小分子阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒与CD163受体的相互作用和猪细胞感染

背景

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是影响全球猪肉行业最具经济破坏性的疾病之一。PRRSV是由PRRSV病毒引起的。目前对这种猪疾病没有有效的治疗方法。

方法

通过人工智能分子筛选，我们获得了一组预测靶向PRRSV感染特异性细胞表面受体CD163的清除受体富半胱氨酸结构域5 (SRCR5)的小分子化合物。这些化合物通过基于细胞的双分子荧光互补(BiFC)实验筛选，并通过猪肺泡巨噬细胞(PAMs) prrsv感染实验进一步评估和验证其阳性命中功能。

结果

通过BiFC分析，我们发现了一种具有先前未验证功能的化合物，4-氟-2-甲基- n- [3-(3-morpholin-4-ylsulfonylanilino)喹啉-2-基]苯磺酰胺(此处指定为B7)，可显著抑制PRRSV糖蛋白(GP2a或GP4)与CD163-SRCR5结构域之间的相互作用。我们进一步证明，化合物B7以剂量依赖的方式抑制PRRSV主要靶点PAMs的PRRSV感染。B7对ⅰ型和ⅱ型PRRSV株的感染均有显著抑制作用。进一步对与B7结构相关的化合物进行比较和功能评价，发现B7的3-(morpholinsulfonyl)苯胺片段或B7类似物中的3-(胡椒酰磺酰)苯胺片段对抑制PRRSV感染具有重要作用。

结论

我们的研究确定了一种新的策略，通过阻断PRRSV- cd163与小分子的相互作用来潜在地预防猪的PRRSV感染。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是经济上最重要的猪疾病之一，每年给全球养猪业造成超过数十亿美元的损失。PRRSV的致病病毒(PRRSV)是一种包膜、阳性意义的单链RNA病毒Arterivirus目内属Nidovirales［1，2]。PRRSV感染导致母猪严重繁殖衰竭和仔猪呼吸道疾病[3.]。这可能并发继发感染，具有更大的临床表现和死亡率[4，5，6]。不幸的是，由于PRRSV的高度遗传和抗原异质性，仍然缺乏广泛有效的疫苗[7，8，9]。需要采取新的方法来防治PRRS大流行病，以减轻这种疾病的破坏性后果。

繁殖性PRRSV感染主要通过猪肺中的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)发生[10]。CD163是一种巨噬细胞特异性膜清道夫受体，是PRRSV感染的关键受体[11，12，13，14]。基因敲除研究证实了CD163表达对PRRSV感染的必要性，表明没有CD163的猪对PRRSV具有抗性[15，16，17]。在CD163的9个细胞外清除率受体富半胱氨酸(SRCR)结构域中，SRCR5被发现对PRRSV感染至关重要[18]，表达缺失SRCR5的CD163的猪单核/巨噬细胞完全免受PRRSV感染[19]。细胞下拉实验和双分子荧光互补(BiFC)分析显示，PRRSV通过其次要糖蛋白GP2a和GP4直接与CD163相互作用[20.，21]，结合细胞外但不跨膜或细胞质区域的CD163 [21]。因此，假设CD163-SRCR5结构域直接与PRRSV糖蛋白相互作用是合理的。然而，研究CD163-SRCR5结构域与PRRSV糖蛋白之间蛋白-蛋白相互作用(PPIs)的实验尚未报道。

许多小分子已被确定通过结合和拮抗宿主细胞受体/共受体有效地阻断各种人类病毒的进入[22，23，24，25，26，27，28，29]。然而，PRRSV和CD163之间靶向PPI的小分子尚未报道。最近对猪CD163 x射线晶体结构的研究表明，与srcr -超家族蛋白M2BP和CD5中的同源区域相比，CD163- srcr5结构域环5-6区域(Phe544-Arg570)具有不同的3-D结构排列[30.]。此外，与野生型CD163相比，Arg561在SRCR5环5-6区变为Ala的CD163突变体抑制PRRSV感染[30.]。这就提出了用小分子靶向Arg561区域的猪CD163-SRCR5可能预防PRRSV感染的可能性。在这项研究中，我们开发了一种bfc方法来研究PRRSV糖蛋白与CD163-SRCR5结构域之间的PPI。使用这种方法，我们能够通过AtomNet筛选出一系列预测能结合猪CD163-SRCR5结构域的小分子[31]鉴定抑制PRRSV糖蛋白与SRCR5之间PPI的化合物。我们进一步在体外验证了阳性化合物抑制PAMs PRRSV感染的能力。对B7及其少量类似物的分析揭示了B7对PRRSV感染的抑制活性的重要功能片段。

