在脑炎患者中快速检测人类疱疹病毒的下一代测序

背景

病毒进入神经系统及相关组织所引起的炎症性或非炎症性改变即为中枢神经系统病毒感染。病毒感染是一种常见的中枢神经系统传染病，其中以单纯疱疹病毒性脑炎最为常见。然而，传统的实验室检测技术难以实现病原学诊断。

案例展示

在这里，我们提出了一个严重的进行性脑炎患者，需要诊断特定的病原体，以指导临床治疗。

结论

应用新一代测序技术对脑炎病因进行了快速、明确的诊断，使我们的患者得到了适当的治疗。

脑炎是一种复杂的临床综合征，目前对感染、自身免疫和肿瘤病因的诊断检测往往无法确定病因。超过一半的脑炎病例无法解释[1］．脑炎可由细菌、真菌、病毒及寄生虫等微生物感染引起[2，3.］．病毒是重要的病原体，但人们对引起脑炎的原因了解甚少[1］．在病毒性脑炎的病因中，单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染是散发性脑炎的最常见病因[4］．当HSV-1感染中枢神经系统时，会出现典型的症状和体征，包括脑炎、脑膜炎、癫痫、语言障碍、记忆障碍[5］．单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)的主要影像学表现为中颞叶、眶额叶、岛叶皮层不对称异常，水肿，可能扩散受限或出血[4］．HSE致残率高，死亡率高。HSE的预后主要取决于快速诊断和早期治疗。由于缺乏可用的测定方法来全面调查导致脑炎的常见、罕见或未知因素，阻碍了及时和快速的诊断。下一代测序(NGS)使病原体鉴定无需先验知识成为可能[6］．在这里，我们介绍NGS来识别一个复杂的脑炎病例不明病因的感染因子。

患者，47岁，女性，主诉精神迟缓3天，于2016年8月29日因失去意识入我院就诊。她患有溃疡性结肠炎18年，接受口服激素(甲基强的松龙，每天16毫克)和异烟肼(每天0.3克)治疗。无吸烟、冠心病、糖尿病、高血压史。患者最初表现为精神迟缓、左下肢颤抖、大小便失禁3天。患者在入院前一天突然发烧，随后失去意识，随后住进地区医院神经内科。进行脑磁共振成像(MRI)，显示双侧扣带回和双侧颞皮质的液体衰减反转恢复(FLAIR)高强度病变(图。1)．头部磁共振静脉造影正常。因疑似脑梗死，给予阿司匹林和阿托伐他汀钙治疗。

脑MRI示双侧扣带回及双侧颞叶皮层液体衰减反转恢复(FLAIR)高强度病变(白色箭头)

