猪传染性胃肠炎病毒通过非结构蛋白3抑制NF-κB活性逃避宿主免疫系统

背景

传染性胃肠炎病毒(TGEV)，家族成员之一Coronaviridae引起仔猪致命的水样腹泻。以往的研究表明，冠状病毒通过抑制核因子κB (NF-κB)信号通路，发展出多种策略来逃避宿主的先天免疫。然而，TGEV通过调节NF-κB信号通路抑制宿主先天免疫反应的能力尚不清楚。

方法

本研究采用双荧光素酶报告实验证实了TGEV感染对NF-κB的抑制作用，并确定了参与NF-κB信号通路抑制的主要病毒蛋白。采用Real-time quantitative PCR定量炎性因子mRNA表达。western blotting分析Nsp3结构域的去泛素化及其对IκBα和p65的影响。免疫沉淀法检测IκBα的泛素化水平。

结果

在ST和IPEC-J2细胞中，TGEV表现出剂量依赖性的NF-κB活性抑制。单个TGEV蛋白筛选显示，非结构蛋白3 (non-structural protein 3, Nsp3)具有很强的抑制NF-κB信号通路的潜能，并导致NF-κB诱导的细胞因子产生下调。我们证实Nsp3的抑制作用主要是通过抑制IκBα降解以及抑制p65磷酸化和核易位介导的。此外，Nsp3 590 - 1215位氨基酸残基通过抑制IκBα泛素化来抑制IκBα的降解。

结论

TGEV感染可抑制NF-κB信号通路的激活，该通路主要由Nsp3通过典型通路介导。Nsp3中590 - 1215位的氨基酸残基组成了介导NF-κB抑制的关键结构域。我们推测这种抑制作用可能与Nsp3中590 - 1215位氨基酸残基的去泛素化酶活性有关。本研究为进一步了解tgev介导的先天性免疫调节机制奠定了基础，为进一步研究冠状病毒发病机制奠定了基础。

传染性胃肠炎(TGE)是由传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的猪急性肠道疾病。感染了TGEV的猪通常会出现呕吐、脱水和严重腹泻等症状。在2周龄以下的仔猪中，TGEV感染的死亡率高达100% [1，2］．在全球范围内，TGE给养猪业造成了巨大的经济损失。TGEV最早于1946年在美国被确认为猪TGE的病原剂[3.］．TGEV是一种包膜阳性单链RNA病毒，基因组大小约28.6 kb。病毒属于家族Coronaviridae以Nidovirales目[4］．病毒基因组包括5 ' -非翻译区(UTR)、至少9个开放阅读框和3 ' -UTR [4］．ORF1由ORF1a和ORF1b两个orf组成，分别编码pp1a和pp1ab多蛋白。多蛋白被病毒编码的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PL pro)和3c样蛋白酶(3CL pro)裂解成16个非结构蛋白(Nsp1-Nsp16)。这些非结构蛋白在病毒生命周期中具有多种功能[5］．

宿主的先天免疫反应是抵御病毒感染的第一道防线。各种转录因子，如干扰素(IFN)调节因子3 (IRF3)、核因子-κB (NF-κB)和活化转录因子2 (ATF-2)在免疫应答中被激活[6，7，8］．在这些转录因子中，NF-κB是促炎和抗病毒反应的关键调控因子。NF-κB家族由五个成员组成:p65/RelA, RelB, cRel, p50和p52。这些转录因子共享一个n端dna结合/二聚结构域，这被称为Rel同源结构域。该结构域在同源二聚体和异源二聚体的形成中起着至关重要的作用。NF-κB二聚体可与多种称为κB位点的靶DNA序列结合并调节基因表达[9］．NF-κB活化的典型通路已被广泛研究。细胞表面的病原体模式识别受体识别各种促炎细胞因子和病原体分子，导致IκB激酶(IKK)复合物的激活，这是由IKKβ亚基介导的。磷酸化的IKKβ亚基在Ser32和Ser36残基磷酸化抑制因子IκB(主要是IκBα)的氨基端。随后，抑制因子IκB被泛素化，并被蛋白水解酶靶向用于蛋白质降解。IκB的降解暴露出核定位信号(NLS)，从而促进NF-κB转位到核内。核内NF-κB促进几种趋化因子、细胞因子和粘附因子的转录[9，10］．

