人巨细胞病毒(HCMV)中和抗体与HCMV糖蛋白复合物抗体的关联

背景

人巨细胞病毒(HCMV)可引起无症状感染，但当妇女在怀孕期间感染HCMV时，也可引起先天性感染，以及免疫功能低下患者的危及生命的疾病。为了更好地了解对HCMV的中和活性的机制，我们评估了HCMV NT抗体滴度与对HCMV每种糖蛋白复合物(gc)的抗体滴度的关系。

方法

研究使用了78名健康成年志愿者的血清。HCMV Merlin株和HCMV临床分离株1612被用于NT试验和斑块减少试验，其中MRC-5成纤维细胞和rp -1上皮细胞都被使用。选择gB、gH/gL复合物(gH/gL/gO和gH/gL/ UL128-131A [PC])和gM/gN的糖蛋白复合物作为靶糖蛋白。用gB、gM/gN、gH/gL/gO或PC表达293FT细胞，用间接免疫荧光法(IIFA)测定对每种gc的抗体效价。评估每种gc的IIFA滴度与HCMV-NT滴度之间的相关性。

结果

在上皮细胞中，gb特异性IIFA滴度与HCMV-NT滴度之间无显著相关性，gM/gN复合物特异性IIFA滴度与HCMV-NT滴度之间无显著相关性。另一方面，gH/gL复合物的IIFA滴度与HCMV-NT滴度之间存在统计学上显著的正相关。

结论

这些数据表明gH/gL复合物可能是诱导NT抗HCMV活性的主要靶点。

人巨细胞病毒(HCMV)是乙型疱疹病毒亚家族的一员Herpesviridae，是胎儿先天性经胎盘感染的原因之一。患有先天性HCMV感染的儿童具有显著的发病率和死亡率，症状包括永久性神经缺陷，如感音神经性耳聋、发育迟缓、视障碍和癫痫。HCMV还会在免疫功能低下的患者中引起严重甚至致命的疾病[1，2］．

HCMV糖蛋白复合物(gcs)表达于病毒粒子包膜，在细胞附着和进入过程中起作用，是HCMV病毒中和(NT)抗体的主要靶点。在HCMV基因组编码的23个gPs中，9个gPs组成4个gcs: gB、gM/gN、gH/gL/gO和五聚体复合体;gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A (PC)，所有这些gcs都被报道有诱导HCMV-NT抗体的潜力[3.，4，5，6］．

在21世纪初之前，gB被认为是HCMV疫苗研制的主要抗原[7］．同时，HCMV- nt活性用成纤维细胞和高传代的实验室HCMV菌株测定，该菌株缺乏PC的表达[8，9，10，11］．最近研究表明PC对HCMV有效进入上皮细胞(ECs)、内皮细胞和单核细胞很重要[12，13]，而gH/gL/gO是成纤维细胞和ECs感染所必需的[14］．此外，有报道称pc特异性抗体可能是HCMV-NT抗体的主要组成部分[6，15，16，17，18］．

为了开发HCMV疫苗，NT对HCMV的强烈诱导活性是需要的。HCMV有许多复杂的逃避策略对抗体液免疫;这些都阻碍了HCMV疫苗的开发[19］．另一方面，人们认为，强效的HCMV- nt活性是保护胎儿免受经胎盘HCMV感染所必需的[20.，21］．因此，了解HCMV NT抗体诱导机制很有必要。我们的目的是通过评估健康成人血清中抗hcmv - nt抗体滴度与以下4种gc抗原(gB、gM/gN、gH/gL/gO和PC)的抗体滴度的相关性，确定实际诱导最高中和活性的抗原。

细胞

使用成纤维细胞MRC-5细胞(American Type Culture Collection [ATCC®cc -171])。MRC-5细胞在添加10%热灭活胎牛血清(Gibco, Carlsbad, CA)、l -谷氨酰胺和碳酸氢钠以及1%青霉素-链霉素(MEM- 10fbs)的Eagle 's最低必需培养基(MEM)中培养。视网膜色素上皮细胞系ARPE-19 (ATCC®CRL-2302™)和hTERT(人端粒酶反转录酶)-永生的RPE-1 (ATCC®CRL-4000™)都是上皮细胞系，在Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)/F-12(1:1)中培养，包括L-谷氨酰胺和2.438 g/L碳酸碳酸钠(Gibco)，补充10%热灭活胎牛血清(Gibco或Hyclone, GE Healthcare UK Ltd.， UK) (DMEM- 10fbs)。在rp -1培养液中添加0.01 mg/mL的湿霉素B。293FT细胞(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)在添加5%胎牛血清(Gibco) (DMEM- 5fbs)的DMEM (Wako, Odawara, JAPAN)中培养。293FT细胞在胶原蛋白涂层板中培养(TOYOBO，大阪，日本)。

