HSC70是传染性法氏囊病病毒(IBDV)在DF-1细胞中感染所必需的gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

传染性法氏囊病(IBD)是一种高度传染性的传染病，可引起鸡法氏囊严重的免疫抑制和损伤。几种与IBD病毒(IBDV)感染有关的蛋白，如表面免疫球蛋白M、整合素、膜联蛋白A2和鸡热休克蛋白90，已经被鉴定出来。然而，在病毒感染中起关键作用的主要蛋白质尚未得到证实。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

用pcDNA-VP2质粒转染DF-1细胞株，采用免疫荧光法分析。用单克隆抗体拉下与IBDV VP2反应的蛋白，质谱鉴定。热休克同源蛋白70 (Heat shock同源蛋白70,HSC70)是其中一种蛋白，通过特异性抗体及其抑制剂研究其在IBDV感染中的作用。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

用pcDNA-VP2质粒转染DF-1细胞株，免疫荧光检测IBDV VP2在DF-1细胞中的表达。热休克同源蛋白70 (Heat shock同源蛋白70,HSC70)是利用抗VP2单克隆抗体(2H11)共免疫沉淀和质谱分析鉴定的蛋白之一。抗HSC70抗体和HSC70抑制剂(VER155008)都能强烈抑制DF-1细胞中的IBDV感染。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些结果表明HSC70可能是IBDV感染的重要因素。gydF4y2Ba

传染性法氏囊病病毒(IBDV)属于鸟纳病毒科，是一种非包膜病毒，由VP1、VP2、VP3、VP4和VP5蛋白质组成[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．VP2是主要的宿主保护抗原和衣壳蛋白[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．IBDV是一种流行于鸡群的严重免疫抑制疾病，给家禽业造成了巨大的经济损失[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．迄今为止，许多研究者对IBDV引起的疾病的发病机制进行了研究。例如，Hirai等发现表面免疫球蛋白M是LSCC-BK3细胞上的受体[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]， Lin等人的研究表明，鸡HSP90是IBDV进入DF-1细胞所必需的细胞受体复合物的一个组成部分[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．Delgui等人在BALB/c 3 T3细胞上验证了α 4 β 1整合素是另一个假定的受体[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．此外，Ren等人利用DF-1细胞的病毒覆盖蛋白结合试验(VOPBA)证明鸡膜联蛋白A2与病毒感染呈正相关[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．所有这些蛋白质都被发现能促进病毒感染。gydF4y2Ba

来自HSP70家族的两个蛋白HSP70和HSC70高度保守，由一个n端atp酶结构域、一个底物结合结构域和一个c端结构域组成[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．HSP70和HSC70不仅存在于细胞质中，还存在于各种细胞的细胞表面，如动脉平滑肌细胞、表皮细胞和肿瘤细胞[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．HSP70家族是分子伴侣家族中的重要一组，据报道在病毒生命周期的不同阶段，包括病毒进入、病毒粒子分解/组装、病毒基因组复制和病毒颗粒形成等方面发挥着至关重要的作用[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．轮状病毒是一种典型的非包膜病毒，它利用表面暴露的HSC70在附着后进入上皮细胞[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．类似地，柯萨奇病毒A9与GRP78相互作用，GRP78是HSP70家族的成员。GRP78促进病毒附着在靶细胞上[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在BHK-21和HeLa细胞中，HSP70与穿透后与HSP70相互作用的腺病毒衣壳蛋白相关[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．此外，HSP70和HSP40与单纯疱疹病毒1型启动蛋白(UL9)相互作用;因此，这两种热休克蛋白参与了病毒DNA复制的启动[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．对于人乳头瘤病毒，HSP70和HSP40可促进DNA合成和基因组复制[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．一些研究表明HSC70亚型D强烈参与网格蛋白介导的内吞作用，特别是在日本脑炎病毒进入C6/36细胞的晚期[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．本文利用免疫沉淀和质谱技术鉴定HSC70为VP2相互作用蛋白，并研究其在IBDV感染中的作用。gydF4y2Ba

