sapelovirus进入IPEC-J2细胞依赖于小泡介导的内吞作用

背景

猪萨波病毒(PSV)是小波病毒科萨波病毒属的一种，是猪肠炎、肺炎、脊灰脑脊髓炎和生殖障碍的重要原因。然而，PSV在分子水平上的生命周期在很大程度上是未知的。

方法

在这里，我们使用化学抑制剂、RNA干扰和显性阴性(DN)突变质粒的过表达来验证PSV进入猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)的不同内吞途径的作用。

结果

我们的实验表明，用NH预处理细胞可抑制PSV感染₄氯或氯喹。抑制剂制霉菌素、甲基-β-环糊精、朝摩尔和wortmannin显著降低了PSV进入效率，而抑制剂氯丙嗪和EIPA没有影响。此外，过表达小穴蛋白DN突变体和对抗小穴蛋白的siRNA也降低了病毒滴度和VP1蛋白合成，而过表达EPS15 DN突变体和对抗EPS15的siRNA并没有减少病毒感染。

结论

我们的研究结果表明，PSV进入IPEC-J2细胞依赖于小泡/脂筏介导的内吞作用，这是ph依赖的，需要动力素和PI3K，但不依赖网格蛋白和大胞饮。

病毒通常通过受体介导的内吞作用进入细胞。特征明确的网格蛋白介导的内吞作用(CME)是配体内化的常用内吞途径，如转铁蛋白和表皮生长因子[1]，以及许多病毒，包括C型口蹄疫病毒[2]和埃可病毒7 [3.］．CME包括病毒的内化，通过形成网格蛋白外衣而被招募到质膜上[4］．生成的包被囊泡将病毒颗粒输送到外周早期核内体、晚期核内体和溶酶体中。

此外，细胞采用许多替代的内吞途径，从而在传统CME之外进行处理。其中，小泡/筏依赖的内吞作用是另一种特征明显的通路。小穴，一种以小穴蛋白-1蛋白富集为特征的瓶状内陷，可被细胞用来实现外部货物快速运输到内质网或高尔基体[5］．猴病毒40利用小穴向内质网转运，而不依赖于CME [6］．埃可病毒是一种非包膜RNA病毒，它通过大的、膜性的、非网格蛋白的、非小泡蛋白包被的结构进入caco-2细胞，进行依赖于动力蛋白和胆固醇的独特加工[7］．鼠诺如病毒-1也可通过非网格蛋白和非小泡途径感染细胞[8］．病毒进入的另一种方式是构成性或诱导性大胞饮[9，10]，这依赖于Rho家族的小gtpase和肌动蛋白重塑来促进细胞表面挤压的形成[11，12］．

猪萨波病毒(PSV)是一种单链非包膜RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科萨波病毒属，与急性腹泻、脊髓灰质炎脑脊髓炎、肺炎和生殖障碍密切相关[13，14］．PSV在中国首次从腹泻猪中分离出来[13]并源自日语中的wild boar [15]，随后在西班牙、韩国、巴西和美洲的猪腹泻粪便样本中被检测到[14，16，17，18]，在美国造成很高的发病率和病死率[14］．目前对PSV的研究主要集中在基因组特征方面[19，20.，21]和流行病学[22］．虽然在LLC-PK1细胞中发现GD1a上的α2,3连接唾液酸作为PSV受体[22]，关于PSV的发病机制、复制和进入机制的研究还没有很好的建立。

不同的小核糖核酸病毒使用多种途径进入宿主细胞，包括CME、小泡和脂筏[23，24］．在目前的研究中，我们通过使用化学抑制剂、siRNA沉默和过表达穴蛋白蛋白-1、Eps15和动力蛋白-2显性阴性(DN)突变体，系统地干扰已知内吞机制中涉及的各种细胞关键因子的功能，解决了PSV进入猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的问题。我们的结果表明，PSV的进入是小穴蛋白-、脂筏-和动力蛋白依赖的，不涉及网格蛋白和大胞饮途径。此外，病毒进行缓慢的酸依赖渗透。

细胞和病毒

IPEC-J2细胞在RPMI 1640培养基(Gibco，美国)中培养，添加10%胎牛血清(FBS, Gibco)，浓度为5% CO₂37°C。PSV (csh)菌株在实验室分离并保存[13］．本实验室制备小鼠抗psv VP1多克隆抗体。