化学物质、细胞和病毒

所有筛选化合物均由Atomwise, Inc. (CA, USA)通过Mcule, Inc. (CA, USA)作为人工智能分子筛选(AIMS)奖励计划的一部分提供，或直接从MolPort, Inc. (NY, USA)购买。从6头健康的4 - 6个月大和prrsv阴性的长白/约克郡杂交猪身上收获PAMs。简单地说，猪在屠宰前被安乐死。肺在冰上被转移到细胞培养箱中。经气管支气管小心地将含200 U/mL青霉素和200 μg/mL链霉素的温PBS注入双肺。按摩后取出支气管肺泡灌洗液(BALF)。将BALF在400 g离心15 min，所得球粒为PAMs。然后用温热的完整培养基洗涤两次颗粒。细胞计数并在90%牛血清(HI, Rocky Mountain biicals, Inc)和10% DMSO (Sigma)中冷冻。细胞保存在Mr. Frosty冷冻容器(Nalgene, USA)中，在- 80°C下放置过夜，然后转移到液氮中。 PAMs were cultivated in RPMI-1640 (Gibco) supplemented with 10% FBS (HI, Rocky Mountain Biologicals, Inc), 2 mM Glutamax (Invitrogen), 0.1 mM MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin (Gibco), and 0.5 μg/mL Amphotericin B (Gibco). All PRRSV strains were propagated and titrated in MARC-145 cells.

目标屏幕

虚拟筛选使用AtomNet进行，AtomNet是第一个用于基于结构的药物设计的深度神经网络，用于预测蛋白质-配体结合亲和力[31]。为了定位猪CD163与PRRSV糖蛋白(GP2a或GP4)的相互作用，利用CD163- srcr5结构域(PDBID:5HRJ)的x射线结构确定了以R561为中心的筛选位点，包括残基C502、S503、D505、W540、A541、E543、A559、P560、R561、P562、D563、G564和C566。如前所述，制备并筛选了市售有机小分子化合物(~ 4 M v20171018)的Mcule文库[32]，使用蛋白质配体构象的集合。AtomNet对4个M分子中的每一个都进行了评分和排名，随后，在得到74个化合物进行实验测试之前，对200个化学上不同的化合物进行了进一步的检查，以确定不需要的亚结构和分子性质。

质粒构建

将截断的Venus-I152L的N端和C端分别插入载体主干pMyc-CMV和pCMV-HA中，分别构成商业质粒pifc - vn155 (I152L)和pifc - vc155 (Addgene, Watertown, MA, USA) (Kodama, Y. et al.， Biotechniques, 2010)。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增了猪CD163受体清除剂受体富半胱氨酸结构域2 (SRCR2)和SRCR5以及PRRSV vr2332株糖蛋白GP2a和GP4的cDNA片段。将扩增的SRCR2或SRCR5 cDNA片段亚克隆到经EcoRI/BglII酶切的pifc - vn155 (I152L)载体中。为了构建GP2a和GP4融合蛋白，将编码GP2a或GP4的cDNA片段亚克隆到经EcoRI/BglII酶切的pifc - vc155载体中。所有质粒克隆均经DNA Sanger测序验证。

BiFC化验

在12孔板中培养HEK293T细胞，使用FuGENE®6 (Promega, Madison, WI, USA)用合适的质粒转染每个BiFC检测。5 h后，在培养基中加入不同浓度的化合物。以DMSO作为对照。用倒置尼康荧光显微镜捕捉转染质粒后24 h处理细胞的荧光图像。用ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)。

