异巴achalcone通过破坏病毒诱导的细胞间融合抑制伪狂犬病毒

伪狂犬病病毒(PRV)是威胁全球养猪业的重要病原体。目前，临床上还没有有效的药物可以预防或治疗PRV感染。异伐查尔酮(IBC)，一种天然查尔酮化合物补骨脂显示多种生物活性，如抗菌，抗真菌和抗癌活性。最近，人们发现IBC在体外对一种RNA病毒——猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)表现出抗病毒活性。在本研究中，我们首次进一步证明了IBC对PRV具有较强的抑制作用。通过病毒荧光素酶表达实验，我们发现抑制步骤主要发生在病毒复制的后期。最后，通过细胞间融合实验，我们证明了IBC通过阻断病毒介导的细胞融合来抑制PRV。因此，IBC可能是进一步治疗PRV体内感染的候选药物。

伪狂犬病病毒(PRV)是一种猪阿尔法疱疹病毒，可引起猪的奥耶斯基氏病[1，2］．PRV对养猪业构成严重威胁，特别是自2011年新型PRV变种开始出现以来[3.，4］．最重要的是，最近的研究报告指出，人类可被PRV感染[5，6，7]，显示PRV亦对人类构成潜在威胁[6］．因此，探索新型抗伪狂犬病毒制剂可能是控制伪狂犬病毒的有效手段。在本研究中，我们探讨了中药异巴achalcone (IBC)潜在的抗prv活性。IBC结构如图所示。1a. IBC首次分离自补骨脂于1968年推出，并拥有广泛的生物活性[8］．在最近的一项研究中，IBC还在病毒RNA合成的早期阶段表现出抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的活性[9］．为了探索IBC是否具有抗prv活性，我们首先根据制造商的说明，使用Cell Counting Kit-8 (CCK8, Dojindo Laboratories, Japan)评估了IBC对PK15细胞的细胞毒性。当IBC浓度达到25 μM时，细胞活力相对于对照细胞没有变化。接下来，我们通过表达增强绿色荧光蛋白(EGFP)和萤火虫荧光素酶的重组PRV报告病毒评估了IBC的抗病毒活性[10］．这些结果表明，与对照组相比，ibc处理组的EGFP表达和荧光素酶活性均显著降低(图2)。2a和b)，表明PRV复制被显著抑制。然而，PRV复制中受IBC影响的步骤尚不清楚。为了确定病毒生命周期中的哪些步骤受到影响，我们首先用IBC处理PK15细胞，2小时后用PRV报告病毒以MOI为0.01感染PK15细胞。在感染后12至48小时，IBC显著抑制PRV，而在感染后4和8小时，PRV复制不受影响。3.)．根据伪狂犬病毒一步生长曲线的结果，病毒滴度在感染后约14 h达到峰值，因此我们认为感染后4和8 h为早期。这种模式表明IBC在病毒生命周期的后期抑制PRV。此外，这些结果表明，IBC抑制PRV和PRRSV的机制可能不同，因为在我们之前的研究中，IBC在早期阶段就抑制了PRRSV [9］．PRV可以在生命周期的晚期诱导细胞间融合，这是病毒传播的一个非常重要的步骤。在这里，为了研究IBC是否在这一阶段抑制PRV复制，我们进行了基于瞬时转染的细胞间融合实验，如前所述[11，12］．简单地说，每个EGFP表达质粒转染200 ng的RK13细胞(pDC315-EGFP [13])或根据制造商说明使用Lipofectamine 2000对gB、gL和gH PRV糖蛋白进行表达质粒(在本研究中通过将这些基因亚克隆到pCAGGS-HA载体中构建)。6小时后，将细胞培养基更换为含或不含IBC的培养基，转染24 h后固定细胞，荧光显微镜下分析合胞体形成情况。与我们的假设一致，IBC显著抑制PRV糖蛋白诱导的细胞间融合(图2)。4a).为了排除IBC抑制gB表达导致细胞间融合的可能性，我们接下来用gB特异性单克隆抗体(1:200;gB单抗由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所田志军教授提供)。我们发现IBC处理后，gB的表达不受IBC的影响(图。4b).上述结果表明，IBC主要在生命周期后期的细胞-细胞融合阶段抑制PRV复制。为了进一步证实这一发现，我们评估了IBC对非包膜腺病毒的活性。如果IBC抑制腺病毒复制，它也可能在细胞与细胞融合之外的生命周期步骤中发挥抗病毒作用。表达egfp的腺病毒[13]感染HEK293细胞(MOI = 0.1)。24小时后，结果显示，在HEK293细胞中，腺病毒未被IBC抑制(图2)。4c)，进一步证实IBC在细胞-细胞融合步骤抑制PRV复制。在我们之前的研究中，我们证明了CRISPR/Cas9系统可能是抑制和消除PRV的强大工具[14，15］．然而，这种方法需要基因转移工具将CRISPR系统的组件引入细胞。因此，像IBC这样的抗病毒药物可能更适合于当前环境下的病毒控制。

IBC结构和细胞毒性评价。一个IBC的化学结构。bIBC对PK15细胞不同浓度IBC孵育24 h的细胞毒性。通过测定490 nm处的吸光度来评估细胞存活率

全尺寸图像

PRV复制被IBC抑制。用表达EGFP和荧光素酶的PRV感染PK15细胞(MOI = 0.1)。每小时24小时，用荧光显微镜分析PRV感染情况(一个)，并评估荧光素酶活性(b）

全尺寸图像

IBC阻断PRV生命周期的后期阶段。将PK15细胞感染PRV (MOI = 0.1)，并在含有乙醇或指定剂量IBC的培养基中培养。在指定的时间点评估荧光素酶活性

全尺寸图像

IBC在细胞间融合阶段抑制PRV复制。一个用gB、gH、gL和EGFP表达质粒转染RK13细胞，6小时后，将培养基替换为含有乙醇或指定剂量IBC的培养基。荧光显微镜分析细胞间融合。b在指定的IBC浓度下评估gB的表达。c腺病毒复制不受IBC的影响

全尺寸图像

总之，我们证明了IBC对PRV具有抗病毒活性，并证明IBC治疗显著阻断了PRV介导的细胞间融合。因此，IBC可能是进一步治疗猪PRV感染的候选药物。

不适用。

减压阀:

假狂犬病病毒

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

IBC:

Isobavachalcone

中医:

中医

PRRSV:

猪繁殖与呼吸综合征病毒

作者感谢刘思国博士(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)提供IBC。

本研究由国家重点研发计划项目(2016YFD0500100)和黑龙江省优秀青年基金项目(YQ2019C028)资助。

作者及隶属关系

1. 东北农业大学动物医学院，哈尔滨150001

   王宇，魏平

2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨150001

   王宇，刘天鑫，王同云，唐艳东

贡献

y.w.， T.X.L.和T.Y.W.进行了实验。y.d.t.和P.W.设计了实验，分析了数据，并撰写了手稿。作者们阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Yan-Dong唐或萍魏．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。

转载及权限