抑制剂和细胞活力测定

抑制剂氯丙嗪(CPZ)、氯化铵(NH₄Cl)、氯喹(CQ)、甲基-β-环糊精(MβCD)、制霉菌素、dynasty ore、5-(n -乙基- n -异丙基)amiloride (EIPA)和wortmannin购自Sigma，溶于水或DMSO并保存于−80°C。Alexa Fluor 594偶联霍乱毒素B (CTB)和Alexa Fluor 568偶联转铁蛋白(Tfn)购自Invitrogen公司(Carlsbad, CA, usa)。使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China)评估抑制剂处理后的细胞活力。简单地说，将细胞种在96孔细胞培养板中，然后用不同浓度的药物处理24小时。用10 μl CCK-8在37℃孵育2 h后，在450 nm波长处采集吸光度数据。

细胞感染和药物治疗

在24孔板中培养IPEC-J2细胞单层。用DPBS洗涤三次后，在37°C下以指定浓度的抑制剂预处理细胞1 h。然后加入PSV (MOI = 0.5)进行病毒进入和复制实验。在孵育1小时后，用DPBS清洗三次，去除未结合的病毒，并向细胞中添加新鲜培养基。在24 hpi时，用TCID测定细胞的病毒滴度₅₀western blot检测VP1蛋白表达水平。

质粒和siRNA转染

小干扰rna (siRNAs)对抗野猪网格蛋白重链(siCHC-1, GCUCCAGAACCUGGGUAUATT;siccc -2, GGAAGGAAAUGCAGAAGAATT)， caveolin-1 (siCav, GCAAUAUCCGCAUCAACAUTT)和阴性对照(siNC, 5 ' -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ')由GenePharma(中国上海)合成。将IPEC-J2细胞种在24孔板上，并根据制造商的说明使用lipofectamine 6000 (Beyotime Biotechnology)转染sirna。采用RT-qPCR定量分析敲除效率。

表达gfp标记的Eps15 (WT)、Eps15 (EpsΔ95/295)、caveolin 1野生型(Cav WT)、caveolin 1 DN突变型(Y14F)、dynamin-2 (WT)和dynamin-2 (K44A)的质粒由本实验室构建，由Sangon(中国上海)测序。为了测定转染WT或DN突变体的细胞对PSV的传染性，首先用0.5 μg质粒转染24 h培养在24孔板上的IPEC-J2细胞。用PSV感染细胞(MOI = 0.5)， western blot检测病毒复制情况。

RT-qPCR和western blot

siRNA转染30小时后，裂解细胞，用TRIzol (Invitrogen)提取总RNA。RT-qPCR检测网格蛋白重链(CHC)和小穴蛋白-1的mRNA水平。RT-qPCR在ABI 7500实时PCR系统和7500系统软件(Applied Biosystems, Alameda, CA, USA)上使用SYBR绿色母本混合进行。western blot分析，细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解。SDS-PAGE分离后，将蛋白电转移到PVDF膜上，然后用小鼠抗psv VP1抗体(1:1000)和结合HRP的抗小鼠二抗(1:1000)进行免疫印迹。α-微管蛋白作为负载对照。最后用ECL蛋白印迹检测试剂(GE Healthcare)进行条带显像，用Image Pro-Plus软件进行定量。

Tfn和CTB摄取测定

将PK-15细胞接种于带盖板的12孔板中，未处理或用指定抑制剂预处理1 h，然后与50 μg/ml Alexa Fluor 568偶联Tfn或10 μg/ml Alexa Fluor 594偶联ctb在37℃下孵育60 min。然后用冷PBS洗涤细胞3次，用冷0.4%多聚甲醛固定。用DAPI染色细胞核，用共聚焦显微镜观察细胞。

病毒滴定

感染PSV的抑制剂处理和模拟处理的IPEC-J2细胞在感染后24 h通过冷冻和解冻3次收集，然后离心去除细胞碎片。在96孔细胞培养板中融合细胞单层，37℃下连续稀释收集到的病毒10倍(100 μl/孔)1 h。大约4-5天后，记录细胞病变效应，用Reed-Muench法计算病毒滴度，记为TCID₅₀/ 100μl。

统计分析

两个独立实验的数据以均数±标准差表示。所有统计分析均使用GraphPad Prism中双尾学生t检验或单向方差分析和Tukey post-hoc进行。P< 0.05为差异有统计学意义。