细胞毒性试验

筛选的化合物在增殖性PRRSV感染的主要宿主细胞PAMs中测定了细胞毒性。简单地说，将不同浓度的化合物加入到24孔板中播种的pam中，并孵育24小时。每孔加50 μl MTT分析标记试剂(In Vitro Toxicology assay Kit, MTT based, Sigma-Aldrich)孵育4 h，每孔加500 μl增溶液孵育过夜，使甲酰胺晶体完全溶解。在600 nm处用分光光度法测定样品的吸光度。经DMSO处理的PAMs作为对照。

定量反转录PCR (qRT-PCR)

根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD)从感染PRRSV的pam中提取总RNA。使用纳米滴分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量RNA浓度。四种PRRSV毒株ORF7基因和猪GAPDH特异性qRT-PCR引物见表52。GAPDH作为管家基因进行基因表达正常化。数据用ABI 7500相关软件处理。

西方墨点法

从HEK293T细胞中分离出全细胞蛋白。简单地说，用冷PBS冲洗细胞两次。去除PBS后，将添加1% (v/v)蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷RIPA缓冲液(ThermoFisher Scientific)加入细胞中，并置于冰上5min。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)测定蛋白浓度。每个样品中等量的变性蛋白在10% SDS-PAGE上分离，并转移到PVDF膜上。在用Myc-Tag小鼠单克隆抗体(1:1000,Cell Signaling Technology, Danvers, MA)或抗gapdh抗体(1:1000;Cell Signaling Technology, Danvers, MA)在4°C下过夜。用1倍T-BST洗涤后，用酶标二抗(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)在室温下孵育1小时，用ECL Blotting底物(Bio-Rad)显像，在ChemiDox XRS图像系统(Bio-Rad)下显像。

PRRSV感染及滴定试验

对于PRRSV感染的PAM细胞，在感染前1天播种PAM。对照细胞用DMSO处理，试验细胞用筛选的化合物(5 ~ 20 μM)处理，接种前4 h，接种过程中1 h，接种后24 h。在MOI = 0.1的条件下，用VR-2332、SDSU73、NADC30或Lelystad PRRSV分别接种细胞1 h。将24 h的细胞培养基上清液保存在- 80°C，以待将来的滴定试验。

在PRRSV滴定试验中，将MARC145细胞接种于48孔板中，接种前培养至~ 80%密度。取病毒上清液，连续稀释10倍，每孔加100 μl稀释液，分6个重复。2 h后将接种物从细胞中取出，每孔用0.5 mL添加2% FBS、2 mM谷氨酰胺、0.1 mM MEM非必需氨基酸、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素(Invitrogen)的DMEM代替。细胞在37℃下培养6 d，记录细胞病变效果。采用Reid和m ench法计算PRRSV滴度，以组织培养感染中位剂量(TCID)表示₅₀/毫升)。

统计分析

所有实验均至少进行3次。数据分析采用单因素方差分析和Tukey事后比较或配对t检验。数据以mean±sd和p< 0.05为差异有统计学意义。

建立bic检测方法以鉴定抑制PRRSV和CD163之间PPI的小分子

使用前面描述的BiFC向量[33基于碎片化的金星蛋白(VN-155[I152L]，以下简称VN)和(VC-155，以下简称VC)，我们建立了猪CD163蛋白SRCR5或SRCR2结构域与VN之间、PRRSV次要糖蛋白(GP2a或GP4)与VC之间的融合蛋白构建体(图4)。1,年代1)。我们在HEK293T细胞中共表达这些质粒，以评估SRCR5结构域与GP2a或GP4之间的PPIs。与CD163-SRCR5在介导PRRSV- cd163相互作用从而导致PRRSV感染中的关键作用一致[18，19]， CD163-SRCR5/VN融合蛋白(SRCR5-VN)与GP2a-或GP4-VC相互作用，在显微镜下检测到强荧光(图2)。1 b, C(顶板)。相比之下，在PRRSV感染和PRRSV- cd163相互作用中不可或缺的CD163-SRCR2结构域融合蛋白(SRCR2-VN) [18]，仅与GP2a-或GP4-VC共表达时显示背景荧光(图2)。1B, c，下面板)。这些数据支持猪CD163-SRCR5结构域直接与PRRSV糖蛋白GP2a和GP4相互作用。

