抗体的相对中和能力表明，人巨细胞病毒进入上皮细胞和内皮细胞的保守性和机制差异

巨细胞病毒(CMV)进入不同细胞类型的抗体中和是开发疫苗和免疫疗法的关键考虑因素。CMV进入成纤维细胞与进入上皮细胞或内皮细胞有显著不同:成纤维细胞的进入由gB和gH/gL/gO介导，而上皮细胞和内皮细胞的进入都需要一个额外的由gH/gL/UL128/UL130/UL131A组成的五聚体复合体(PC)。因为在cmv血清阳性的人血清中pc特异性抗体不影响成纤维细胞的进入，但有效地阻止进入上皮细胞或内皮细胞，当以上皮细胞为靶点时，观察到cmv阳性血清的中和能力明显高于以成纤维细胞为靶点时。某些血清在使用上皮细胞和内皮细胞测量的中和效力之间表现出类似的不一致性(Gerna G. et al.J Gen Virol, 89:853-865, 2008)，这表明上皮细胞和内皮细胞进入之间也可能存在额外的机制差异。为了进一步探索这一问题，同时测定了使用上皮细胞和内皮细胞对8种cmv阳性人类血清、cmv高免疫球蛋白和一组针对gB、gH、gH/gL或PC中特定表位的单克隆抗体或抗肽抗体的中和效力。表位特异性抗体、cmv -高免疫球蛋白或8种人血清中的7种的上皮和内皮中和能力之间没有观察到显著差异。然而，一种人血清在中和进入上皮细胞的能力上比内皮细胞高6倍。这些结果表明，表位对于上皮细胞的进入是重要的，但对于内皮细胞的进入则不那么重要，或者可能是可有可无的。在开发单克隆抗体疗法或代表有限表位的亚单位疫苗时，应考虑到它们的存在。

巨细胞病毒(CMV)是子宫内感染的新生儿出生缺陷以及移植和艾滋病患者发病和死亡的重要原因。针对体液反应的治疗性单克隆抗体和预防性疫苗正在开发中。体外中和巨细胞病毒进入的抗体一直是研究的重点。然而，由于CMV的进入机制复杂且在不同的细胞类型之间存在差异，因此尚不确定哪些病毒抗原可以引发疫苗接种的保护性体液反应，哪些病毒抗原可以为被动免疫治疗提供有效的靶点。

最初的病毒粒子/细胞附着被认为是通过细胞表面的糖胺聚糖与病毒粒子包膜上的病毒糖蛋白M和N的二聚复合物(gM/gN)之间的相互作用发生的[1］．随后的融合和进入步骤取决于细胞类型。在成纤维细胞中，融合发生在质膜上，并由融合糖蛋白B (gB)和由糖蛋白H、L和O组成的三聚体复合物(gH/gL/gO)之间的相互作用介导。相比之下，进入上皮细胞、内皮细胞和某些髓系细胞涉及内吞作用，随后是内体酸化，除了gB和gH/gL/gO外，还需要由gH/gL + UL128、UL130和UL131A组成的五聚体复合体(PC) [2，3.，4，5］．因此，针对gM/gN、gB、gH/gL和gO中的表位的抗体可以中和CMV进入各种细胞类型，但由于PC对于成纤维细胞的进入是可有可无的，因此针对PC特异性表位的抗体(即涉及UL128、UL130或UL131A)对成纤维细胞的进入没有中和活性[6，7］．由于尚不清楚的原因，pc特异性抗体通常中和上皮细胞或内皮细胞的进入，其效力比靶向其他复合物的抗体高2至3个对数[6，7］．在免疫抑制或先天性感染的个体中，pc特异性抗体与更广泛中和但通常效力较低的抗体在预防cmv相关疾病方面的相对重要性尚不清楚。

因此，目前大多数关注CMV体液免疫的研究都使用基于成纤维细胞和上皮细胞的体外实验来量化CMV的中和作用。基于内皮细胞的检测越来越不常见，这可能是由于假设CMV通过相似或相同的机制进入上皮细胞和内皮细胞[3.］．因此，抗体有望以相似的效力中和上皮细胞和内皮细胞的进入。然而，在实体器官移植后CMV再激活的患者中，用上皮细胞和内皮细胞测量的中和滴度差异高达16倍，而在患有原发性CMV感染的孕妇中观察到的差异为2倍或更少[8］．这些结果表明，尽管PC是CMV有效进入两种细胞类型所必需的，但上皮细胞和内皮细胞进入的机制可能存在差异。这种差异可能表现为对针对特定表位的抗体的不一致敏感性(即，中和进入一种细胞类型而不是另一种细胞类型的抗体，或表现出显著的效力差异)。因此，如果这种表位在体液反应中占主导地位，某些抗血清的显著滴度差异可能会出现。