PSV感染IPEC-J2细胞需要活跃的内体酸化

为了确定内体酸化对PSV传染性的影响，我们将IPEC-J2细胞暴露于浓度增加的CQ和NH中₄氯60分钟。在MOI为0.5的条件下，将细胞暴露于PSV中24 h，检测滴度和VP1蛋白合成。NH₄Cl和CQ都是促溶性弱碱，可抑制内体酸化。细胞活力测定的数据确定了药物的亚毒性浓度(图2)。1a和b)。与模拟处理细胞相比(6.38 log . b)₁₀TCID₅₀/100 μl或6.22 log₁₀TCID₅₀/100 μl)， 5 mM NH处理细胞的病毒滴度₄Cl或10 μM的CQ为5.57 log₁₀TCID₅₀/100 μl或5.38 log₁₀TCID₅₀/100 μl(图;1同样，NH也减少了病毒VP1蛋白的合成₄Cl和CQ呈浓度依赖性(图;1c).总之，这些发现表明PSV进入IPEC-J2细胞使用ph依赖，因此很可能是一个内体细胞进入途径。

PSV进入和感染不需要网格蛋白

CPZ是一种常用的化学抑制剂，通过阻止网格蛋白晶格在核内体膜上的组装和网格蛋白包被的凹坑在细胞表面的组装来干扰CME [25］．为了研究网格蛋白依赖的内吞途径在PSV进入和IPEC-J2细胞感染中的作用，我们首先测试了CPZ对转铁蛋白摄取的影响，这是CME途径的一个模型。如图所示。2a，当10 μM CPZ处理时，荧光标记转铁蛋白的信号强度明显降低。然后我们用亚毒浓度的CPZ处理IPEC-J2细胞(图。2b).然而，在CPZ存在的情况下，PSV病毒滴度或VP1蛋白合成似乎没有降低(图。2b, c).接下来我们测试了敲除CHC对PSV感染的影响。通过RT-qPCR检测siRNA对抗CHC的效率。2d).然后用siRNA阴性对照、非靶向CHC或靶向CHC的siRNA转染IPEC-J2细胞。转染30 h后用PSV感染细胞(MOI = 0.5)， 24 h后采集细胞裂解液，western blot检测。靶向CHC的siRNA也没有减少病毒感染(图。2e).为了进一步证实PSV进入IPEC-J2细胞不需要CME，我们转染了Eps15，它是网格蛋白包被的凹坑的关键成分，与adaptor protein 2相互作用[26］．同样，转染野生型或DN突变型Eps15也未观察到VP1蛋白合成的显著降低(图5)。2f).总的来说，这些数据表明CME可能不是PSV感染的必要途径。

PSV的侵入可能是小泡和胆固醇依赖性的

小泡是质膜内陷，参与许多细胞过程，包括运输、信号转导和肿瘤抑制。小穴的形成取决于小穴蛋白-1 (caveolin-1, Cav1)的表达。Cav1直接与质膜的胆固醇相互作用[27]胆固醇的消耗会使小穴变平[28］．为了研究小泡/脂筏可能参与PSV进入，我们首先测试了胆固醇隔离剂制霉菌素和小泡依赖的内吞抑制剂MβCD对CTB摄取测定的影响。无论是5 μM制霉菌素预处理还是2 mM MβCD预处理，荧光标记的CTB信号强度都显著降低，这表明CTB的吸收被阻断(图2)。3.a).因此，在PSV感染之前，我们以亚毒性浓度增加制霉菌素和MβCD浓度处理IPEC-J2细胞(图。3.b).我们观察到10 μM制霉菌素和3 mM MβCD可使病毒滴度降低约1 log₁₀还有2log₁₀，与未处理的对照组相比(图;3.b).同样，在MOI为0.5时，5 μM制霉菌素和10 μM制霉菌素预处理VP1蛋白水平分别降低了53%和62%，2 mM MβCD和3 mM MβCD预处理VP1蛋白水平分别降低了77%和96%(图5)。3.c)。

此外，利用siCav进行细胞扰动分析，以评估小穴蛋白在病毒感染中的作用。通过RT-qPCR首次检测到siRNA效率，siCav可特异性降低小穴蛋白表达(图。3.d).然后将siNC或siCav转染到IPEC-J2细胞中。转染30小时后，我们进行了PSV进入实验，发现siCav特异性地降低了大约45%的病毒VP1蛋白表达(图2)。3.e).我们还转染了带有Y14F突变蛋白显性阴性形式的IPEC-J2细胞，据报道该蛋白可抑制小泡依赖的内吞作用[29］．在病毒感染前分别用caveolin-1 WT或DN质粒caveolin-1 Y14F和对照载体转染IPEC-J2细胞。我们发现，与转染空载体的细胞相比，表达caveolin-1 DN的细胞中PSV VP1蛋白合成显著降低了约80%(图2)。3.f).综上所述，这些数据表明PSV进入IPEC-J2细胞依赖于小泡和脂筏。