然后，我们询问我们建立的BiFC检测是否可以用于鉴定有可能阻断CD163与PRRSV之间相互作用的小分子。使用AtomNet对以R561为中心的区域进行了商业小分子库的定制虚拟筛选(图5)2)，基于猪CD163-SRCR5结构域的三维蛋白结构[30.]，并获得了74种预测靶向该潜在结合区域的化合物。然后，我们使用我们的bbic分析来测试这些化合物，以评估它们抑制GP2a和SRCR5之间PPI的能力。质粒在HEK293T细胞中共转染，4 h后，分别在5 μM细胞上施加化学物质。24 h后，在荧光显微镜下拍照，定量荧光。在所有74种化合物中，我们鉴定了1种阳性化合物，本文命名为B7(4-氟-2-甲基- n- [3-(3-morpholin-4-酰基磺酰苯胺)喹啉-2-基)苯磺酰胺，C₂₅H₂₄FN₅O₅年代₂,无花果。1d、表51)，在我们的BiFC实验中显著抑制了重组荧光(图2)。1e)。通过另一种bbc实验，我们进一步验证了B7也能抑制PRRSV GP4糖蛋白与CD163-SRCR5结构域之间的PPI(图3)。1f)。

化合物B7对PAMs PRRSV感染的抑制作用

基于B7对CD163-SRCR5结构域与PRRSV糖蛋白相互作用的抑制作用，我们想知道该化合物是否会抑制pam的PRRSV感染。MTT实验表明，在25 μM以下的浓度下，B7化合物对pam具有良好的耐受性₅₀计算(34]为81.7 μM(图5)3.)。分别用B7在0、5、10、15、20 μM条件下对原代PAMs进行预处理4 h，然后接种PRRSV病毒株VR-2332 (MOI = 0.1) 1 h。然后将感染的pam与不同浓度的B7连续孵育。接种24 h后，从pam中提取总rna。定量反转录-PCR (qRT-PCR)显示B7处理对PAMs的PRRSV感染具有剂量依赖性的抑制作用(图7)。2a).从感染的PAMs培养基中对PRRSV进行滴定进一步证实，10 - 20 μM B7处理能有效抑制PAMs的PRRSV感染，10 μM B7和15 μM B7处理能分别使病毒滴度降低1.7和2.9 log(图2)。2b)， B7的IC50值为7.5 μM。选择指数是衡量药物细胞毒性与选择活性之间的窗口值，根据LC的比值，本研究估计B7化合物的选择指数为10.9₅₀/集成电路₅₀类似于前面所描述的[35]。

进一步检测了B7对多种PRRSV病毒株的抑制作用。15 μM B7预处理4 h后，分别与PRRSV病毒株VR-2332、SDSU73、NADC30 (II型)或Lelystad (I型)接种1 h, 15 μM B7连续孵育24 h。qRT-PCR显示，B7处理显著降低了所有PRRSV菌株感染pam中检测到的病毒RNA(图2)。2c).这种抑制作用通过感染pam培养基的病毒滴定结果进一步证实，3种II型PRRSV菌株的病毒滴度降低了2.8-3.1对数，15 μM B7处理后I型菌株(Lelystad)的病毒滴度降低了2.2对数(图2)。2d).因此，化合物B7确实抑制了PAMs的PRRSV感染。

基于蛋白质配体构象的AtomNet平台筛选和我们的BiFC分析结果表明，B7与CD163-SRCR5直接结合，而不是单独与GP2a和GP4结合，以阻断CD163-PRRSV相互作用。为了进一步排除B7直接靶向PRRSV糖蛋白的可能性，我们用15 μM B7或DMSO培养PRRSV VR-2332株病毒，然后进行直接病毒滴定试验。如果B7直接靶向PRRSV糖蛋白，则与B7预先孵育的病毒相比，其传染性应降低。然而，没有观察到病毒滴度的显著降低(图5)4)。综上所述，我们的研究结果支持化合物B7通过靶向CD163-SRCR5结构域抑制PRRSV感染。