病毒

HCMV菌株Merlin (ME, ATCC®VR-1590™)被用作构建质粒的来源，并用于MRC-5细胞中的NT抗体分析。在ECs中NT滴度的测量中，使用了HCMV临床菌株1612，该菌株是我们实验室从一名有症状的HCMV疾病的2个月大婴儿的尿液中分离出来的。HCMV 1612菌株在MRC-5细胞中传代3次，在ARPE-19细胞中传代5次。在感染1612株的ARPE-19细胞中，传代后1周证实有明显的CPE。ME菌株在MRC-5细胞中传代2次后进行大量培养。ME株或1612株感染的细胞在完全CPE下收获，并悬浮在无fbs的培养基中，然后在−80°C保存。将储存的细胞反复冷冻和解冻两次，然后用MRC-5细胞计数CPE确定上清液中的感染剂量。用MRC-5细胞测定ME株和1612株的滴度分别为3.6 × 10⁴斑块形成单位(PFU)/mL, 3.5 × 10⁵分别空斑形成单位/毫升。由于HCMV 1612株具有感染ec的能力，故采用HCMV 1612株检测ec NT抗体滴度。

血清取样(受试者选择)和伦理考虑

研究人员招募了78名健康志愿者。志愿者的年龄从20岁到60岁不等1)．所有血清样本首先使用市售酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(DENKA SEIKEN, Tokyo, Japan)检测针对HCMV总蛋白的HCMV IgG抗体阳性，并根据制造商的说明确定HCMV-IgG ELISA滴度。然后通过间接免疫荧光试验(IIFA)和HCMV-NT试验进一步检测hcmv - igg阳性血清的hcmv抗体滴度，如下所述。血清样本在56°C下热灭活30分钟，然后用任何测定方法检测抗体滴度。

HCMV中和试验

HCMV-NT滴度采用常规斑块减少试验进行评估。简而言之，用维持培养基MEM-2FBS或DMEM-2FBS连续稀释血清样本。将60 μL稀释后的血清样品与含有60个HCMV空斑形成单位(pfu)的等体积病毒溶液混合，在u底96孔板(Greiner Bio-One JAPAN, Tokyo, JAPAN)中37℃孵育1小时。然后将100微升的混合物添加到ECs (rp -1)或成纤维细胞(MRC-5)细胞的单层中。在进行中和过程之前，在96孔板(CORNING, CORNING, NY)中每孔播种15,000个细胞制备细胞片。HCMV ME用于MRC-5细胞中的HCMV- nt检测，而HCMV 1612用于rp -1细胞和MRC-5细胞中的HCMV- nt检测。HCMV ME-MRC-5平板在接种后4天固定、结晶紫染色、福尔玛林和甲醇处理、洗涤，在接种后2天固定处理并测定rp -1细胞和MRC-5细胞中抗HCMV 1612的NT抗体效价。染色、洗涤、干燥后，用体视显微镜观察由凝聚细胞组成的CPE。50%病毒-NT滴度(NT₅₀)定义为最高稀释水平的倒数，在最高稀释水平时，斑块数量少于对照的一半。每个测试一式三份。

用聚合酶链式反应扩增HCMV糖蛋白基因组构建质粒

采用聚合酶链式反应(PCR)扩增HCMV ME基因gP的每个开放阅读框(ORF)，引物参照ME序列设计(GenBank Accession no;AY446894.2)。所有引物和寡核苷酸均购自Eurofins Genomics (Tokyo, Japan)。30 μL的反应由15 μL Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA)，每个引物0.5 μM和模板DNA组成。PCR扩增子条带从10%琼脂糖电泳凝胶中分离，并使用FastGene凝胶/PCR提取试剂盒(NIPPON Genetics, Tokyo, JAPAN)进行纯化。使用NanoDrop 2000c分光光度计(赛默飞世尔科学公司)对纯化的DNA进行定量。

