病毒再次转染siRNA组合后，用于重新感染REF细胞。14天后，收集病毒，重复此方法最多5次感染。最终收获的病毒与原液一起进行核酸提取。确认后，将PCR产物送去测序，用Clustal Omega在线软件对测序结果进行比对，进行序列鉴定。

统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism版本6 (GraphPad Software, USA)进行。P值< 0.05为显著。结果以三次代表性实验的平均值±标准差表示。

组合siRNAs对细胞活力的影响

采用MTT细胞增殖法对sirna组合进行细胞活力测定。对所测siRNA组合的细胞毒性分析表明，在不同时间点，300pmol的优化浓度下，细胞活力几乎不受影响。然而，dpb + dpc + ie2b的三重组合在48和72 h时300 pmol的毒性水平为50%。另一方面，所有双siRNA组合，如dpb + dpc, dpb + ie2b和dpc + ie2b在最高浓度300 pmol时显示出超过70%的细胞活力(附加文件)1:图S2)。

小干扰rna抑制病毒生长

用两倍或三倍组合沉默RCMV ALL-03，用TCID50测定病毒滴度。在两个不同的日子记录病毒滴度的读数:10和18。1)．这是因为在第10天没有检测到明显的病毒载量，在第18天病毒可以达到最大的生长(图。1)．总体而言，不同组合的siRNA表现出不同程度的病毒抑制能力，其中靶向DNA聚合酶的siRNA表现出更好的RCMV ALL-03抑制率。在RCMV ALL-03之前给药sirna可以阻止感染的进展，因为病毒滴度从第10天到第18天没有呈指数级增长。相比之下，阴性siRNA对照组和未处理组的病毒滴度从第10天到第18天显著增加。例如，dpb + dpc (2.5 log . log . log₁₀TCID50/ml, 3.8 log₁₀TCID50/ml)在第10天和第18天的病毒抑制率较好，其次为dpb + ie2b (3.2 log .₁₀TCID50/ml, 5 log₁₀TCID50/ml)和dpc + ie2b (3.2 log . ml)₁₀TCID50/ml, 5.1 log₁₀TCID50 /毫升)。所有这些组合与阳性对照更昔洛韦3.2 log相比具有相似的病毒滴度₁₀TCID50/ml在第10天p.i和4.9 log₁₀第18天的TCID50/ml。因此，处理后的siRNA与更昔洛韦的差异不显著(P> 0.05)。然而，三重组合dpb + dpc + ie2b (3.5 log .₁₀TCID50/ml, 5.9 log₁₀TCID50/ml)在第10天和第18天的病毒抑制率均低于其他组合和GCV。另一方面，阴性对照组和未处理组的病毒滴度高于siRNA处理组:4 log₁₀TCID50/ml在第10天p.i和8 log₁₀第18天，TCID50/ml。

流式细胞术研究膜联蛋白V凋亡

流式细胞术研究了联合siRNAs处理后RCMV ALL-03感染细胞发生凋亡/坏死的情况。点图视图插图用于解释REF细胞的结果(附加文件1:图S3)。如图所示。2，与早期凋亡细胞相比，所有siRNAs和GCV处理组的存活细胞比例都较小。与未处理对照组相比，dpb + dpc组中存活细胞数量为13.6%±0.23个，早期凋亡细胞数量为31.2%±0.17个。早期凋亡的细胞均为siRNAs和GCV联合处理组，其中dpb + ie2b早期凋亡细胞最多(53.4%±3.52)。此外，与阴性对照siRNA和未处理组相比，所有siRNA和GCV处理组显示晚期凋亡细胞数量最少。与此同时，包括对照组在内的所有治疗组坏死期细胞均减少(0.1% - 2%)。

DNA拷贝数/µl

在稀释100倍的样品中，每µl的RCMV ALL-03 DNA副本被定量。因此，从原料模板中计算病毒DNA拷贝数/µl，如表所示4．在病毒DNA定量之前，筛选具有阳性和阴性液滴的ddPCR分析图的可视化(附加文件1:图S4)。最终结果显示，在四种组合siRNAs中，dpb + dpc极大地降低了病毒滴度，达到6400个DNA拷贝/µl，与未处理的对照组(20200个DNA拷贝/µl)相比降低了68%。正如预期的那样，这两种靶向DNA聚合酶基因区域的siRNAs相比靶向IE2基因区域的组合siRNAs表现出更好的病毒抑制率。其次，dpb + ie2b和dpb + dpc + ie2b分别以60%和42%的有效率限制病毒颗粒(图2)。3.)．然而，dpc + ie2b的有效性最低，为13%，为17,600个DNA拷贝/µl。与其他siRNA处理组相比，发现商业药物GCV处理在减少病毒DNA拷贝(12,200拷贝/µl)方面的效率为40%，为中值有效率。dpb + dpc + ie2b治疗组与GCV治疗组DNA拷贝减少百分比的差异仅为2%。总体而言，双重和三重siRNAs组合的病毒降低率明显中等，有趣的是，三重siRNAs组合的抑制率低于双重组合(dpb + dpc和dpb + ie2b)。另一方面，未经治疗的对照组由于没有任何形式的治疗，病毒颗粒数量很高(20,200拷贝/ μ l)。