PSV进入IPEC-J2细胞需要动力素

Dynamin-2是一种调节GTPase，是质膜小泡裂变所必需的[30.］．本研究采用胞透性动力素GTPase活性抑制剂Dynasore检测动力素在PSV感染过程中的作用。我们观察到大约2 log₁₀与未处理的细胞相比，10 μM动态矿处理后的细胞病毒滴度降低(图2)。4a).此外，在浓度为5 μM时，王朝矿石使PSV VP1蛋白合成降低了60%，而在浓度为10 μM时，王朝矿石使PSV VP1蛋白合成降低了70%(图2)。4b).为了进一步验证动力素可能参与PSV进入，我们用编码野生型动力素- gfp或DN突变型动力素(K44A)的质粒转染IPEC-J2细胞，发现DN突变型动力素(K44A)的表达可使PSV VP1蛋白合成减少约71%(图4)。4c)，提示PSV进入IPEC-J2细胞需要动力素。

PSV的进入与大胞饮无关，但需要磷脂-linositide 3-kinase (PI3K)

大颗粒体的形成依赖于Na⁺/小时⁺交易所，和EIPA是一个Na⁺/小时⁺因此，反端口抑制剂抑制大胞饮介导的内吞作用[12］．Wortmannin是PI3K的共价抑制剂，参与巨胞增多症的多个阶段[31］．为了研究PSV进入是否涉及大胞饮和PI3K，将PSV添加到经EIPA或渥曼霉素预处理的IPEC-J2细胞中。不同浓度的EIPA对PSV滴度或VP1蛋白合成均无影响₅₀western blot(图;5a、b)。5 μM渥曼菌素可使病毒滴度降低约1 log₁₀并使PSV VP1蛋白合成分别降低21%(图;5c, d).这些发现表明PSV的进入和复制不依赖于大胞饮，而是需要P13K。

病毒的内化和进入目标细胞可能在不同类型的细胞中使用多种途径[31］．为了研究PSV在IPEC-J2细胞中使用多种内吞途径的可能性，我们采用了系统的方法，包括药物抑制、RNA干扰和DN突变质粒的过表达。我们在这里表明PSV不依赖于CME或大胞内吞作用。相反，PSV通过小泡/脂质筏途径进入IPEC-J2细胞，需要动力素和低ph环境。了解PSV所经历的贩运途径不仅可以提高对病毒生物学的理解，而且对于寻找药物靶点至关重要。

一般来说，pH值的变化对于病毒通过直接融合进入质膜并不是必需的，而当病毒篡夺细胞内吞途径时，则需要低pH值的环境[32］．病毒粒子通常只在完全内化后的几分钟内就暴露在核内体的酸性环境中。在某些情况下，仅酸性pH值不足以诱导某些病毒(包括许多哺乳动物呼肠孤病毒)的融合，而依赖酸性的内体蛋白酶介导的病毒蛋白裂解对于触发变异到具有穿透能力的条件是必不可少的[33］．向酸性核内体扩散的弱溶酶促性碱基增加了核内体的pH值，从而抑制了人鼻病毒和马鼻炎A病毒的病毒感染[34，35］．用NH治疗₄破坏细胞pH值的Cl或CQ以浓度依赖的方式降低了PSV滴度和VP1蛋白的合成，表明了pH依赖的摄取机制。

网格蛋白介导的内吞途径是病毒最常用的内吞途径。它将进入的病毒粒子与其受体一起运输到早期和晚期的核内体中。CME的特征是在质膜凹痕处形成厚包覆的凹坑，并形成特征性网格蛋白包覆的囊泡[32，36］．在这里，我们使用CPZ, siRNA对抗EPS15和EPS15 DN突变融合到GFP特异性阻断CME。我们的结果表明，CPZ抑制转铁蛋白的摄取，但没有降低PSV滴度或VP1蛋白表达水平。同样，siRNA对抗EPS15和EPS15 DN突变转染没有显著改变PSV感染，表明PSV进入IPEC-J2细胞可能独立于CME。