质粒构建

首先，从感染HCMV-ME的MRC-5细胞经两步常规逆转录纯化的RNA中提取cDNA，扩增HCMV-ME每个gP的ORF。ME-UL128 wt合成DNA寡核苷酸(UL128中的G > A是固定的)购自Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)。每个ORF基因被克隆到修饰的pHEK293 ULTRA表达载体II (Takara Bio Inc.， Shiga, Japan)的克隆位点上，该载体作为一种在羧基端带有指定标签的融合蛋白形式，用于重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达(图2)。1)．根据制造商的说明，使用Fusion™HD (Takara Bio Inc .)进行感兴趣基因的插入。

桑格DNA测序

核苷酸序列使用ABI Prism 3130 Avant遗传分析仪(Applied Biosystems, Foster City, CA)测定。使用DNA发电机(Blue-Tractor Software, North Wales, UK)将序列与参考序列进行比对。经Sanger DNA测序，所构建质粒的核苷酸序列与原序列一致。

采用Sanger测序法测定1612株UL128L (UL128-131A位点)的序列，PCR产物采用引物UL128L- f (GCGTATTTCGGACAAACACACA)和UL128L- r (CGCATGTTGCAGACTGAGAAAGA)扩增[22］．经证实，HCMV 1612的UL128L基因没有突变。

间接免疫荧光测定用抗原制剂

用pHEK293-gB转染293FT细胞，获得重组gB的表达。使用pHEK293 Enhancer Vector (Takara Bio Inc.)和HuGENE HD (Promega)共转染相同的细胞，分别与pHEK-gM和pHEK-gN、pHEK-gH、pHEK-gL和pHEK-gO和pHEK-gH、pHEK-gL、pUL128、pUL130和pUL131A共转染gM/gN、gH/gL/gO和PC表达。

用每个指定质粒或质粒组合转染的293FT细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(−)清洗，并在玻片上标记(Matsunami glass IND.， Ltd.，大阪，日本)，并用甲醇和丙酮混合物按1:1的比例混合固定。

通过检测各自的标签，IIFA确认gc的表达。该抗体用于组氨酸亲和力的检测标签(HAT)融合蛋白、c-myc融合蛋白和flag -标签融合蛋白分别为兔抗HAT标签多克隆抗体(GenScript, Piscataway, NJ)、小鼠myc单克隆抗体(Aviva Systems Biology, San Diego, CA)和抗flag M2单克隆抗体(Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japan)。二抗为Alexa Fluor DyLight 488偶联山羊抗小鼠IgG H + L抗体或DyLight 594偶联山羊抗兔IgG H + L抗体(Invitrogen)。抗氧化石墨烯肽兔抗体(肽序列:KLKRKQALVKEQPQKKNKKS [23])由Eurofins基因公司(东京，日本)生产。

间接免疫荧光法检测每种gc抗体

为了测量血清中每种gc特异性IIFA滴度，将血清样本用PBS连续稀释两倍并添加到载玻片上。在37°C孵育1 h后，用PBS洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗人IgG h + L (Invitrogen, Carlsbad, CA)反应。抗体滴度定义为最高稀释水平的倒数，在最高稀释水平检测到特异性荧光信号。用不含gp的质粒载体转染的细胞作为阴性对照。两份cmv - igg阴性血清IIFA抗体检测阴性。由于在IIFA中对特异性抗体滴度的测量存在主观性的担忧，fitc特异性信号由两位专家观察以确保一致性。为了尽可能避免发现伪影，固定细胞中的信号先在较低的放大倍率下观察，然后再在较高的放大倍率下观察。显然，与阴性对照组不同的阳性信号被确定为阳性。

统计分析

使用Stata15软件程序(STATA Corporation, College Station, TX)进行统计分析。相关性的非参数分析采用斯皮尔曼检验。P< 0.05为有统计学意义。

下一代测序

HCMV ME和HCMV 1612的氨基酸序列同源性经下一代测序仪(NGS)碱基序列测定证实。用QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)从感染HCMV 1612的ARPE-19细胞中经反复冻融循环处理2次后提取HCMV 1612基因组DNA。然后按照制造商的说明，使用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit(赛默飞世尔科学公司)制备测序文库。使用离子库TaqMan定量试剂盒(赛默飞世尔科学公司)定量文库浓度。对文库进行乳剂PCR，将文库调整为50pm浓度，以等摩尔量混合，并在离子厨师系统(赛默飞世尔科学公司)上与捕获珠混合，并辅以离子激流个人基因组机(PGM)模板200试剂盒(赛默飞世尔科学公司)。根据制造商的说明，使用Ion 314 Chip Kit v2(赛默飞世尔科学)和Ion Torrent PGM测序200 Kit v2(赛默飞世尔科学)对模板库进行测序。将所得的FASTQ格式文件导入CLC Genomics Workbench 9.0.1 (QIAGEN)进行同源性分析。1612株的gP序列均在GenBank中注册，登录号为LC425070-LC425078。