已知许多病毒，如小鼠肝炎病毒(MHV)、猪生殖呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和新城疫病病毒(NDV)，通过NF-κB激活激活宿主先天免疫反应[11，12，13，14］．然而，病毒颗粒仍可能在体内复制并引起疾病。这表明病毒通过多种策略抑制NF-κB信号通路来逃避宿主的免疫反应。Orf病毒(ORFV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和人冠状病毒OC43 (HCoV-OC43)可以通过抑制NF-κB激活来逃避抗病毒先天免疫[15，16，17，18］．此外，一些病毒，如猪流行性腹泻病毒(PEDV)，在调节NF-κB信号通路中具有双重作用[19，20.］．由于PEDV和TGEV都属于属Alphacoronavirus家庭内部Coronaviridae，我们探讨了TGEV对NF-κB信号通路的影响是否与PEDV类似。我们前期实验结果表明，TGEV感染可通过NF-κB信号通路激活NF-κB，诱导促炎细胞因子的产生[21]，结果与其他研究的结果一致[22］．然而，TGEV是否对NF-κB信号通路有抑制作用尚不清楚。

在本研究中，我们证明了TGEV感染对肠上皮细胞株J2 (IPEC-J2)和猪睾丸(ST)细胞NF-κB信号通路具有剂量依赖性抑制作用。此外，我们还证实了Nsp3是通过典型通路调控NF-κB信号通路和抑制NF-κB诱导的细胞因子产生的关键病毒蛋白。Nsp3中590 - 1215位的氨基酸通过抑制IκBα泛素化以及p65的磷酸化和核转位在抑制NF-κB信号通路中起关键作用。这些效应似乎与木瓜蛋白酶2 (PLP2)有关，它位于氨基酸606和901位之间。我们的发现为了解冠状病毒的发病机制提供了有益的见解。

病毒细胞和试剂

本实验室获得肠上皮细胞株J2 (IPEC-J2)和HEK-293 T。猪睾丸(ST)细胞来自美国类型培养集(ATCC, CRL-1746)。ST细胞和IPEC-J2细胞培养于Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM) (Gibco, 12491015, USA)中，添加10%胎牛血清(FBS) (Gibco, 10099141, USA)， 37℃，5% CO₂．TGEV TH-98株是从黑龙江省TGEV感染仔猪肠道中分离得到的(GenBank登录号:KU729220)。采用50%组织培养感染剂量(TCID 50)法测定病毒滴度。小鼠抗β-肌动蛋白和小鼠抗血凝素单克隆抗体(mAbs)购自Sigma (A1978, H7411，美国)，抗p65和IκBα小鼠单克隆抗体和抗phospho-NF-κB p65兔单克隆抗体(分别为6956 T, 4814 T, 3033 T)购自Cell Signaling Technology(美国)。合成的双链RNA, polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C))由Sigma (P9582, USA)提供。按照制造商的说明，使用cell Counting Kit-8进行细胞活力测定(生工生物技术，E606335-0100，中国)。

质粒

真核表达载体pCMV-HA和pCMV-Myc购自日本Clontech(分别为635690和635689)。NF-κB荧光素酶报告质粒pNF-κB- luc由百时生物科技(D2206，中国)提供。内参基因报告质粒pRL-TK由Promega公司(E2241, USA)提供。本研究使用的泛素蛋白(Ub)、tgev编码蛋白和Nsp3片段的真核表达质粒在实验室构建。所用引物见表1．

转染及报告基因检测

在TGEV感染研究中，将ST或IPEC-J2细胞种在24孔细胞培养板中。当细胞融合度达到70 ~ 80%时，分别转染pNF-κB-luc (0.5 μg)和参考质粒pRL-TK (0.025 μg)。12 h后，用聚(I:C) (10 μg/mL)或无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理细胞。24 h后，用TGEV感染细胞。感染细胞在感染后12、24、36 h裂解。萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶活性使用双荧光素酶报告检测系统(Promega, USA)测定，遵循制造商说明。在TGEV基因转染研究中，将HEK-293 T或IPEC-J2细胞种在24孔细胞培养板中。当细胞融合度达到70-80%时，将pNF-κB-luc、参比质粒pRL-TK和含有TGEV基因的pCMV-HA表达质粒或空pCMV-HA质粒共转染细胞。24 h后，分别用poly(I:C) (10 μg/mL)或无菌PBS孵育12 h，收集细胞进行双荧光素酶活性分析。所有的值都用Renilla荧光素酶活性作为一个内部控制，并表示在折叠变化。数据以三个独立实验的均数±标准差表示。