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由于病人的病情没有好转，她被转到我们医院。入院时体格检查:昏迷状态(格拉斯哥昏迷评分[GCS] 3)，颈部僵硬，无自主活动。入院时实验室检查，常规血、一般血液学、生化检查均未见异常，红细胞沉降率等炎症标志物正常。行腰椎穿刺。脑脊液(CSF)开口压力为85 mmH₂O.脑脊液常规和生化检测发现:蛋白0.55 g/l (0.20-0.40);白细胞1 × 10⁶/ l (0.0 - -15.0);葡萄糖3.2 mmol/l (2.50-4.50);氯131.9 mmol/l(120-132)。脑脊液细胞学表现异常，可见35个淋巴细胞和1个单核细胞。脑电图观察癫痫样异常放电和弥漫性慢波。病人的病情迅速恶化。由于她的氧饱和度持续下降，她通过气管插管使用机械呼吸机。由于病人的病情没有好转，她被转到神经系统重症监护室。怀疑为脑膜脑炎，给予磷甲酸钠(3 g，每日)、甲基强的松龙脉冲疗法(500 mg，每日5天)、静脉注射免疫球蛋白(20 g，每日5天)等支持治疗。然而，病人的病情仍然难以治疗。 Computed tomography (CT) of the brain revealed hypodense lesions in the bilateral insula and bilateral frontal cortex, corresponding with limbic encephalitis (Fig.2)．实验室检查显示血清和脑脊液自身免疫性脑炎和副肿瘤综合征相关测试正常。单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型DNA的聚合酶链反应(PCR)试验在脑脊液中呈阴性。考虑到抗病毒治疗效果不佳，采用脑脊液下一代测序(NGS)检测病原体。NGS共获得550万个reads，其中837个被鉴定为病毒，检测时间为48 h。脑脊液中发现了HSV-1 DNA。在HSV-1基因组序列上鉴定出的唯一reads的数量为826个，占病毒reads的98.7%。鉴定的HSV-1基因组覆盖率为44%，深度值为1。图中显示了所识别的HSV-1 DNA序列的唯一读取数和百分比、覆盖范围和深度。3.a, b.诊断为HSV-1型脑炎后，患者开始静脉注射阿昔洛韦(500 mg，每日3次)和磷甲酸钠(3g，每日3次)。脑部CT重复扫描示右侧额叶、右侧脑岛、双侧颞叶、左侧基底神经节多发低密度病灶，包括右侧额叶病灶出血。入院后第14天(图;4A)，鉴于病情恶化，再次静脉注射免疫球蛋白(每天20 g，连续5天)。大约20天后进行的脑部重复CT扫描显示，与之前的CT扫描相比，双侧颞叶低密度病变范围增加，左侧下颞叶低密度病变内出血(图2)。4b).积极治疗后，患者病情无明显改善。入院后第28天，复查脑部CT显示:1、右侧额叶、左侧颞叶出血及密度减少;2、左枕顶、左基底神经节新发大量脑出血，伴侧脑室血肿破裂;3、中线偏离大脑镰向右;4、蛛网膜下腔出血(图;5a, b).家属在入院后第46天放弃治疗，患者出院后死亡。

脑部电脑断层扫描显示双侧脑岛及双侧额叶皮层低密度病变，与边缘脑炎相对应

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一个，b病原鉴定的NGS结果。在我们的患者中，98.7%的病毒读数对应于HSV-1，覆盖率为44%

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一个脑部CT示右侧额叶、右侧脑岛、双侧颞叶、左侧基底神经节多发低密度病灶(白色箭头)，包括右侧额叶病灶出血(黑色箭头)。b脑部CT示双侧颞叶低密度病变范围(白色箭头)增大，左侧颞叶下低密度病变内出血(黑色箭头)。

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一个，b脑部重复CT扫描结果如下:1。右额叶、左颞叶出血及密度(白色箭头)减少;2.左侧枕顶部及左侧基底神经节见新的大出血(黑色箭头)，血肿破入侧脑室;3.中线偏离大脑镰向右侧;4.蛛网膜下腔出血明显

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样本收集和信息

本研究纳入2016年8月河北医科大学第二医院临床疑似病毒性脑炎患者。宏基因组测序使用以前发表的方法进行[7在住院第5天进行的临床指征腰椎穿刺的脑脊液。按照标准程序收集CSF，快速冷冻并在- 20°C保存。这项研究得到了PUMCH机构审查委员会和北京基因组研究所(IRB No.;js - 890)。本研究使用患者的临床资料和脑脊液样本得到了PUMCH伦理委员会的批准。获得所有患者或其法定代理人的书面知情同意。

DNA提取，文库构建，测序

使用TIANamp Micro DNA试剂盒(DP316，天根生物技术，北京，中国)直接从临床样本中提取DNA。通过隔夜添加和修复转接头，对提取的DNA进行聚合酶链反应扩增，构建DNA文库。在测序前，使用生物分析仪(Agilent 2100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)结合PCR对适配器进行质量控制。然后使用BGISEQ-100平台(BGI-Tianjin，天津，中国)进行DNA测序。

数据处理与分析

在过滤掉低质量、低复杂度和较短的reads后生成高质量的测序数据。为了消除人类序列的影响，使用称为Burrows-Wheeler比对的强大比对工具排除了映射到人类参考基因组(hg19)的数据。其余的数据随后与微生物基因组数据库进行比对，其中包括细菌、病毒、真菌和原生动物。最后，通过去除重复读取对映射数据进行处理，以进行高级数据分析。