确定气相色谱表达检测IIFA抗原抗体

IIFA通过检测每个融合标签来确认所有4种gc的表达(图。1)．与gB、gH、gM、pUL128融合的标签为HAT，与gL、gN、pUL130融合的标签为FLAG(−)，与gO、pUL131A融合的标签为c-myc。通过使用二抗的两种不同荧光标记来区分组成每个复合物的gp的标记。经Western blotting证实，除gO外，各gp均有表达(数据未显示)。在不同位置(c端或n端)与几种不同标签融合后，用WB和IIFA反复检测抗gO肽抗体或抗指定标签抗体的gO表达，但未检测到gO表达信号。

志愿者HCMV IgG流行情况

ELISA测定的HCMV ELISA- igg患病率见表1．总阳性率为61.5%。将整个人口分为两组，一组39岁以下，另一组40岁以上。40岁以上人群HCMV-IgG抗体阳性率明显高于40岁以下人群(p= 0.02，学生t检验)。男性和女性之间IgG的患病率无显著差异。

HCMV ELISA-IgG抗体滴度与HCMV- nt抗体滴度的相关性

ELISA检测HCMV-IgG滴度与NT的相关性₅₀用斯皮尔曼试验测定滴度。相关系数r_年代在使用HCMV 1612/ rp -1细胞、HCMV 1612/MRC-5细胞和HCMV ME/MRC-5细胞组合的NT试验中，分别为0.58、0.51和0.44。因此，HCMV ELISA-IgG滴度与HCMV- nt滴度之间存在相对中度的统计学意义相关性，而不考虑细胞和病毒类型之间的组合(图。2)．所有P-value均小于0.01。

使用HCMV 1612株的相关性

HCMV1612与HCMV ME的氨基酸序列同源性分别为:gB、gH、gL、gO、gM、gN、pUL130和pUL131A，同源性分别为99.4、99.2、98.9、99.6、100、99.3、98.6和100%。菌株1612与ME野生型(UL128修复的Merlin BAC) pUL128氨基酸序列同源性研究[21，24])为99.4%。除了氨基酸同源性外，我们还评估了菌株ME与菌株1612的表型同源性(即比较了MRC-5细胞中每个菌株的NT抗体滴度)。与NT呈显著正相关₅₀在抗HCMV ME和抗HCMV 1612的成纤维细胞中测定(图2)。3.)，表明使用HCMV 1612临床分离物的有效性。

新界区相关性₅₀用IIFA法测定gc特异性抗体滴度

HCMV-NT之间的相关性₅₀各gc特异性IIFA抗体滴度如图所示。4．gb特异性IIFA抗体滴度与HCMV-NT呈显著正相关₅₀在成纤维细胞中测定HCMV ME和1612的滴度(Spearman R = 0.36，p= 0.011)，但不与HCMV-NT₅₀至1612株ECs (R = 0.19，p= 0.17)。抗gm /gN IIFA抗体滴度与HCMV-NT无相关性₅₀在成纤维细胞或ECs (r_年代=−0.09和p成纤维细胞= 0.533;r_年代=−0.25和p= 0.092 (ECs)4b).相反，gH/gL复合物特异性IIFA滴度与HCMV-NT具有统计学意义的相关性₅₀滴度(无花果。4c和d)作为相关分析，gHLO/NT(成纤维细胞)、gHLO/NT (ECs)、PC/NT(成纤维细胞)和PC/NT (ECs)的Spearman R值分别为0.58、0.69、0.56和0.78;所有p值< 0.05。HCMV-NT之间的相关性最高₅₀s由ECs和pc特异性IIFA滴度决定(R = 0.78，p< 0.0001，图;4D，右侧面板)。gH/gL/ go特异性IIFA抗体滴度和pc特异性IIFA滴度均与HCMV-NT有较高的相关性₅₀s在ECs中测定，与在成纤维细胞中测定的比较。gH/gL/ go特异性IIFA滴度与pc特异性IIFA滴度之间也存在统计学意义上的正相关(R = 0.5967，p< 0.001)。