利用CPE率发展进行抗病毒筛选

为了研究联合sirna处理组和未处理组RCMV ALL-03的CPE率，将300 pmol的联合sirna转染REF细胞，然后进行病毒感染，随后在第14天监测细胞的形态变化。细胞病变效应是监测CMV侵袭和繁殖引起的宿主细胞结构变化的可靠方法。CMV感染组与未感染组有明显差异。正常细胞保持成纤维细胞的形状，没有斑块形成，并紧紧地粘在板上直到第14天(图。4b).而感染RCMV ALL-03的细胞则表现出明显的形态变化，从细胞膨大开始，细胞质延伸，形状变长，最后脱离flask形成斑块。斑块继续扩张并达到晚期CPE，其中大多数细胞死亡并从烧瓶中分离，如图所示。4a.为了评估联合sirna的有效性，在第14天检查所有被处理的细胞，并记录CPE的发展速度。正如预期的那样，所有组合siRNAs都表现出对RCMV all -03的保护作用，但保护程度各不相同。在四种组合中，dpb + dpc被证明是最有效的组合，其中记录的CPE率最低(图2)。5a).第14天，300pmol的dpb + dpc可启动CPE，如图所示。相比之下，阴性对照siRNA和病毒对照细胞在第14天开始表现出显著的晚期CPE形成。其次是dpb + dpc, dpb + ie2b和dpb + dpc + ie2b在第14天对CPE表现出良好的抑制作用(图2)。5而且6)．与预期相反，结果并没有显示在所有siRNA中都有恒定的发现，其中dpc + ie2b sinas效果较差，与阴性对照siRNA和病毒控制细胞表现出相似的CPE发展速度，证明它们不能为宿主细胞提供保护，抵御RCMV all -03。这些发现表明，三重组合的siRNAs在抑制CPE率方面不如双重组合有效。因此，这证明了传递更多siRNAs组合提供更好的病毒抑制率的错误理论。结果的差异可能是由于针对不同基因组区域的siRNAs具有不同的CPE抑制效率。考虑到作为阳性治疗对照组，商品药GCV表现出更好的CPE抑制率(图。7)，但效率低于dpc + ie2b siRNAs。

实时基因表达分析

为了进一步了解每种组合siRNAs在RCMV all -03感染过程中的作用，我们使用特定引物分别分析了所有针对不同区域的四种组合siRNAs。总体而言，结果显示每种组合siRNAs均表现出不同程度的mRNA减少，与病毒对照组相比，dpb + dpc、dpb + ie2b和dpc + ie2b的mRNA减少更大(图2)。8a). SiRNA dpb + dpc被发现非常有效，可使DNA聚合酶mRNA表达降低高达79% (P而IE2基因区为39%，< 0.05)。这主要是由于siRNAs本身，其中siRNAs只针对DNA聚合酶而不是IE2。在所有组合siRNAs中，IE2和DNA聚合酶的表达均存在明显差异。有趣的是，在这两个基因之间，靶向DNA聚合酶的siRNAs与IE2相比具有相对较低的mRNA表达。然而，如果与商业药物GCV相比，发现siRNAs组合在抑制IE2和DNA聚合酶表达方面的效力较弱，如图所示。8a.与双siRNAs组合相比，三重siRNAs组合对降低基因表达的mRNA抑制能力更弱。