为了确定人类CMV阳性血清中和CMV进入上皮细胞和内皮细胞的能力是否存在定性或定量不一致性，以绿色荧光蛋白(GFP)为基础的定量中和试验如前所述，进行了微小的修改[9，10］．gfp标记的CMV UxcAp66 [10由于其能够以相似的效率进入人类上皮细胞和内皮细胞(Qi等人，未发表的观察结果)。如前所述，从健康成人中获得人血清，用gB-ELISA法筛查CMV血清阳性[11］．cmv阳性血清在细胞培养基中连续稀释，与等量含病毒的接种体混合，在37°C下孵育1小时，然后复制等份三份转移到含有融合ARPE-19上皮细胞(ATCC CRL-2302)或人主动脉内皮细胞(HAEC，董宇赠送)的黑壁、清底96孔板孔中。孵育3-7天后，使用尼康diapho300紫外显微镜拍摄代表性图像，并使用Biotek Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader测量每孔GFP的相对荧光单位₅₀)值的确定使用Prism 5 (GraphPad Software, Inc.)作为四参数曲线的拐点，拟合到平均相对荧光单位(来自三个孔)与Log(抗体浓度)的图，如前所述[12］．

8个供体血清中有5个检测到基于上皮和内皮的中和曲线紧密匹配或重叠(图2)。1)．两种血清(#3和#5)对上皮细胞的效力略高于内皮细胞，但对IC的效力有倍性差异₅₀值(两倍或更少)无统计学意义(表1，p> 0.14，双尾t检验)。相比之下，供体血清#4的中和曲线明显分离(图4)。1)， IC差异为5.75倍，具有极显著性₅₀(表1，p< 0.03，双尾t检验)。

这些结果表明，供体4号的血清含有针对独特表位的抗体，这些表位对进入上皮细胞至关重要，但对进入内皮细胞不那么重要或可能可有可无。因此，我们使用相同的试验来确定一组表位特异性单克隆抗体(mAbs)和抗肽兔抗血清以及高免疫球蛋白(HIG)的上皮和内皮基础的中和能力，高免疫球蛋白是一种从cmv阳性供体纯化的人IgG的商业制剂(CytoGam®，CSL Behring，普鲁士国王，PA)(表2)1)．该小组包括:(i) 11个CMV中和单克隆抗体，靶向gH, gH/gL或PC，这些单克隆抗体是从用基于CMV株AD169的实验性全病毒疫苗免疫的兔子中分离出来的[7，10，13];(ii)两种多克隆兔抗血清，抗17-20个氨基酸长合成肽，代表UL130或UL131A序列[5，12];(iii)识别PC的2-25和TRL310两种人单抗[13，14]和(iv))一种人单抗TRL345，可识别gB中的AD-2表位[14，15)(表1)．

定性不一致未观察到和IC₅₀上皮细胞中和和内皮细胞中和的差异小于2倍(图2)。2和表1)．当用逻辑回归比较中和IC₅₀所有抗体和检测血清的值，两种细胞类型之间观察到高度相关(r = 0.98)，尽管包括异常值血清#4(图4)。3.)．

在发现巨细胞病毒通过不同于进入成纤维细胞的机制进入上皮细胞和内皮细胞之前，几乎所有中和试验都利用成纤维细胞。PC是上皮细胞/内皮细胞进入所必需的，而不是成纤维细胞进入所必需的，这一发现促使研究确定中和抗体的效力是否受到细胞类型的显著影响。来自自然感染的人类受试者的血清被发现在中和进入内皮细胞和上皮细胞方面比进入成纤维细胞更有效[8，16，17，18]，通过吸附研究，中和活性的额外上皮特异性成分归因于PC特异性抗体[19，20.］．重要的是，观察到功效不佳的候选疫苗在诱导上皮细胞特异性中和反应方面的免疫原性较差，这表明可能通过增加上皮细胞特异性中和反应来提高疗效[16］．

上皮细胞和成纤维细胞特异性中和活性的测量已成为描述候选CMV疫苗或免疫疗法的免疫原性的标准。然而，就像完全依赖成纤维细胞掩盖和延迟了上皮特异性中和抗体的发现，并且不能充分表征候选疫苗的免疫原性一样，仅使用上皮细胞来测量中和活性可能存在类似的风险。因此，上皮细胞和内皮细胞进入之间未被重视和潜在的微妙差异可能导致针对某些表位的抗体在进入一种细胞类型时比另一种表现出更强的效力。虽然这种差异可能不容易在针对广泛中和表位的多克隆反应中观察到，但更集中的反应，如亚单位疫苗诱导的反应，可能会诱导在使用上皮细胞测量时很强烈，但在使用内皮细胞测量时很温和的中和反应，反之亦然。