本研究中受试者的HCMV IgG血清阳性率(约60%)与日本先前报道的数据一致[25，26］．的HCMV-NT₅₀在任何一种病毒-细胞组合中，滴度都与EIA igg抗体滴度有弱到中等相关性(图2)。2)，如先前报道[27，28，29］．当孕妇感染HCMV作为主要感染时，由EIA确定的IgG抗体成为阳性。抗体水平与nt抗体滴度平行，抗体水平在感染后约3个月达到峰值，并维持约1年[18］．本研究显示nt -抗体滴度与EIA-HCMV IgG滴度之间存在中度相关性。

本研究通过Western blotting(数据未显示)证实了除gO外的每个gP的表达。任何方法均未观察到gO的单一表达(图。2)．gH/gL复合物通过与gO或UL128、UL130和UL131A结合稳定为复合物形式;因此，表达蛋白构象改变后，标签和肽抗原被认为暴露[30.，31］．

在过去的20年里，人们已经认识到gB可能是NT抗体发生反应的主要靶点[7］．最初，使用重组gB对人血清进行吸附处理，通过中和活性减少约50% HCMV进入成纤维细胞，这一观察推动了基于gB的疫苗的开发[4，32，33，34］．也有报道称gb特异性抗体滴度与NT相关₅₀浓度(35］．这一证据是从使用成纤维细胞(主要是人类胚胎肺成纤维细胞)和实验室高传代HCMV株(如HCMV Town株)探索血清NT活性的实验中获得的。作为HCMV-NT₅₀滴度根据使用的细胞类型和HCMV菌株而有很大差异，我们测量了HCMV- nt₅₀使用上述3种hcmv -细胞组合的滴度。结果显示，gb特异性IIFA滴度与HCMV-NT呈正相关₅₀当HCMV-NT₅₀在MRC-5成纤维细胞中测定，但在rp -1 ECs中未测定(图2)。4a)，表明相关性依赖于病毒株和用于测量HCMV-NT抗体的细胞。此外，研究还发现，NT抗体与之反应的抗原靶位点比那些引起非NT抗体的靶位点糖基化程度更高，这表明HCMV-gB利用糖基化来屏蔽NT表位[36］．也有研究表明，gB亚单位疫苗对NT抗体诱导的部分效果是独立的[37，38]，并且绝大多数(> 90%)b细胞克隆分泌的gb特异性抗体对HCMV不具有NT活性[39］．此外，在自然感染的人血清中对重组gB的吸附研究表明，抗gB抗体不会通过中和反应显著促进HCMV EC进入[15，17］．这些报告支持了本研究的结果，即血清中抗gb特异性IIFA滴度与HCMV 1612/ rp -1 ECs组合测定的NT抗体滴度相关性很小。然而，应该注意的是，中和试验是在缺乏补体的情况下进行的。鉴于gB中至少有两个中和表位已被证明完全依赖补体，gB亚单位疫苗诱导的中和活性往往表现出严重的补体依赖性，并且补体的存在使人恢复期血清的成纤维细胞中和活性增强2至4倍[40，41］．值得注意的是，gb特异性抗体对成纤维细胞中和活性的贡献可能被低估，因为血清中的内源性补体是热灭活的，而热灭活后没有添加外源性补体。因此，如果在补体存在的情况下进行中和试验，则gB抗体与中和活性之间的相关性可能更强。据报道，结构和抗原性分析表明，融合后的gB三聚体存在补体独立的中和位点[42］．因此，对gB三聚体表面的修饰减少了对非中和位点的暴露，例如避免糖基化，可能会导致HCMV疫苗开发的改进。

虽然gM/gN的功能在很大程度上尚不清楚，但以前有一些报道表明gM/gN可以引起病毒中和抗体反应[5，43］．然而，抗gm /gN IIFA抗体滴度与NT无相关性₅₀滴度(无花果。4b).据报道，通过gN的糖基化，NT抗体的免疫逃避成为可能[44］．结果IIFA gM/gN-IgG滴度与HCMV-NT无显著相关性₅₀本研究中的滴度可能是由于gN的糖基化。因为gM/gN是病毒颗粒上表达最多的糖蛋白复合物[45]， gM/gN的糖基化可以降低NT抗体的NT效应，如gB [36］．gM/gN是否能诱导宿主免疫逃避，其机制有待进一步研究。此外，还需要澄清gM/gN复合物是否具有诱导HCMV中和抗体的能力。