降低效率

进一步转换siRNAs组合的沉默效应，以确定敲除效率的百分比，如表所示5和无花果。8b.由于这些组合是由针对不同区域的不同sirna组成的，每个组合分别对IE2和DNA聚合酶基因敲除进行了评估。对于IE2基因区，dpb + ie2b和dpc + ie2b组合的敲除效率分别为63 ~ 68%，dpb + dpc和dpb + dpc + ie2b三组合的敲除效率分别为33 ~ 48%。另一方面，对于DNA多基因区，所有双siRNAs组合的敲除率均高于IE2区，后者的敲除率范围在51 - 79%之间。单靶向DNA聚合酶的dpb + dpc组合在siRNAs中具有最好的敲除水平，其次是dpc + ie2b和dpb + ie2b。这清楚地表明，与IE2相比，所设计的siRNAs在抑制DNA聚合酶mRNA表达方面效果最好。值得注意的是，具有2个DNA多siRNA和1个IE2 siRNA的三重组合(dpb + dpc + ie2b)具有较弱的降低mRNA表达的能力，因此与双siRNAs组合相比具有中等的敲除效率。病毒定量和CPE率观察也有相似的结果。因此，这些发现再次证明，组合的siRNAs越多，并不一定具有更好的某一基因的敲除效率。除此之外，与其他siRNAs组合相比，GCV仍被认为是敲除DNA聚合酶和IE2基因区域的更好选择(表2)5)．另一个重要的发现是阴性对照siRNA的敲除效率。结果发现其敲除效率为零，与病毒对照组相似，证明其为非靶控，对病毒和宿主细胞不产生任何影响。综上所述，各组合siRNA均具有不同程度的基因敲除效率，其中dpb + dpc对DNA聚合酶基因的敲除效率较高，而dpb + ie2b对IE2基因的敲除效率较高。

RCMV ALL-03对siRNA联合处理抗性的序列鉴定

病毒对持续一段时间的治疗产生耐药性是很常见的。为了研究通过联合突变产生耐药性的趋势，收集了处理过的RCMV ALL-0的sirna。然后，将细胞外子代病毒反复感染到组合sirna处理的REF细胞上，最多感染5次。最后的子代病毒被收获并用于DNA提取。采用Sanger测序仪平台对提取的全部DNA进行测序，以识别任何可能的突变发生，并使用Clustal Omega在线软件系统与库存RCMV ALL-03溶液进行比较。对于每一个组合siRNA的处理，每一个特定的siRNA所涉及的区域都被测序，以获得所有可能发生的突变。值得注意的是，所有经过处理的siRNAs区域均未观察到任何突变，证明设计的siRNAs能够不产生或延迟RCMV all -03对siRNAs的抗性。目前，已经测序了5个经siRNA处理的RCMV ALL-03，未来还需要对更多的siRNA进行测序，以确定任何可能的突变。由于RCMV ALL-03是双链DNA病毒，预计突变发生率极低，而RNA病毒的突变发生率较高。这一说法得到了本研究结果的支持，其中sirna处理的RCMV ALL-03与病毒库存(未处理sirna的子代病毒)具有100%的序列同源性，证明突变存在率较低。 The detailed information of aligned sequences for each siRNA treated regions compared with stock viruses were portrayed in Fig.9．

虽然CMV还没有被批准的疫苗或有效的治疗方法，但人们正在努力通过不同的策略来治疗病毒感染[37，38，39］．根据目前美国国家医学科学院公布的疫苗优先文件，为巨细胞病毒研制合适疫苗的工作始于2000年初[40］．有趣的是，CMV在列表中被赋予了最高的优先级，许多生物技术公司都暗示了开发合适的CMV的许多策略[41，42］．不幸的是，有效的疫苗仍然缺乏，也没有得到FDA的批准。在寻找CMV有效治疗方法的过程中，本研究探索了通过两种或两种以上sirna组合抑制病毒复制和基因表达来控制疾病的思路。在针对其他病毒感染，如流感、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、乙型肝炎、牛痘病毒之前，已经对联合疗法进行了测试[23，25，43，44，45，46］．有人假设，同时针对两个不同的基因可以沉默关键病毒基因的表达;作为对抗巨细胞病毒的抗病毒疗法。有很多理由选择siRNA作为对抗CMV的潜在治疗选择。首先，它们易于设计，生产成本低。47］．其次，它们具有高度特异性，几乎可以针对任何病毒或细胞基因，通过冻干可以提高它们的稳定性[48］．另一个优势是它们可以与许多sirna或靶向相同或不同基因中不同区域的其他药物联合使用[46］．毫无疑问，治疗作用的模式可以通过限制治疗耐药候选者的出现来扩展[25］．因此，这些推动siRNA研究及其后续临床试验的因素近年来均有显著增加[49，50，51］．