病毒细胞和抗体gydF4y2Ba

DF-1细胞系是鸡胚胎成纤维细胞的一种永生细胞系，对许多分离的禽病毒敏感，由美国农业部的露西·李博士提供。细胞在含有5%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle 's培养基(DMEM)中培养，37℃，5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的气氛。我们在前期工作中制备了抗IBDV的特异性单克隆抗体2H11 [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．IBDV Q株是从受感染的鸡中分离出来的IBDV。该菌株在感染多重性(MOI)为1的DF-1细胞中增殖，并在DMEM (Gibco, China)与1%胎牛血清中37℃培养。在细胞病变效应(CPE)完全出现后约36小时，收集细胞和上清液。通过冷冻和解冻3个循环获得病毒，用Reed-Muench法测定滴度。gydF4y2Ba

细胞蛋白提取gydF4y2Ba

将转染质粒pcDNA- vp2或转染pcDNA载体的DF-1细胞分别培养于含5% FBS的DMEM中，37℃，5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．72小时后，用预冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞3次，并用一次性细胞刮板收集细胞。细胞被离心(13200 rpm, 5分钟)，并加入裂解缓冲液(含有蛋白酶抑制剂、150 mM NaCl、1% NP-40、25 mM Tris和5%甘油的混合物)。重复移液分散细胞球，置于冰上30分钟，以13200 rpm/min离心25分钟。在上清液中加入蛋白A + G琼脂糖或对照树脂，在37°C下轻轻摇晃3.5 h。样品在1000×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba收集上清液5 min。gydF4y2Ba

CoimmunoprecipitationgydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用共免疫沉淀交联试剂盒(赛默飞世尔科学公司，皮尔斯生物技术公司，IL，美国)进行共免疫沉淀测定。该试剂盒能够通过直接将纯化抗体固定在琼脂糖载体上，从裂解液或其他复杂混合物中分离出天然蛋白复合物。在这项研究中，含有细胞蛋白提取物的上清液与IBDV VP2蛋白特异性的单克隆抗体2H11孵育。将试剂盒分离的天然蛋白重悬于5 × SDS样品缓冲液中，煮沸10分钟，并进行10% SDS- page检测。电泳后，用银染色试剂盒(赛默飞世尔科学公司，皮尔斯生物技术，IL，美国)对凝胶进行染色。与阴性对照相比，差异丰富的蛋白带被切除并通过质谱鉴定。gydF4y2Ba

质谱分析gydF4y2Ba

如上所述，通过对比实验组和对照组的蛋白条带，可以发现差异丰度蛋白。将差异蛋白切除后送到上海中科新生命生物技术有限公司进行质谱分析。gydF4y2Ba

凝胶样品加入约200-400 μL ACN/100 mM NH中gydF4y2Ba_4gydF4y2BaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba，洗净并脱色至透明，去除上清液后冷冻干燥。将样品与DTT结合，在56°C下孵育30 min，之后将DTT溶液替换为200 mM IAA，然后在黑暗中孵育20 min。取上清液，加入100 mM NHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba加入样品，室温孵育15分钟。北半球gydF4y2Ba_4gydF4y2BaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba用100% ACN替换溶液，孵育5min，吸收，冷冻干燥。在混合液中加入2.5 ~ 10 ng/μL胰蛋白酶溶液，37℃孵育约20 h。将原溶液转移到新的Eppendorf管中，在凝胶中加入100 μL提取液(60% ACN/0.1% TFA)。超声处理15 min后，与酶解液结合，冷冻干燥。在样品中加入0.1%的甲酸溶液进行分解，通过0.22-μm膜过滤收集样品。gydF4y2Ba

每次均采用全扫描法测定多肽片段的质荷比。采用Bioworks Browser 3.3软件检索质谱检测原始文件对应的数据库，获得蛋白鉴定结果。检索参数如下:数据库:uniprot;分类:gydF4y2Ba背带吊裤带gydF4y2Ba；酶:胰蛋白酶;动态修饰:氧化(M);固定修饰:甲酰胺甲基(C);最大漏乳沟数:2;肽荷态:1 +、2 +、3+;蛋白质组学工具:3.1.6。通过Delta CN过滤:电荷=1 Delta CN≥0.1;电荷=2 Delta CN≥0.1;电荷=3Delta CN≥0.1; Filter by Xcorr:charge =1 Xcorr ≥1.9; charge =2 Xcorr≥2.2; charge =3 Xcorr≥3.75.