从国家生物技术信息中心(fp://fp.ncbi.nlm.nih)下载了一个非冗余数据库，其中包括所有已发表的微生物基因组。Gov /基因组)。这项研究使用的数据库包含1492种细菌、2686种病毒和60种可引起人类感染的真菌，以及33种与人类疾病相关的原生动物。每个物种的深度和覆盖率是通过SOAP网站上的SoapCoverage (https://github.com/sunhappy2019-8/soap.coverage)．

我们在这里介绍一位47岁的女性，有18年的溃疡性结肠炎病史，接受口服激素治疗，最近被诊断为疑似病毒性脑炎。她表现为精神迟缓和意识不清。入院时神经系统查体:昏迷状态(GCS 3)，颈部僵硬，无自主活动。她的症状突然出现，进展很快。她还出现了短时间的呼吸衰竭。脑MRI示双侧扣带回及双侧颞叶皮层液体衰减反转恢复(FLAIR)高强度病变。脑部重复CT扫描显示多发性脑出血。脑脊液测试显示轻度淋巴细胞增多我们怀疑为HSV-1型脑炎，但病毒抗体检测未显示疱疹病毒感染。无论抗巨细胞病毒抗体是否阳性，我们都不考虑巨细胞病毒感染。 It may be that HSV antigens are similar to those of cytomegalovirus, as HSV-1 was detected in the CSF by NGS. Despite anti-viral treatment and intravenous immunoglobulin, her condition continued to decline until she finally died. We conclude that she suffered from severe encephalitis, and even upon timely and effective treatment; mortality remains high in such cases. Resistance to acyclovir may exist, so the infection cannot be easily controlled.

传统的检测方法无法诊断该病例的病因。目前，临床表现、影像学研究和脑脊液分析是病毒性脑炎诊断方法的基础[8，9，10］．然而，使用传统的检测方法(如PCR)很难识别这种病毒。因此，我们使用NGS来识别病原体并开始适当的治疗。新型DNA测序技术，称为下一代测序(NGS)，提供了高速度和高通量，可以产生大量的序列[9］．继第一篇利用NGS技术实现钩端螺旋体脑炎病原诊断的文章发表后，开启了mNGS技术诊断中枢神经系统感染的新时代[11］．诊断病毒学是NGS最成功的应用之一，在新病毒的发现和表征、临床标本中意外病毒病原体的检测等方面取得了令人兴奋的结果[10］．2019年初，Michael Wilson教授的团队评估并确认了Metagenomic NGS技术的有用性[11］．近一半的急性脑膜脑炎病例未得到病因诊断。由于缺乏及时、明确的病原体诊断，患者得不到有效的治疗。即使在常规病原体检查后，将近三分之一的神经系统感染患者被误诊。随着NGS技术越来越普及，我们预测它很可能成为临床诊断的重要工具。

我们声明，手稿中描述的材料，包括所有相关原始数据，将免费提供给任何希望将其用于非商业目的的科学家，而不违反参与者的机密性。

CSF:

脑脊液

CT:

计算机断层扫描

天赋:

流体衰减反演采收率

gc:

格拉斯哥昏迷量表

HSE:

单纯疱疹性脑炎

1型单纯疱疹病毒:

人类疱疹病毒1型

核磁共振成像:

磁共振成像

门店:

新一代测序

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

我们感谢提供临床支持的医生。我们还要感谢病人的家人。

这项工作没有提供经费。

1. 张豫和洪坤对这项工作做出了同样的贡献。

作者及隶属关系

1. 河北医科大学第二医院神经内科，中国河北省石家庄市

   张宇，洪坤，邹月丽，卜慧

贡献

BH治疗了病人，分析和解释了数据，并写了手稿的草稿。ZY对患者进行治疗，分析和解释数据，并参与对手稿进行批判性修改。HK和ZY也对患者进行了治疗，并对手稿进行了严格的修改。所有作者都对即将出版的版本给予了最终的批准。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到回族Bu．

伦理批准并同意参与

所有提交的案例或其法定监护人均同意根据机构指南收集和使用数据。

发表同意书

所有提交的案例或其法定监护人均同意根据机构准则发表。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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