大多数治疗方法在早期都很有效，但在一段时间后就会失效。这是由于病毒有能力产生耐药性，以逃避抗病毒治疗的攻击[52］．为了解决这一问题，靶向相似或不同基因区域的siRNAs组合成为基因治疗的热门方法。具体来说，他们可以切割mRNA的多个位点，这些位点对目标修复来说很麻烦。同时沉默不同的关键基因区域有望通过降低多重突变发生的可能性来防止耐药病毒的出现[12］．通过产生组合模式可以增强siRNAs的作用，为基因治疗领域打开一扇新的窗口。因此，本研究的主要目的是在概念证明研究中调查sirna组合抗cmv治疗的适用性。尽管siRNA具有许多优点，但不幸的是，siRNA脱靶效应的问题仍然有待解决和处理。进行细胞毒性试验，以排除任何对REF细胞活力有不利影响的组合。这是因为引入外来颗粒可能会提高细胞的细胞毒性水平，从而导致细胞死亡。不健康或死亡的细胞无法维持病毒的产生，因此会影响siRNA有效性的结果[30.］．因此，在开始组合siRNA有效性测定之前，确定了组合的细胞毒性水平。结果显示，除了dpb + dpc + ie2b外，这些组合siRNA似乎没有诱导显著的细胞毒性水平(P在不同时间点高浓度(300 pmol)均< 0.05)。然而，所有siRNAs的细胞活力都随着时间的推移而不断地略有下降。两种siRNA组合(dpb + dpc, dpb + ie2b和dpc + ie2b)每150 pmol被发现是安全的，在高浓度(最终300 pmol)下72小时细胞存活率超过70%。正如预期的那样，从25 pmol(每个12.5 pmol)到3 pmol(每个1.5 pmol)的较低浓度在24、48和72小时观察到细胞存活率超过90%。然而，每100 pmol的三种siRNA组合(dpb + dpc + ie2b)遇到了相当高但可耐受的细胞毒性水平，在300 pmol时细胞存活率为50%。由于50%的细胞毒性水平在可耐受范围内，后续siRNA实验中加入了三siRNA组合(dpb + dpc + ie2b)。

在本研究中，靶向IE2的sirna与DNA多基因区域的组合被证明可以抑制病毒基因的表达和抑制病毒的复制。四种siRNA组合靶向RCMV ALL-03的相同或不同靶区，与打乱siRNA、阴性对照非靶向siRNA样品相比，显示出有效的病毒复制抑制作用。与阳性对照组GCV相比，双sirna组合:dpb + dpc、dpb + ie2b和dpc + ie2b在第10天和第18天表现出更好的病毒抑制作用。然而，三联sirna: dpb + dpc + ie2b在控制病毒复制方面的效果低于其他组。结果与qPCR对基因表达量的相对定量和CPE形成率相一致。

采用液滴数字PCR技术对各处理组的病毒颗粒进行定量分析。虽然与实时荧光定量PCR的作用相同，但这项新技术是对现有PCR技术的一个极好的改编，因为它具有较高的精度和灵敏度，使用更方便，从而使结果更可靠，更容易再现[53，54］．更重要的是，不需要标准曲线，直接通过量化含有病毒DNA颗粒的液滴来解释结果。定量结果显示，dpb + dpc处理组病毒颗粒数量最少，其次为dpb + dpc，其次为dpb + dpc + ie2b，而dpc + ie2处理组病毒颗粒数量较多。dpb + dpc和dpb + ie2b治疗组病毒DNA拷贝减少约60%，dpb + dpc + ie2b治疗组病毒DNA拷贝减少42%。遗憾的是，dpc + ie2b的病毒DNA拷贝仅减少了13%，这是最无效的治疗组。通过详细分析发现，与dpc和ie2b相比，具有dpb siRNA的siRNAs组合在病毒抑制率上表现更好。所获得的结果证明了dpb siRNA抑制病毒复制的能力，与之前的个别评估部分相比，这是最佳的siRNA候选。除dpc + ie2b外，其他siRNAs组合对RCMV ALL-03 DNA的抑制效果均优于商业药物GCV，作为治疗组阳性对照。因此，这证明了需要替代基因治疗来更有效地控制CMV疾病。