间接免疫荧光法(IFA)和共聚焦显微镜gydF4y2Ba

将DF-1细胞培养于玻璃罩卡瓦上，室温下用3%多聚甲醛固定在玻璃上20 min, PBS冲洗3次。然后将细胞与含有0.25% Triton X-100的膜破坏液在室温下孵育5分钟。这些样品用2%的牛血清白蛋白(BSA)在37°C下阻塞，并孵育45分钟。用抗hsc70抗体或正常免疫球蛋白G (IgG)稀释至1:100作为一抗，用fitc偶联山羊抗小鼠IgG作为二抗。样品与两种抗体孵育45分钟，然后用激光扫描共聚焦显微镜观察。gydF4y2Ba

西方墨点法gydF4y2Ba

转染pcDNA- vp2或pcDNA载体的DF-1细胞蛋白提取物经10% SDS-PAGE分离。然后将蛋白质转移到硝化纤维膜上，然后用5%的脱脂牛奶在tris缓冲盐水(TBS)缓冲液中在4°C下阻塞，并用TBS洗涤2次。蛋白与一抗在37°C下孵育2小时，随后与二抗在37°C下孵育2小时。洗涤3次后，用化学发光试剂检测。gydF4y2Ba

HSC70抑制剂(VER-155008)抑制试验gydF4y2Ba

将VER-155008 (Sigma)溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，加水稀释成一系列浓度，制备VER-155008原液。DF-1细胞在24孔板中传代培养18-24 h。在终浓度为5 μmol/L的细胞培养基中加入抑制剂VER-155008，在37℃培养箱中培养6 h。用无菌PBS洗涤两次，从培养基中除去抑制剂。在含1% FBS的新鲜培养基中培养DF-1细胞，并在MOI为0.1的条件下感染IBDV 2 h。PBS洗涤3次后，加入含1% FBS的培养基。细胞形态试验，50%组织培养感染剂量(TCID)gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba分别于24、48、72 h进行免疫印迹和IFA检测，并在指定时间点同步进行阳性对照。并对不同浓度的抑制剂的抑制作用进行了评价。DF-1细胞在6孔板中培养18 h后，在37℃下用含有不同稀释浓度的抑制剂(5 μM、0.5 μM、0.05 μM和0.005 μM)的细胞培养基中培养6 h，然后用新鲜培养基替代。在MOI为0.1的条件下接种IBDV，培养72 h。测定CPE、病毒滴度和蛋白表达量。gydF4y2Ba

TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba分析gydF4y2Ba

通过检测病毒滴度(TCID)来确定抑制效果gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)的感染。具体步骤如下。DF-1细胞胰酶化后镀于96孔板(3 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba每孔细胞)，并置于CO中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba37°C培养18小时。将抗体阻断试验或HSC70抑制剂试验的上清液稀释10gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba-至10gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba用含1%胎牛血清的细胞培养基进行折叠。96孔板中的培养基弃用，用上述稀释的新鲜培养基代替。每种稀释浓度的抑制剂分别加入8个重复孔，用于DF-1细胞感染。37℃孵育2 h后，将每孔培养基换成含1%胎牛血清的新鲜培养基。1周后，倒置显微镜观察细胞，选择有CPE的孔。的TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba采用CPE法测定，采用Reed和Muench法计算。gydF4y2Ba