评价化学结构与B7相似的化合物对PRRSV感染的抑制作用

B7是一种合成化合物，具有先前未经证实的功能。为了检验B7支架与PRRSV感染抑制的结构相关性，我们在PubChem上搜索了类似的化合物，并获得了另外6个与B7结构相关的化合物(本文命名为B7- a1至A6，图6)。3.a、表S1)。我们首先使用我们的bic实验来检查这些B7类似物是否可以抑制CD163-SRCR5结构域和PRRSV GP2a蛋白之间的PPI。与B7类似，化合物B7- a1至B7- a4均显著抑制CD163-SRCR5/GP2a PPI。3.b, c)。有趣的是，将B7的3-(morpholinsulfonyl)苯胺基部分转移到4-(morpholinsulfonyl)苯胺基位置(B7- a2)，或将前者部分改变为3-(胡椒酰磺基)苯胺基(B7- a4，蓝色圆圈)并不会消除这些化合物抑制CD163-SRCR5/GP2a PPI的能力(图7)。3.b, c)。然而，在化合物B7-A5和B7-A6中，用morpholine取代3-(胡椒酰磺酰)苯胺或3-(morpholinsulfonyl)苯胺片段(图7)。3.a，红圈)完全阻断了它们抑制CD163-SRCR5/GP2a相互作用的能力(图2)。3.b, c)。

为了确认这些化合物的功能，我们进一步评估了化合物B7-A1至B7-A5对PAMs PRRSV感染的作用。MTT实验显示，这些化合物在15 μM水平下对pam没有明显的细胞毒性作用(图5)5)。分别用每种化合物的15 μM对pam进行预处理4 h，然后用PRRSV病毒株VR-2332接种1 h。然后用15 μM的相同化合物连续孵育细胞。24 h时，从感染的PAMs中提取总RNA, qRT-PCR显示，与B7类似，化合物B7- a1至B7- a4与对照相比，均显著抑制了处理后PAMs中的PRRSV RNA水平(图7)。3.d)。此外，与我们的bbc结果一致，B7-A5治疗未能抑制感染pam中的PRRSV RNA水平(图5)。3.d).感染细胞24 h培养基的滴定进一步证实了我们的发现，表明化合物B7-A1至B7-A4而非B7-A5都能抑制PAMs的PRRSV感染，化合物B7-A1至A4处理的病毒滴度分别降低2.2、2.4、1.2和2.8对数(图7)。3.综上所述，我们的研究结果表明，3-(morpholinsulfonyl)苯胺片段(在B7和B7- a1至B7- a3中)和3-(胡椒酰磺酰基)苯胺片段(在B7- a4中)对这些化合物对PRRSV感染的抑制作用是重要的。

单独使用3-(morpholinsulfonyl)苯胺或3-(哌啶基磺酰)苯胺不能抑制PRRSV感染，而B7治疗后可显著抑制PRRSV感染

我们还注意到，从B7(化合物B7- a1, A2和A3)的苯磺酰胺部分去除甲基和/或氟基团，图7。3.a)在BiFC实验中减弱了化合物的抑制功能(图2)。3.b, c)和PRRSV感染试验(图2)。3.D, e)，尽管效果不如修饰3-(morpholinsulfonyl)苯胺部分那么显著。为了确定3-(morpholinsulfonyl)苯胺基或3-(哌啶基磺酰)苯胺基化学基团是否足以抑制PRRSV感染，我们购买了这两种化合物，并分别命名为B7-A7和B7-A8(图7)。4a).每个分子15 μM的PAMs处理4 h，然后接种1 h PRRSV VR-2332。然后将细胞与相同的化合物孵育24小时。从处理过的细胞培养基中对PRRSV进行滴定显示，这两种化合物都不能抑制pam的PRRSV感染(图2)。4b).因此，虽然这两个片段在功能上至关重要，但其他片段(如苯磺酰胺)的存在对于抑制PRRSV感染也是必不可少的。

在验证了接种前后B7对PRRSV感染的抑制作用后，我们进一步询问单独接种B7或接种前后是否有显著效果。接种B7 4 h后接种PRRSV -2332株1 h，不进行后处理;接种PRRSV 24 h后不进行后处理。在感染后24小时，我们评估了PAMs中的病毒RNA和培养基中的PRRSV滴度。qRT-PCR显示，B7单独处理后对PRRSV感染的抑制效果与预处理后加预处理相似，而预处理后的影响最小(图5)。4c).对感染的pam培养基进行病毒滴定进一步证实了这一点，单独接种后处理化合物B7可使PRRSV滴度降低2.8 log(图2)。4d)。