Gerna等人报道的数据首次提出上皮细胞和内皮细胞进入之间可能存在这种差异，该数据的半定量分析(准确度约为两倍)表明，来自5名实体器官移植后CMV再激活患者的系列血清中，上皮细胞和内皮细胞的中和能力差异为2 - 8倍(一种血清为16倍)[8］．虽然这些结果被注意到，但它们关于上皮细胞和内皮细胞进入的潜在机制差异的含义没有被讨论。为了证实和扩展这些报道的观察结果，我们使用高度可比性、客观和定量的方法检测了来自健康、自然感染的人类受试者血清的上皮和内皮中和能力。虽然8种人血清中有6种的中和曲线几乎是重叠的，但其中一种血清显示上皮IC比内皮IC高两倍₅₀而第二种血清则表现出6倍的统计学差异。

鉴定可能导致这种效力差异的特定表位的努力并没有揭示表位特异性抗体组内的显著不一致性，总的来说，逻辑回归分析显示两种中和活性之间高度相关。然而，该抗体组可能仅代表介导上皮和/或内皮细胞进入中和的所有表位的有限子集。虽然小组中的抗体可以识别多达6个独特的pc特异性表位，但只有一个gB抗体被包括在内，尽管另外7个单克隆抗体靶向gH或gH/gL中的表位，结合干扰试验表明，这7个抗体可能仅靶向2个独特的表位[13］．此外，该小组缺乏代表其他CMV进入介质表位的抗体，如gM, gN和gO，这些是中和抗体的已知靶点[21，22］．

尽管如此，我们发现八分之一的人类血清在血清中和效力方面表现出显著差异，这证实并扩展了Gerna等人报道的结果。[8]，这些发现表明存在具有不同中和活性的抗体，并且在某些受试者中，此类抗体靶向的表位可构成中和反应库的重要组成部分。还需要进一步的研究来确定差异中和活性在不同受试者人群中的流行程度，通过吸附实验确定相关的病毒蛋白，并通过分析更多样化的抗体组来确定介导差异中和的特定表位。

这些发现支持使用标准细胞类型(如ARPE-19细胞)来捕获对pc介导的CMV进入的中和活性，并表明基于ARPE-19细胞的检测可能适用于大多数自然史研究。尽管表位可能对内皮细胞的进入不重要，但对上皮细胞的进入可能涉及或至关重要。在开发单克隆抗体疗法或代表有限表位库的亚单位疫苗时，应考虑这种表位的潜在存在。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

巨细胞病毒:

巨细胞病毒

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

gB:

糖蛋白B

“大酒店”:

糖蛋白H

gL:

糖蛋白L

通用汽车:

糖蛋白米

gN:

糖蛋白N

走:

糖蛋白O

高:

Hyperimmuneglobulin

集成电路₅₀：

50%抑制浓度

马伯:

单克隆抗体

PC:

Pentameric复杂

作者感谢David Johnson的兔抗血清UL130和UL131A，以及Dong Yu的兔抗血清HAECs。

资金支持由美国国立卫生研究院(R01AI088750, R21AI073615和R01AI128912)和默克公司提供。进军,新泽西。美国。资助机构在研究设计、数据收集、分析、解释或撰写手稿方面没有任何作用。

作者及隶属关系

1. 中华人民共和国沈阳中国医科大学盛京医院病毒学实验室

   齐颖阮强

2. 弗吉尼亚联邦大学，弗吉尼亚州里士满，美国

   何莉，崔晓红，Michael A. McVoy

3. 儿童医院奥克兰研究所，奥克兰，加州，美国

   劳拉·赫特尔

4. 默克公司，西点，PA，美国

   丹尼尔·c·弗里德

5. 德克萨斯大学休斯顿健康科学中心，美国德克萨斯州休斯顿

   Tong-Ming傅

6. 格瑞斯生物科学有限责任公司，红木城，加州，美国

   劳伦斯·m·考瓦

贡献

YQ、LiH、XC、LaH、MM和QR构思并设计研究并分析数据，YQ、LiH和XC执行实验，DF、TF和LK提供关键试剂、见解和讨论，LiH准备手稿草稿，MM、LiH、QR、YQ和LaH开发最终手稿。所有作者对最终稿进行了审阅和/或提供了评论和更正。作者阅读并批准最终的手稿。

相应的作者

对应到Michael A. McVoy或羌族阮．

伦理批准并同意参与

弗吉尼亚联邦大学人类研究委员会批准了使用人类血清进行的研究。

发表同意书

所有作者同意发表。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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