自然地，宿主有许多机制来提醒它们的免疫系统，并激活通路来阻止新的子代病毒的产生，使其在感染时扩散到其他未感染的细胞。为此，细胞凋亡是一种先天的细胞防御机制，负责促进程序性细胞死亡，从而防止持续感染。凋亡分析显示，联合siRNAs处理组较对照组的晚期凋亡和坏死细胞表现出较多的早期凋亡。在四种siRNAs组合中，与晚期凋亡细胞相比，dpb + dpc具有明显数量的存活和早期凋亡细胞。dpb + dpc组合靶向DNA聚合酶，成功抑制病毒复制，从而阻断其抑制凋亡途径的能力。另一方面，其他三个组合siRNAs组具有相似的结果模式，大多数细胞都聚集在早期凋亡细胞上。坏死期未发现细胞。正如预期的那样，阴性siRNA对照组和未处理组的大多数细胞都处于凋亡晚期。因此，联合治疗证明可以有效抑制RCMV ALL-03的生长，从而间接抑制凋亡阻断通路[55，56］．可能，组合siRNAs在维持宿主细胞健康方面具有良好的协同作用。

很少观察到含ie2b的sirna组合与DNA多聚相比显示IE2基因表达水平降低。另一方面，与IE2相比，含有dpb和dpc的siRNAs具有更好的DNA多基因表达mRNA还原水平。例如，dpb + dpc对DNA多基因的敲除效率(79%)高于IE2(33%)，因为这两个候选基因都针对同一基因区域。我们的siRNAs治疗组合与单个siRNA的结果一致，靶向DNA多基因区域的siRNAs显示出良好的mRNA水平降低，尤其是dpb和dpc siRNAs。其次，三sirna组合:dpb + dpc + ie2b在IE2和DNA多聚区均显示出更低的mRNA水平(46-48%)降低。这清楚地表明，双siRNA组合比三siRNA组合具有更好的基因表达抑制率。在我们针对RCMV ALL-03的实验中，更多针对不同区域的sirna的概念可以有效地抑制病毒复制和基因表达。

病毒在细胞培养中的复制可从REF细胞系的独特形态变化中识别，称为细胞病变效应，也称为CPE [30.］．病毒的感染性与病毒粒子的感染性或非感染性的合成有关，通常是通过细胞病变作用来提供线索的。因此，这可以作为RCMV ALL-03鉴定的初步指标。CPE分析在第14天进行。这是因为CPE开始大约需要8 - 10天，90%的CPE可以在第14天观察到，这与Loh等人的CMV细胞培养观察一致。[30.］．dpb + dpc siRNAs治疗组CPE率较低。细胞开始扩大，称为气球，这比GCV、阴性对照组和未处理组的CPE条件好得多。其次，dpb + ie2b和dpc + ie2b组合表现出与GCV对照组相似的CPE模式，由于RCMV ALL-03生长进程导致REF细胞脱附，可见明显斑块。然而，dpb + dpc + ie2b组合对病毒CPE率的抑制作用不明显，在大多数细胞被感染时，斑块扩张更大。令人惊讶的是，CPE率与未治疗对照组基本相同。

获得有效的抗病毒治疗很大程度上取决于生物体产生耐药突变的低概率[57］．为了确定定制设计的sirna组合对RCMV ALL-3基因组的影响，我们对目标区域进行了测序并与原液病毒进行了比较。值得注意的是，在第5轮多siRNAs处理中，与原始库存相比，未观察到任何显著突变。这个实验确实传达了一个关于siRNA设计方法的重要性的重要信息。靶向高度保守区域的特异性siRNAs能够防止或减少突变的发生，从而关闭引入的siRNAs的抑制作用。此外，联合sirna可降低RCMV ALL-03的复制，通过抑制携带感染突变基因的病毒种群的生长，间接限制突变发生的可能性。此外，CMV是双链DNA病毒，与其他RNA病毒相比，其突变率较低。因此，未来的突变鉴定研究需要在更高多轮的siRNAs处理下进行。

在抑制RCMV ALL-03复制和基因表达方面，含IE2b的siRNAs组合，尤其是dpb + IE2b和dpc + IE2b组合，其抑制RCMV ALL-03复制和基因表达的效率低于dpb + dpc。IE是有史以来第一个在CMV感染后转录的基因。随后通过差异剪接产生的IE产物将使早期基因转活。最初，人们期望沉默IE基因区特别是IE2可以阻止其他基因的激活。不幸的是，观察到不同的情况，IE的最低表达可能足以打开其他基因，因此，朝着病毒复制的方向发展。这一说法得到了qPCR的支持，在qPCR中，IE2敲除的siRNAs比例很高，但仍表达DNA聚合酶并产生病毒子代。