先前的研究表明，在生产感染过程中，CD163介导PRRSV脱壳而不是内化[36，37，38]，这是病毒粒子内化到宿主细胞后的一步。然而，PRRSV的结合和内化是由其他受体/共受体介导的，例如硫酸肝素和唾液粘附素[39]。为了验证B7是否会影响PRRSV的结合，我们在PRRSV接种期间将PAMs与15 μM B7或DMSO对照孵育1小时。接种后立即用qRT-PCR评价PAMs与PRRSV的结合情况，并反复清洗去除未结合的病毒。我们发现B7在接种1小时内孵育不影响PRRSV的结合(图5)6)。此外，我们已经发现B7接种后处理与接种前加接种后处理具有相当的抗prrsv效果(图2)。4c, d)。综上所述，我们的研究结果与之前发现的机制一致，即CD163与PRRSV GP2a和GP4相互作用，介导内核体酸化后PRRSV脱衣，以确保有效的病毒感染，而不是介导病毒的结合和内化[39]。

尽管猪CD163-SRCR5结构域被确定为PRRSV感染的关键，表明PRRSV与SRCR5结构域之间存在直接相互作用，但尚未有研究报道证实这一特定的PPI。通过bic分析，我们证实CD163-SRCR5结构域可以直接与PRRSV糖蛋白GP2a和GP4相互作用。这与最近的报道有关，缺乏CD163-SRCR5结构域的转基因猪对PRRSV感染具有抗性[40，41]。我们进一步发现一个可以阻断CD163-SRCR5结构域与PRRSV糖蛋白相互作用的小分子B7也能在体外抑制pam的PRRSV感染。我们在此报道的BiFC检测对于进一步筛选能够阻断PRRSV和CD163之间PPIs的小分子具有重要价值。

我们注意到5 μM B7足以抑制GP2a/GP4a与CD163-SRCR5之间的相互作用(图3)。1e, f)，而需要更高的浓度才能显著抑制病毒复制(图2)。2a, b)。我们推断，这种差异可能源于B7化合物在bcc和PRRSV感染试验中分别在非常不同的情况下起作用。首先，在bbc实验中，只有单一的PRRSV糖蛋白GP2a或GP4作为融合蛋白表达。然而，在PRRSV感染实验中，GP2a和GP4都在病毒粒子包膜上固有表达。其次，PAMs用于PRRSV感染实验，这与bic实验中使用的转化HEK293T细胞系有很大不同。这些都可能导致测定对B7化合物敏感性的差异。

PRRSV 3种小包膜糖蛋白GP2a、GP3和GP4之间的相互作用是PRRSV感染所必需的[21，42]。此外，GP5是PRRSV包膜中不可缺少的主要糖蛋白，对病毒颗粒的产生至关重要[42]。虽然所有的PRRSV糖蛋白相互之间都表现出一定的相互作用，但只有GP2a和GP4特异性地与CD163受体相互作用[21]。因此，我们的研究主要集中在研究阻断CD163与GP2a/GP4的相互作用。然而，GP5是病毒包膜中不可或缺的一部分，可能对PRRSV在感染细胞中的复制至关重要[20.]。最近也有研究表明GP5与非肌肉肌球蛋白重链9相互作用，通过病毒内化机制对PRRSV感染很重要[43]。先前的研究表明，CD163介导PRRSV脱壳而不是内化，从而导致多产性病毒感染[36，37，38]。因此，我们有理由推测，在病毒感染过程中，GP2a/4和GP5介导了不同的后续过程。

我们发现单独接种B7后处理对PRRSV感染的抑制程度与接种前加接种后处理相似，而单独接种前处理无明显效果。这表明B7化合物与CD163-SRCR5蛋白结构域之间存在可逆关联，通过洗涤去除B7化合物可以解除对PRRSV糖蛋白与CD163-SRCR5相互作用的抑制作用。进一步的精细构效关系(SAR)分析将揭示B7与SRCR5分子-分子结合的本质。