抗体抑制试验gydF4y2Ba

DF-1细胞培养于48孔板中，每孔接种1.3 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞。孵卵24 h后，加入不同浓度(6 μg/mL、12.5 μg/mL和25 μg/mL)的抗hsc70抗体。正常对照IgG，终浓度为25 μg/mL。阳性对照组无任何抗体预处理，正常感染IBDV。将DF-1细胞与不同浓度的抗hsc70抗体在37°C下孵育2小时，随后在新鲜培养基中以MOI为0.01的IBDV攻击。同时，用正常对照IgG在37℃浓度为25 μg/mL的条件下孵育DF-1细胞2 h，然后在MOI为0.01的新鲜培养基中感染IBDV。孵育2小时后，用PBS大量清洗去除未结合的病毒。感染细胞在含1%胎牛血清的培养基中培养。所有用抗hsc70抗体预处理的感染细胞均用western blotting、IFA和病毒滴度(TCID)检测gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba) 48 h后测定。用正常对照IgG处理感染细胞和阳性对照组进行分析。gydF4y2Ba

许多蛋白质与IBDV VP2发生反应gydF4y2Ba

提取经质粒pcDNA-VP2转染的DF-1细胞或pcDNA载体转染的DF-1细胞(对照)的蛋白，并与抗IBDV VP2单克隆抗体反应。用10% SDS-PAGE和银染色分离共免疫沉淀洗脱蛋白。实验组有很多蛋白条带，而对照组只有少数蛋白条带(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这种差异意味着在DF-1细胞中许多蛋白质能够与IBDV VP2相互作用。gydF4y2Ba

质谱分析显示HSC70与VP2相互作用gydF4y2Ba

质谱结果(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)揭示了近45种能够与VP2蛋白结合的蛋白质分子。如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，鉴定出的蛋白主要属于3类:细胞骨架相关蛋白、酶相关蛋白和细胞调节相关蛋白。在这些差异蛋白中鉴定出HSC70(约70 kDa)。这一发现表明，在DF-1细胞中表达的VP2蛋白可能与HSC70特异性结合。gydF4y2Ba

抗hsc70抗体可阻断IBDV感染gydF4y2Ba

为了研究HSC70在IBDV感染中的作用，我们使用一种抗HSC70的抗体来阻断DF-1细胞中的IBDV感染。IFA结果(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa) HSC70抗体阻断了IBDV感染。IBDV在用抗HSC70抗体预处理过的DF-1细胞中不能生长，IFA中没有特异性的亮绿色荧光。相反，IBDV在无抗体处理组和正常IgG(同型)处理组均能很好地生长，并表现出特异性的亮绿色荧光。当我们使用不同浓度的抗体时，抗HSC70抗体的阻断作用是剂量依赖性的。当抗体浓度为25 μg/mL时，未观察到绿色荧光，但当抗体浓度为6.25 μg/mL时，可观察到绿色荧光。gydF4y2Ba

当抗hsc70抗体阻断DF-1细胞时，还测定了病毒滴度。结果表明(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)用抗hsc70抗体预处理DF-1细胞时，病毒复制降低。在不同浓度抗hsc70抗体预处理的DF-1细胞上清液中，病毒滴度与抗体浓度呈负相关。通过western blotting也发现了同样的结果(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).这些结果表明抗hsc70抗体强烈地阻止了病毒感染宿主细胞。gydF4y2Ba

HSC70抑制剂VER155008在DF-1细胞中抑制IBDV感染gydF4y2Ba

VER155008是一种特异性与HSC70相互作用的抑制剂。当我们用VER155008预处理DF-1细胞时，在感染IBDV的DF-1细胞中未发现CPE，而未处理VER155008的感染IBDV的DF-1细胞对照组中显示了丰富的CPE(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).本结果表明VER-155008抑制HSC70，导致DF-1细胞病毒感染失败。Western blot结果(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)显示未处理组VP2蛋白表达水平随时间增加;而预处理组在不同时间点均未检测到蛋白表达，甚至在感染后72 h也未检测到蛋白表达。病毒滴度测定(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)显示TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba预处理组在24、48、72 h为0;的TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba随着时间的推移而逐渐增加。这一结果表明，HSC70抑制剂VER-155008可防止病毒感染。gydF4y2Ba