总的来说，根据所获得的结果，siRNAs组合被发现具有对RCMV ALL-03的抗病毒活性，然而，与高效的单个siRNAs相比，在300 pmol的相同总浓度下，效果较差。遗憾的是，从所有收集到的病毒滴定、病毒颗粒定量、mRNA水平调查、CPE率分析和细胞生存状态的结果来看，组合siRNAs的协同效应无法与单个siRNAs的有效性竞争。对于所获得的结果的确切答案尚不清楚，然而，几乎没有理由来解释这种情况。首先，siRNAs相互竞争与RISC蛋白结合的可能性较大，这可能会对彼此的协同活性产生负面影响[58］．第二，即使siRNA以等浓度混合，每种siRNA进入细胞的比例仍不清楚。一种可能比另一种更经常地被运送到细胞中，这可能导致协同作用失效。其次，由于不同的序列组成、GC含量、稳定性和与RISC蛋白结合的亲和力，siRNAs的性质也各不相同[59］．更成功的结合可以引导RISC到目标，从而在特定的目标上发生更频繁的裂解。另一方面，与RISC结合最不成功的siRNAs具有更低的裂解频率，从而具有更低的有效性。因此，siRNA的个体特征可能优于另一种，较强的siRNA与较弱的siRNA相比具有更多的沉默效应[60］．

一些研究尝试将sirna组合用于沉默病毒基因靶点和支持病毒复制的细胞宿主因子。例如，另一项研究证明，通过引入靶向RNA依赖RNA聚合酶病毒基因以及细胞因子La自身抗原的sirna, HCV复制被明显抑制[23］．因此，未来可以对RCMV ALL-03进行类似的实验视角，以最大限度地提高组合siRNAs抑制病毒复制和基因表达的效率。然而，人们在选择细胞因子时需要更加谨慎，因为沉默的效果不会给宿主带来任何有害的伤害[61］．综上所述，siRNAs组合应用被发现有利于抑制病毒复制，需要进行更多的研究来提高效率。除了人类病毒外，该系统还可用于因病毒感染而对家禽业产生不可承受影响的动物病毒[60，62］．除此之外，这种组合sirna方法可以替代作为替代治疗，特别是在生产过程中遇到困难的植物基疫苗[63］．

这是第一个研究siRNA组合抑制马来西亚分离CMV的有效性的研究。这些组合是根据抑制RCMV ALL-03的个体表现来制定的。在体外实验中，病毒基因组DNA、基因表达和巨细胞病毒复制均有明显抑制作用，但不同组合的抑制效果不同。含有dpb siRNA的siRNA组合具有较好的病毒抑制率，与个体特征相似。总的来说，具有两个siRNA的组合显示出比三siRNA组合更有希望的结果。有趣的是，在治疗组中没有发生任何突变，因此突出了其作为未来治疗方案的可行性。

在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在本手稿中。

核:

小干扰RNA

巨细胞病毒:

巨细胞病毒

RCMV:

鼠巨细胞病毒

IE2:

立即早2

pmol:

皮摩尔

CPE:

细胞病理效应

ddPCR:

液滴数字PCR

不适用。

本研究由马来西亚高等教育部(5424930)和马来西亚普特拉大学(IPS Universiti Putra Malaysia)资助。: 9616900。

作者及隶属关系

1. 马来西亚普特拉大学兽医学院病理与微生物学系，马来西亚雪兰莪州

   Krishnan Nair Balakrishnan, Mustapha Mohamed Noordin和Mohd Lila Mohd- azmi

2. 塔伊兹大学应用科学系微生物学系，塔伊兹，也门

   Ashwaq Ahmed Abdullah

3. 尼日利亚卡诺，巴耶罗大学联合健康科学系微生物科医学检验科学系

   Jamilu Abubakar Bala

4. 马来西亚雪兰莪州普特拉大学兽医学院兽医临床研究系

   Faez Firdaus Abdullah Jesse

5. 马来西亚普特拉大学理学院物理系，雪兰莪，马来西亚

   Che Azurahanim Che Abdullah

贡献

作者在此声明，这项工作是由本文中所提到的所有人完成的，与本文内容有关的索赔的所有责任将由他们承担。KNB, AAA和JAB构思了这个想法，参与了数据收集和运行测试。CACA、FFAJ、MMN和MLMA参与了论文的构思、研究设计、咨询、审稿和编辑，KNB、CACA、FFAJ、MMN和MLMA参与了结果解释和最终稿件初稿的准备。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Mohd Lila Mohd- azmi．

道德的声明

本研究不包含任何涉及人类或动物参与的实验，本研究中的所有实验都符合研究伦理标准。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明，他们对这篇文章的发表没有任何利益冲突。

出版商的注意

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