RNA提取及实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)

按照制造商的说明(Fastagen, 220010)，用PBS清洗细胞，使用RNA快速提取试剂盒提取细胞总RNA。使用随机引物和M-MLV逆转录酶(639574,TaKaRa, Japan)将总RNA逆转录为cDNA。cDNA被用作SYBR Green PCR的模板(Roche, Germany)。以β-肌动蛋白作为内对照，对每个样品中单个mRNA转录本的丰度进行三次测定。ABI PRISM 7500 Real-Time PCR系统检测反应过程中荧光信号的变化。按2计算白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF -α)相对转录水平^−ΔΔCt阈值方法。引物列于表中2．

Western blot分析和免疫共沉淀

用冰冷的PBS清洗细胞，用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma, P8340，美国)的细胞裂解缓冲液(Beyotime, P0013G，中国)处理细胞。核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒(Beyotime, P0027，中国)按照制造商的说明进行分离。细胞在冰上溶解30分钟，离心去除细胞碎片。使用双辛酸(BCA)蛋白测定试剂盒(Beyotime, P0011，中国)定量裂解液中的蛋白质浓度。将蛋白样品与5X十二烷基硫酸钠(SDS)加载缓冲液混合，煮沸10分钟。采用SDS - polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)和western blotting检测TGEV总p65、细胞质IκBα、细胞质p-p65和核p65的表达。β-肌动蛋白为加载对照。

共免疫沉淀实验中，IPEC-J2和HEK-293 T细胞在100 mm培养皿中培养，并用pCMV-Myc-Nsp3 (590-1215 aa)和pCMV-HA-Ub转染24 h。然后用10 μg/mL poly(I:C)处理细胞12 h。收集细胞并用细胞裂解缓冲液进行免疫沉淀测定。取细胞前4小时，将MG132 (25 mM)加入培养基中。样品在摇板器上4°C孵育30分钟。将上清液转移到新鲜试管中，与琼脂糖珠包被的对照IgG抗体在4℃下孵育2 h。样品与琼脂糖珠包被的Myc单克隆抗体在4°C下孵育2小时。混合物在1000rpm和4°C下离心1分钟。PBS洗涤5次，HA单克隆抗体western blotting分析。

统计分析

所有实验至少重复三次。采用GraphPad Prism软件(5.0版)对实验数据进行双向重复测量方差分析(RM-ANOVA)。P-值小于0.05为有统计学意义，小于0.01为极显著。

TGEV复制抑制NF-κB信号通路

Poly(I:C)是双链RNA (dsRNA)的合成类似物，可被toll样受体3 (TLR3)识别。Poly(I:C)激活NF-κB信号通路，诱导细胞因子产生[23］．以聚(I:C)处理IPEC-J2细胞12 h后接种TGEV，评价聚(I:C)对TGEV的抗病毒作用。RT-PCR分析显示，poly(I:C)可以显著降低TGEV RNA复制，而对细胞活力的影响很小(图2)。1a).虽然poly(I:C)抑制了TGEV在细胞中的复制，但不能完全灭活病毒。因此，我们推测TGEV可能通过抑制poly(I:C)激活的NF-κB通路来逃避宿主免疫系统。我们将pNF-κB- luc报告质粒共转染ST和IPEC-J2细胞，以评估TGEV复制对NF-κB信号通路的影响。pRL-TK质粒作为内参。转染12 h后，用poly(I:C)处理细胞，诱导NF-κB信号通路激活。转染24 h后，TGEV感染细胞，感染倍数(MOI)为1。在不同时间点采集感染细胞进行双荧光素酶活性分析。我们观察到，与模拟对照组相比，poly(I:C)处理组表现出NF-κB信号通路的显著激活。然而，TGEV感染导致NF-κB信号激活的时间依赖性抑制(图。1b).转染的ST和IPEC-J2细胞经poly(I:C)处理后，以不同MOIs感染TGEV，评价病毒感染滴度对NF-κB信号通路抑制的影响。如图所示。1与对照组相比，poly(I: c)处理组NF-κB信号通路明显激活。TGEV感染导致NF-κB通路激活显著的剂量依赖性抑制。