抑制剂VER-155008的抑制作用是剂量依赖性的gydF4y2Ba

不同浓度的抑制剂VER155008处理的DF-1细胞显示不同的CPE水平。当抑制剂的浓度从0.005 μM增加到5 μM时，CPE变弱，几乎没有影响(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．随着抑制剂浓度的增加，对IBDV感染的抑制作用显著增强。IBDV VP2蛋白的病毒滴度和表达水平也得到了同样的结果，如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba由B可见，与阳性对照组相比，随着抑制剂浓度的增加，病毒滴度逐渐降低。令人惊讶的是，如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac, IBDV VP2蛋白的表达水平与病毒滴度的变化一致。gydF4y2Ba

在这项工作中，pcDNA-VP2-DF-1细胞系中表达的VP2蛋白与抗IBDV VP2蛋白的单克隆抗体2H11共沉淀。同时，与IBDV VP2衣壳蛋白相互作用的蛋白被拉下。免疫沉淀和质谱分析显示，DF-1细胞上的许多蛋白都能与VP2相互作用，包括细胞骨架相关蛋白、酶相关蛋白和细胞调节相关蛋白。据报道，这些蛋白质中的大多数对某些病毒起受体作用[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．然而，是一种蛋白质还是多种蛋白质协同起受体作用还有待进一步研究。有报道显示HSC70可能在病毒感染中起重要作用[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

多种方法证实了HSC70与IBDV的相互作用。首先，使用针对HSC70的特异性抗体阻断DF-1细胞上的HSC70。用TCID法测定其对IBDV感染的抑制作用gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba测定，共聚焦显微镜和免疫印迹。结果表明，抗hsc70抗体能显著抑制病毒复制，降低病毒滴度。一项使用HSC70抑制剂(VER155008)的实验证实，该抑制剂破坏HSC70，导致DF-1细胞失去IBDV吸附能力。感染失败表明HSC70抑制剂(VER155008)具有良好的IBDV阻断作用。gydF4y2Ba

在本研究中，当抗HSC70抗体阻断HSC70时，IBDV颗粒的形成明显减少。用抗体预孵育导致病毒吸附能力丧失，严重影响病毒生命周期，导致病毒感染和复制急剧下降。蛋白表达、间接IFA和western blot分析表明，抗HSC70抗体提前阻断了病毒与靶细胞上HSC70的相互作用，降低了病毒与靶细胞的结合能力，降低了病毒感染靶细胞的能力。gydF4y2Ba

VER-155008是一种腺苷衍生物，具有ATP类似物的特征，对HSP70家族具有与ATP相似的强亲和力和活性。因此，VER-155008可作为竞争性抑制剂使用[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。一些研究人员发现，在卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染中，HSP70亚型在复制中起着关键作用;当使用抑制剂VER-155008时，宿主细胞的病毒感染性急剧下降[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．Autographacalifornica核型多角体病毒对草粘虫具有很强的传染性，Lyupina等研究表明该病毒的传染性与HSC70有关。此外，早期添加VER-155008时，病毒蛋白合成、复制、基因组和颗粒释放受到严重抑制[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．有学者发现HSP70在登革病毒感染和复制中发挥重要作用，当靶细胞被抑制剂预孵育时，病毒的侵袭能力下降[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．er -155008是一种特异性抑制剂，一般用于HSC70竞争抑制试验，可阻止HSC70的atp酶结构域催化水解，导致HSC70蛋白构象改变，使IBDV无法正常识别HSC70，干扰IBDV与HSC70受体蛋白的特异性结合;这阻碍了病毒的感染和复制。此外，VER155008以剂量依赖的方式抑制了DF-1细胞的病毒感染。当药物浓度从0.005 μM增加10倍至5 μM时，抑制作用逐渐增强。在5 μM时，CPE、病毒滴度和VP2蛋白表达均不能检测到病毒复制和感染。总的来说，观察到明显的抑制作用。gydF4y2Ba