在本研究中检查的所有细胞和gc的组合中NT之间的相关性₅₀抗pc IIFA抗体滴度与NT的相关性最强₅₀以ECs为单位测定滴度(图;4d).此外，抗gh /gL/gO IIFA滴度也与HCMV-NT显著相关₅₀滴度(无花果。4c).如先前报道，这些糖蛋白复合物似乎是NT抗体诱导中最重要的抗原[17，30.，46，47，48，49］．此外，gH/gL/gO中存在多个中和表位。那些仅由gH/gL序列定义的基因在gH/gL/gO和五聚体复合物中都很常见，并且在很大程度上阻止了成纤维细胞和上皮细胞的进入，而那些由UL128/UL130/UL131A序列定义的基因仅阻止上皮细胞的进入。PC内gH/gL上的表位可能与HCMV进入成纤维细胞有关。因此，共同表位的存在可能会对抗pc和抗gh /gL/gO IIFA抗体滴度与HCMV-NT的正相关性和显著相关性产生重大影响₅₀效价(无花果。4C和d) [31］．

我们研究的一个局限性是我们使用固定和渗透细胞进行IIFA。因此，血清抗体不仅可以接触到病毒粒子表面表达的病毒蛋白，还可以接触到细胞内部表达的病毒蛋白，提示IIFA阳性信号可能是由于抗体与单个gc、错误折叠gc或gc的部分降解产物反应所致。相比之下，基于非渗透细胞的IIFAs可能显示出与中和活性更强的相关性，因为先前的研究表明gH/gL和gM/gN复合物的细胞表面表达均局限于构象原生复合物[30.，50，51，52，53］．因此，与这些复合物发生反应的抗体将被选择性地用IIFA检测，其中非渗透细胞被用于IIFA抗原。因此，需要进一步的研究来消除IIFA信号，因为抗体与非天然表位反应，可能不表现出中和活性。

据我们所知，因为还没有报道类似的研究将gO包括在gH/gL复合物或gM/gN中。结果非常值得报道。这一发现对开发抗HCMV感染的疫苗和免疫疗法具有特别重要的意义。

IIFA测定的抗pc抗体滴度和抗gh /gL/gO抗体滴度与HCMV-NT高度相关₅₀在HCMV me -成纤维细胞和HCMV 1612-上皮细胞组合中测定滴度。通过测定IIFA中gH/gL/gO或PC的抗体滴度，可以估计HCMV-NT的水平₅₀效价。本研究获得的数据表明，对gH/gL复合物诱导强烈的免疫反应对开发HCMV疫苗很重要，这可能有能力降低先天性HCMV感染的风险。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

DMEM:

杜尔贝科改良的鹰中号

电子商务:

上皮细胞

ELISA:

酶联免疫吸附试验

FITC:

异硫氰酸荧光素

gc:

糖蛋白复杂

医生:

糖蛋白

:血巨细胞病毒

人类巨细胞病毒

IIFA:

间接免疫荧光法

门店:

下一代测序仪

NT:

中和

NT₅₀：

50%病毒- nt滴度

子:

开式阅读架

PC:

五聚物复杂

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

空斑形成单位:

斑块形成单位

的PGM:

个人基因组机

我们要感谢福井芳子女士和津田美hoko女士在细胞培养、HCMV临床分离物的传播和会计管理方面的及时帮助。

这项工作得到了日本儿科研究基金会的资助和教育、文化、体育、科学和技术部的科学研究资助(资助号15 K09675和18 K07894)。

作者及隶属关系

1. 日本国立传染病研究所病毒学1部，东京新宿区富山1-231，日本，162-8640

   柴村美穗，吉川智树，山田秀一，稻垣拓哉，阮富黄安，藤井光，原田静子，福志修越和斋条雅之

2. 东京大学医学研究生院儿科学部，日本东京文教区本乡7-3-1

   柴村美穗和冈明

3. 早稻田大学生命科学与医学生物科学系，日本东京新宿区若松町2-2号

   Takuya Inagaki

4. 东京大学医学研究生院发育医学科学系，日本东京文教区本乡7-3-1

   Phu Hoang Anh Nguyen, Masashi miziguchi和Masayuki Saijo

5. 日本爱媛市今市冈山科学大学兽医学院

   Hikaru藤井裕久

贡献

Shibamura进行了大部分实验并撰写了手稿。M Saijo, AO和MM策划并指导了研究，并支持了本文的撰写。TY, TI, SY, PHAN, HF, SH和SF支持执行本研究讨论中的研究。所有作者阅读并修改了手稿，并批准了最终手稿。

相应的作者

对应到小松Saijo．

伦理批准并同意参与

本研究在国家传染病研究所(NIID)医学研究伦理委员会的批准下进行，用于人体受试者(批准号:797)。所有志愿献血者均获得知情同意。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

我们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

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