TGEV Nsp3过表达抑制NF-κB信号通路

通过将编码TGEV蛋白的质粒转染HEK-293 T和IPEC-J2细胞，评估TGEV关键蛋白在抑制NF-κB信号通路中的作用。使用荧光素酶报告试验系统评估NF-κB信号通路的抑制作用。荧光素酶报告基因分析表明，除Nsp2外，所有TGEV蛋白均不同程度地抑制NF-κB信号通路。此外，Nsp1和Nsp3是NF-κB信号通路最有效的抑制剂(图2)。2a).通过增加Nsp3表达质粒转染IPEC-J2和HEK-293 T细胞，评估Nsp3对宿主细胞NF-κB信号通路的抑制程度。我们观察到Nsp3可以剂量依赖性地抑制NF-κB信号通路的激活(图。2b).上述结果表明，Nsp3在TGEV感染过程中NF-κB信号通路的抑制中起重要作用。

Nsp3可抑制IκBα降解，并抑制p65核转位和磷酸化

NF-κB活化的特征是IκBα的降解以及p65的磷酸化和核转位[24］．因此，研究Nsp3对IκBα和p65的影响具有重要意义。HEK-293 T;3.a)和IPEC-J2(图;3.b)用不同滴度的Nsp3或空载体转染细胞。此外，用poly(I:C)处理转染细胞以激活NF-κB。提取细胞核蛋白和细胞质蛋白，western blotting检测p65、IκBα和p-p65的表达水平。Western blotting分析显示，随着nsp3表达质粒剂量的增加，IκBα表达逐渐升高。此外，我们观察到Nsp3对p65的总量没有显著贡献。然而，磷酸化和核性p65水平随着Nsp3水平的升高而降低。这些数据表明，Nsp3可抑制IκBα的降解以及p65的磷酸化和核转位。

Nsp3对NF-κ b调控细胞因子表达的影响

接下来，我们研究了TGEV Nsp3是否抑制NF-κ b介导的细胞因子的产生。用表达nsp3的质粒或pCMV-HA载体转染HEK-293 T和IPEC-J2细胞。转染后24 h，用poly(I:C)处理细胞诱导NF-κB信号通路激活。处理后12 h, RT-PCR检测细胞中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、β-actin mRNA水平。与poly(I:C)治疗组相比，nsp3转染组IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平较低(图。3.b).上述结果表明，Nsp3通过抑制HEK-293 T中NF-κB信号通路抑制NF-κB调控的细胞因子基因表达(图2)。4a)和IPEC-J2(图;4b)细胞。

Nsp3中590 - 1215位氨基酸残基对NF-κB信号通路的抑制作用最强

利用截断Nsp3的表达载体检测了TGEV Nsp3参与NF-κB信号通路抑制的关键功能域。根据TGEV Nsp3的结构构建截断的表达载体，通过在线程序SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)．用截断的Nsp3和pNF-κB-Luc报告质粒共转染IPEC-J2和HEK-293 T细胞。在转录后24小时用poly(I:C)处理细胞。此外，荧光素酶活性和基因表达在细胞被量化。荧光素酶活性分析显示，Nsp3 (1-418 aa)和Nsp3 (590 - 1215 aa)可抑制IPEC-J2和HEK-293 T细胞NF-κB信号通路的激活(图2)。5此外，RT-PCR分析显示，转染Nsp3 (1-418 aa)和Nsp3 (590-1215 aa)质粒后，NF-κ b相关细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α)的mRNA水平下调(图。5b).特别是，与其他Nsp3截断表达载体(1-418 aa)转染的细胞相比，Nsp3 (590-1215 aa)转染的细胞表现出NF-κB信号通路和NF-κB调控细胞因子表达的显著减弱。通过将pNF-κB- luc报告质粒和不同剂量的Nsp3 (590 - 1215 aa)真核表达质粒共转染HEK-293 T和IPEC-J2细胞，研究Nsp3 (590 - 1215 aa)表达对NF-κB信号通路抑制的影响。Nsp3 (590-1215 aa)转染的细胞对NF-κB活化表现出剂量依赖性抑制(图。5c)。