除HSC70外，表中其他蛋白gydF4y2Ba1gydF4y2Ba可能在病毒感染中起一定作用。据报道，人巨细胞病毒通过刺激丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的活性介导和增强宿主细胞的感染[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．猴空泡病毒(SV 40)可通过激活磷酸肌醇磷脂酶C来感染宿主细胞。如果磷酸肌醇磷脂酶C被阻断，病毒感染就会被抑制[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．基孔肯雅病毒是一种蚊子传播的病毒，它与昆虫细胞上的ATP合酶亚单位β结合，然后进入细胞，导致成功感染[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．当人工干扰减少细胞表面的波形蛋白时，肠道病毒71对细胞的侵袭性显著降低。因此，认为波形蛋白是一种重要的吸附因子[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．然而，这些蛋白在病毒感染中的作用还有待进一步研究。gydF4y2Ba

据我们所知，这项研究首次证明了HSC70可以与IBDV VP2蛋白相互作用并促进感染。这些关于HSC70与IBDV相互作用的知识将有助于更好地理解IBDV的发病机制。gydF4y2Ba

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。gydF4y2Ba

雨:gydF4y2Ba

乙腈gydF4y2Ba

BSA:gydF4y2Ba

牛血清白蛋白gydF4y2Ba

CPE:gydF4y2Ba

细胞病理效应gydF4y2Ba

DMEM:gydF4y2Ba

杜尔贝科改良的鹰牌中号gydF4y2Ba

德勤:gydF4y2Ba

DL-DithiothreitolgydF4y2Ba

费尔南多-阿隆索:gydF4y2Ba

甲酸gydF4y2Ba

的边后卫:gydF4y2Ba

胎牛血清gydF4y2Ba

FITC:gydF4y2Ba

fluoresceine异硫氰酸酯gydF4y2Ba

GRP78:gydF4y2Ba

葡萄糖调节蛋白78gydF4y2Ba

HSC70:gydF4y2Ba

热休克同源70gydF4y2Ba

HSP70:gydF4y2Ba

热休克蛋白70gydF4y2Ba

HSV:gydF4y2Ba

单纯疱疹病毒gydF4y2Ba

国际宇航科学院:gydF4y2Ba

碘乙酰胺gydF4y2Ba

IBDV:gydF4y2Ba

传染性法氏囊病病毒gydF4y2Ba

IFA:gydF4y2Ba

免疫荧光分析gydF4y2Ba

我:gydF4y2Ba

感染多重性gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸盐gydF4y2Ba

NP-40:gydF4y2Ba

诺乃清洁剂P40gydF4y2Ba

SDS:gydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠gydF4y2Ba

sds - page:gydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳gydF4y2Ba

TCID50:gydF4y2Ba

50%组织培养感染剂量gydF4y2Ba

组织:gydF4y2Ba

三氟乙酸gydF4y2Ba

VOPBA:gydF4y2Ba

病毒覆盖蛋白结合试验gydF4y2Ba

感谢包延庆医生帮助我们进行组织培养。gydF4y2Ba

本研究由中华人民共和国科技部资助(批准号:2016YFD0500803, 2017YFD0500702)。这些资金用于购买材料、样本收集、研究用品、数据分析和出版费用。江苏省高等学校学术发展重点项目资金用于研究所需的助学金和设备平台。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 扬州大学禽预防医学教育部重点实验室，江苏扬州225009gydF4y2Ba

   陈春波，秦颖，钱坤，邵红霞，叶建强，秦爱健gydF4y2Ba

2. 江苏省重大动物传染病与人畜共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009gydF4y2Ba

   陈春波，秦颖，钱坤，邵红霞，叶建强，秦爱健gydF4y2Ba

3. 扬州大学农业与农产品安全教育部国际联合研究实验室，江苏扬州225009gydF4y2Ba

   钱坤，邵红霞，叶建强，秦爱健gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

陈春波、秦胤进行了所有实验并起草了手稿。钱坤、邵红霞、叶建强对结果进行了分析讨论，并对手稿进行了实质性修改。秦爱健设计了研究，分析了结果，并起草了手稿。所有的作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaJianqiang你们gydF4y2Ba或gydF4y2Ba爱建秦gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。这项研究没有使用动物或人类样本。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

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