尽管做出了许多努力，但目前还没有开发出广泛有效的疫苗来保护猪免受PRRSV的侵害[9]。需要开发新的方法来控制猪的PRRS。用天然或合成化合物抑制PRRSV和CD163之间的关键PPIs是对抗PRRSV大流行病的一种独特方法，可以用作疫苗接种的佐剂，以进一步减少病毒载量和脱落。到目前为止，化合物B7没有已知的生物活性报告。B7对PAMs的PRRSV感染具有明显的剂量依赖性抑制作用，这使得该化合物及其衍生物成为进一步评估其体内抑制PRRSV感染功效的明确候选者。我们的研究结果表明，B7及其类似物的抑制功能取决于完整的3-(morpholinsulfonyl)苯胺或3-(piperidinylsulfonyl)苯胺片段，这为开发更有效的抗PRRSV感染化合物提供了进一步的线索。这一发现，以及对参与PRRSV识别的CD163-SRCR5结构域关键残基的全面了解，将为靶向筛选抗PRRS的有效化合物提供相关信息。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种传染病，每年给全球猪肉行业造成数十亿美元的损失。目前没有有效的疫苗治疗PRRS。巨噬细胞特异性表面受体CD163是猪感染PRRS病毒(PRRSV)所必需的。通过虚拟筛选，我们获得了74个预测靶向CD163的清除率受体富半胱氨酸结构域5 (SRCR5)的小分子。通过基于细胞的双分子荧光互补(BiFC)实验，我们在这些小分子中发现了一种化合物(这里指定为B7)，它可以显著阻断PRRSV糖蛋白与CD163-SRCR5结构域之间的相互作用。我们进一步证实，化合物B7能抑制多种PRRSV毒株对猪肺泡巨噬细胞(PAMs)的感染，而PAMs是PRRSV的主要靶点。进一步的功能分析表明，B7类似物中的3-(morpholinsulfonyl)苯胺片段或3-(胡椒酰磺酰)苯胺片段对这种抑制作用很重要。我们的研究确定了一种利用小分子潜在地预防猪PRRSV感染的新策略。

本研究中使用和/或分析的数据集可应通讯作者的合理要求向其提供。

BiFC:

双分子荧光互补

PAMs:

猪肺泡巨噬细胞

PPI:

蛋白质相互作用

PRRS:

猪繁殖与呼吸综合征

PRRSV:

PRRS病毒

存在:

定量逆转录聚合酶链反应

SRCR5:

清道夫受体富半胱氨酸结构域

白平衡:

西方墨点法

不适用。

本研究由美国农业部/国家粮食和农业研究所(NIFA)资助2017-67016-26675给Y.T.和a.g.， Atomwise Inc.。人工智能分子筛选(AIMS)奖授予Y.T.，康涅狄格健康创新治疗计划(PITCH)有前途项目奖授予Y.T.和A.G.，康涅狄格大学卓越研究计划授予Y.T.和A.G.

作者及单位

1. 康涅狄格大学系统基因组学研究所动物科学系，美国康涅狄格州斯托斯路1390号，斯托斯，06269

   黄昌、朱佳琪、朱嘉琪、Alec Knupp、Anna Hakey、唐扬

2. Atomwise公司，市场街717号，800套房，旧金山，加州，94103，美国

   Denzil伯纳德

3. 康涅狄格大学药学系，美国康涅狄格州斯托尔斯北伊格维尔路69号，06029

   拉达·查兰·达什和凯尔·哈登先生

4. 康涅狄格大学病理生物学与兽医学系，美国康涅狄格州斯托斯市北伊格维尔路61号，06269

   安东尼奥Garmendia

贡献

c.h.、a.g.和Y.T.设计并执行了这项研究，分析了数据，并撰写了手稿。D.B.进行虚拟筛选和材料，J.Z.帮助收集PAMs, PRRSV传播，滴定和数据分析。R.C.D和M.K.H.提供了结构分析并修改了手稿。a.c.， a.k.， A.H.帮忙做了qRT-PCR。作者阅读并批准了最后的手稿。

相应的作者

对应到安东尼奥Garmendia或年轻的唐。

伦理批准并同意参与

本研究中使用的猪肺泡巨噬细胞(pam)是根据康涅狄格大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议(A17-004)从猪身上采集的。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

根据这项研究的结果，提出了一项临时专利申请。

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