Nsp3 (590 - 1215 aa)通过抑制IκBα降解和抑制p65的磷酸化和核转位来抑制NF-κB信号通路

利用Nsp3 (590 - 1215 aa)真核表达重组质粒共转染的HEK-293 T和IPEC-J2细胞，研究Nsp3 (590 - 1215 aa)转染对NF-κB信号通路中关键蛋白IκBα和p65表达的影响。用poly(I:C)处理共转染的细胞，激活NF-κB通路。转染36 h后提取核蛋白和细胞质蛋白，western blotting检测p65、IκBα和p-p65的表达水平。我们观察到，随着两种HEK-293 T中Nsp3 (590 - 1215 aa)蛋白表达的增加，IκBα蛋白表达水平逐渐升高(图2)。6a)和IPEC-J2(图;6B)细胞，而不影响细胞内p65的总量。然而，随着Nsp3 (590 - 1215 aa)表达水平的升高，细胞质p-p65和核p65水平降低。这些结果表明，Nsp3 (590 - 1215 aa)剂量依赖性地抑制IκBα的降解以及p65的磷酸化和核转位。

Nsp3促进IκBα的去泛素化，Nsp3 (590 - 1215 aa)抑制IκBα的泛素化

通过将ha标记的泛素真核表达质粒和myc标记的Nsp3及其截断的基因片段共转染到IPEC-J2和HEK-293 T细胞中，评估了Nsp3抑制NF-κB信号通路的机制。蛋白泛素化水平用蛋白印迹法定量。结果表明，高表达Nsp3、Nsp3 (1-418 aa)、Nsp3 (590 - 1215 aa)均不同程度地降低了细胞蛋白的泛素化。此外，在HEK-293 T和IPEC-J2细胞中，Nsp3和Nsp3 (590 - 1215 aa)的去泛素化效果显著高于Nsp3 (1-418 aa)(图2)。7a).通过将Nsp3 (590 - 1215 aa)和pCMV-HA-Ub真核表达质粒转染IPEC-J2和HEK-293 T细胞，评估Nsp3 (590 - 1215 aa)转染对IκBα泛素化的影响。细胞提取物进行免疫共沉淀。如图所示。7b, Nsp3 (590 - 1215 aa)转染降低IκBα泛素化水平。这些结果表明，Nsp3可诱导去泛素化，Nsp3中590 ~ 1215位氨基酸可能通过降低IκBα的泛素化水平来抑制IκBα的降解，从而抑制NF-κB信号通路。

先天免疫反应是宿主抵御病毒感染的第一道防线，由多种信号通路调节。NF-κB信号通路在先天免疫反应调节网络中起着至关重要的作用，在病毒感染期间高度活跃。该途径激活编码几种细胞因子和趋化因子的基因的转录，这些基因与免疫反应有关[9］．多种病毒通过抑制NF-κB信号通路来逃避宿主的免疫反应。早期研究报道SARS-CoV和HCoV-OC43可损伤NF-κB活化[17，25］．类似地，已知MERS-CoV的orf4b编码的辅助蛋白(p4b)通过抑制NF-κB信号通路促进先天免疫逃避[18］．然而，关于TGEV感染后宿主细胞信号转导机制的研究尚不完整。

我们前期研究发现TGEV感染可激活ST和IPEC-J2细胞NF-κB信号通路[21］．在本研究中，我们使用poly(I:C)，一种合成的病毒双链RNA (dsRNA)类似物，通过激活NF-κB信号通路诱导先天免疫反应。该策略能够检测到tgev感染后NF-κB信号通路的抑制。我们的结果表明，TGEV感染抑制了ST和iec - j2细胞NF-κB活性，这种抑制作用可能与感染时间和接种滴度有关。