小囊介导的内吞作用是口蹄疫病毒埃可病毒1号进入的主要途径[37]和其他病毒[38，39］．该途径的特点是依赖于非肌肉细胞中的小穴蛋白-1 [40］．小穴内吞需要动力素，动力素位于小穴颈部，或在内皮细胞中组成[41]，或对特定信号作出反应[6］．用小穴介导的内吞抑制剂处理的细胞对PSV的进入产生了抗性，小穴蛋白1敲除以及小穴蛋白DN突变体转染也抑制了病毒感染。总之，这些数据表明，小泡/脂筏介导的内吞作用可能是PSV进入IPEC-J2细胞的主要途径。

动力素有助于膜裂变产生内吞小泡，是许多内吞途径所必需的。内吞途径可分为依赖动力素的亚途径，包括CME、小泡介导的内吞和不依赖网格蛋白介导的动力素介导的亚途径，以及不依赖动力素的亚途径，包括大胞饮、脂筏介导的内吞和非网格蛋白/非小泡的内吞[11，27，42］．我们对动力素抑制剂、动态矿和动力素DN突变体的研究表明PSV可能利用动力素介导的途径。

巨胞饮症是一种短暂的、依赖于肌动蛋白的细胞过程，细胞利用此过程内化大量的液体和细胞膜[43］．该过程需要肌动蛋白聚合，但不依赖于动力蛋白。经证实它可被牛痘病毒使用[44]及麻疹病毒[45］．由于NHE对大细胞突起的形成至关重要，我们使用Na⁺/小时⁺抑制剂EIPA检测大胞饮在PSV进入中的作用。10 μM EIPA处理未降低病毒滴度或VP1蛋白合成，提示PSV进入IPEC-J2细胞可能与大胞饮无关。Wortmannin可以抑制polo样激酶家族成员和pi3k相关激酶，包括mTOR, ATR和dna依赖蛋白激酶的催化亚基[46，47，48］．虽然我们的数据表明wortmannin可以减少PSV的复制，但其确切机制仍有待阐明。

本研究还存在一定的局限性。首先，病毒可能通过不同的途径进入不同的靶细胞。PSV可在多种细胞中培养，包括猪细胞(PK-15、IPEC-J2、IBRS-2和LLC-PK) [13，22]和人肝癌细胞系(PLC/PRF/5和HepG2/C3a) [20.］．我们仅使用IPEC-J2细胞作为靶细胞，其他替代细胞系超出了目前的研究范围。第二，肌动蛋白和微管骨架在细胞内吞和细胞内运输中起着至关重要的作用，但抑制肌动蛋白和微管对PSV感染的影响没有表现出来。第三，PSV感染后抑制剂治疗的具体作用尚不清楚。因此，今后还需要进一步的工作来解决上述问题。

综上所述，我们进行了系统的研究，阐明了PSV进入IPEC-J2细胞的机制。我们的数据表明，PSV可能通过动力蛋白、胆固醇依赖和小穴蛋白介导的内吞作用进入细胞，这需要低ph值。本研究的发现可能为这些RNA病毒的生物学特性提供新的见解，并为开发新的治疗方法提供新的机会。

Cav1:

Caveolin-1

CCK-8:

细胞计数套件-8

CHC:

网格蛋白重链

芝加哥商品交易所:

Clathrin-mediated内吞作用

CPZ:

氯丙嗪

CQ:

氯喹

施:

共轭霍乱毒素B

DN:

主要负

EIPA:

(5) - N-ethyl-N-isopropyl阿米洛利

IPEC-J2:

猪小肠上皮细胞

MβCD:

甲基-β环糊精

NH₄肤色线:

氯化铵

埃因霍温:

Sapelovirus

siRNAs:

小干扰rna

一个也没有。

资金

国家自然科学基金项目(31572525)和国家重点研发计划项目(No.2017YFC1200203)资助。

数据和材料的可用性

一个也没有。

作者及隶属关系

1. 上海交通大学农业与生物学院，上海市兽医生物技术重点实验室，上海市东川路800号

   赵婷婷，崔莉，沈晓娟，华秀国

2. 上海市浦东新区动物疫病预防控制中心，上海200136

   于向谦，张中海

贡献

TZ进行了实验并写下了这篇手稿。XY, ZZ, XS对稿件进行了核对和修改。LC和XH构思了该研究并参与了设计。所有作者都同意了最终的手稿。

相应的作者

对应到Xiuguo华．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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