由于蛋白质是生物学功能的最终表演者，我们检测了在NF-κB信号通路抑制中发挥重要作用的TGEV蛋白。由于ST细胞转染效率较低，我们选择HEK-293 T和IPEC-J2细胞进行后续实验。双荧光素酶报告基因分析显示，除Nsp2外，所有TGEV蛋白均可不同程度抑制NF-κB通路。但Nsp1和Nsp3对NF-κB信号通路的抑制作用高于其他TGEV蛋白。此外，我们还探讨了nsp1介导的NF-κB通路抑制的潜在机制。不幸的是，Nsp1质粒在HEK-293 T和IPEC-J2细胞中的表达水平太低，无法完成我们的分析。因此，我们仅阐述TGEV Nsp3抑制NF-κB通路的作用机制。

多结构域Nsp3蛋白是冠状病毒基因组编码的最大蛋白质[26］．多项研究报道了冠状病毒Nsp3可抑制多种信号通路。MHV-A59的Nsp3可以使IRF 3失活，从而抑制I型IFN反应[27］．同样，PEDV Nsp3也被报道为NF-κB拮抗剂[20.］．据报道，SARS Nsp3与病毒或宿主细胞RNA结合，调节病毒复制并逃避受感染宿主细胞的免疫反应[28］．TGEV是典型的α型冠状病毒。然而，TGEV Nsp3在NF-κB信号通路调控中的作用尚不清楚。在本研究中，我们证实Nsp3可抑制NF-κB的活化，且抑制作用与Nsp3的表达水平呈正相关。

在大多数细胞中，NF-κB复合物是无活性的，主要存在于与抑制性IκB蛋白复合物的细胞质中[9］．信号通路激活后，IκB蛋白被降解，NF-κB二聚体进入细胞核调节靶基因的表达。NF-κB信号通路通过典型或非典型通路被激活，并依赖于IκB蛋白磷酸化诱导的泛素化[29］．在本研究中，我们研究了Nsp3转染HEK-293 T和IPEC-J2细胞中IκBα和p65的表达。我们观察到Nsp3可以剂量依赖性地抑制IκBα的降解，以及p65的磷酸化和核转位。因此，我们的数据表明，TGEV Nsp3可以通过典型通路抑制NF-κB信号通路。

NF-κB信号通路是调节促炎细胞因子表达的中心通路[30.］．先前的研究表明，NF-κB在启动炎性小体激活以产生细胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8)方面至关重要[31，32］．几种病毒蛋白通过NF-κB信号通路在炎症调节中发挥重要作用。HBV的HBeAg蛋白通过抑制NF-κB磷酸化抑制脂多糖诱导的NLRP3炎性小体激活和IL-1b的产生[33］．类似地，据报道BVDV感染可触发NF-κB信号转导并增强IL-8的转录，因为病毒感染后转录水平显著升高，并且据报道立即早期反应3 (IER3)也可抑制NF-κB活性并下调IL-8表达约65% [34］．我们的实验结果表明，Nsp3可以通过抑制NF-κB信号通路，下调IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的表达。这些结果表明Nsp3在tgev介导的NF-κB信号通路的抑制中起着至关重要的作用。

利用SMART数据库检测参与IκBα降解和p65磷酸化的Nsp3结构域，预测Nsp3可能的功能结构域。在不影响其原有功能域的情况下，将Nsp3截短为4个片段，并用双荧光素酶法筛选截短的基因。截断的两个基因片段Nsp3 (1-418 aa)和Nsp3 (590 - 1215 aa)对NF-κB信号通路的激活具有强烈的抑制作用，其中Nsp3 (590 - 1215 aa)的抑制作用显著高于Nsp3 (1-418 aa)。SMART数据库预测Nsp3 (1-418 aa)和Nsp3 (590 - 1215 aa)都含有PLPs(154-406和606-901 aa)。PLPs表现出去泛素化活性，从固有抗病毒途径的信号分子中去除泛素部分以抑制宿主固有免疫[26，35，36］．据报道，冠状病毒PLPs是先天性免疫反应的抑制因子。SARS-CoV PLP通过调控IRF3和NF-κB信号通路中重要信号蛋白的激活，抑制IFN诱导和NF-κB信号通路[37］．同样，HCoV-NL63利用PLPs通过抑制p53-IRF7-IFNβ信号通路来逃避宿主的先天抗病毒反应[38］．我们推测Nsp3可能利用PLP的去泛素化作用，通过抑制IκBα泛素化来抑制NF-κB信号通路。我们的研究结果表明，Nsp3(590 - 1215aa)在HEK-293 T和IPEC-J2细胞中具有明显的去泛素化活性，因此使用Nsp3(590 - 1215aa)来验证我们的假设。与我们的预期一致，Nsp3 590 - 1215位的氨基酸残基可以通过降低IκBα的泛素化水平来抑制其降解。这种现象可能与PLP2的去泛素化酶活性有关，PLP2存在于Nsp3氨基酸残基606-901中。

既往研究表明，TGEV感染可通过诱导IκBα的降解激活NF-κB信号通路，而IκBα的降解主要由泛素化引起[21，22，39］．上述结果表明，tgev感染细胞IκBα泛素化水平并未降低。因此，可以推测，在TGEV感染过程中，Nsp3诱导的IκBα去泛素化作用不能完全抑制NF-κB的激活。

TGEV感染可抑制ST和IPEC-J2细胞NF-κB信号通路的激活。此外，我们的研究结果表明，TGEV Nsp3通过典型通路抑制NF-κB信号通路。但Nsp3是否同时影响NF-κB信号通路和其他信号通路还有待进一步研究。Nsp3 590 ~ 1215位氨基酸残基通过抑制IκBα的泛素化抑制p65的磷酸化和核转位。我们推测，这可能是由于在Nsp3的590 - 1215位氨基酸残基位置存在一个具有去泛素化酶活性的PLP2结构域。我们的研究为更好地理解tgev介导的先天免疫调节机制提供了基础，为进一步研究冠状病毒的发病机制奠定了基础。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

3 clpro:

3 c蛋白酶

DMEM:

杜尔贝科改良的鹰牌中号

极:

双链RNA

的边后卫:

胎牛血清

干扰素:

干扰素

IKK:

我κB激酶

IL:

白介素

IPEC-J2:

肠上皮细胞系J2

IRF3:

干扰素调节因子3

我κB:

核因子κ b抑制剂

卢克:

荧光素酶报告基因

马伯:

单克隆抗体

我:

多重感染

NF -κB:

核因子B

规划:

非结构蛋白

子:

开放阅读框

PBS:

磷酸盐

PLP:

Papain-like蛋白酶

p-p65:

磷酸化p65

rt - pcr:

实时定量PCR

圣:

猪睾丸

TGEV:

传染性肠胃炎病毒

肿瘤坏死因子-α:

肿瘤坏死因子α

UTR:

翻译区

不适用。

国家“十二五”农村科技支撑计划项目(No. 2015BAD12B02-7)、国家自然科学基金项目(No. 31702260)、国家兽医病原生物学重点实验室开放基金项目(No. 31702260)资助。黑龙江省高校创新英才护理项目(SKLVEB2018KFKT004);UNPYSCT-2018147)，中国博士后科学基金(2016 M601408)。

作者指出

1. 王亚楠和孙奥英对这项工作做出了同样的贡献。

作者及隶属关系

1. 东北农业大学动物医学院预防兽医系，黑龙江哈尔滨

   王亚楠，孙奥英，孙宇，张思佳，夏田，郭田田，郝振业，蒋艳萍，乔鑫源，崔文，唐丽杰，徐义刚，李益静，王莉

2. 农业部动物病原生物学重点实验室东北科学检测站，黑龙江哈尔滨

   王亚楠，孙奥英，孙宇，张思佳，夏田，郭田田，郝振业，蒋艳萍，乔鑫源，崔文，唐丽杰，徐义刚，李益静，王莉

3. 东北农业大学动物科技学院，黑龙江哈尔滨

   李的太阳

贡献

LW和YL构思并设计了该研究。YW、AS、YS、SZ、TX、TG、ZH、LS、YJ、XQ和WC进行了实验。LT和YX分析了数据。YW准备了手稿。所有作者都阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应到《易经》李或李王．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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