eb病毒EBNA1蛋白调节细胞基因的选择性剪接

背景

选择性剪接(AS)是一个重要的mRNA成熟步骤，可以增加真核生物蛋白质的变异性和多样性。AS在许多疾病中失调，其在致癌过程中的意义是众所周知的。然而，在了解致瘤病毒如何调节剪接以及这种调节如何参与病毒致瘤性方面的进展有限。eb病毒(EBV)与多种癌症有关，其EBNA1癌蛋白是所有EBV恶性肿瘤中唯一表达的病毒蛋白。

方法

在本研究中，利用高通量RT-PCR方法检测1238种癌症相关基因的AS，评估了EBNA1调节细胞基因AS的能力。RNA免疫沉淀耦合RNA测序(RIP-Seq)测定也用于鉴定EBNA1结合的细胞mrna。

结果

根据EBNA1的表达，我们检测到89个与癌症有关的基因的AS谱的修饰。此外，我们发现EBNA1调节各种剪接因子如hnRNPA1、FOX-2和SF1的表达水平。最后，RNA免疫沉淀结合RIP-Seq分析表明，EBNA1免疫沉淀特异性的细胞mrna，而不是那些在表达EBNA1的细胞中剪接不同的mrna。

结论

EBNA1蛋白可以调节许多细胞基因的AS谱。有趣的是，这种调节蛋白不需要EBNA1的RNA结合活性。总之，这些发现强调了EBNA1作为细胞剪接调节剂的新作用。

选择性剪接(AS)是真核生物提高蛋白质组多样性的重要机制。在智人， AS几乎无处不在，因为超过90%的人类基因会经历AS [1]。与本构剪接相反，AS导致相同的前信使RNA (pre-mRNA)的外显子、保留的内含子和剪接位点的不同排列。这使得相同的前mrna可以被加工成不同的编码同种异构体的成熟mrna，有时甚至在蛋白质水平上具有相反的功能。AS的调控方面越来越为人所知，AS的变化与多种疾病有关，如癌症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和类风湿性关节炎[2，3.，4，5]。

最近获得的证据表明，病毒可以破坏细胞转录本的AS，尽管对病毒感染的功能后果仍然很少。许多研究表明不同的机制允许来自不同家族的病毒改变宿主细胞AS。例如，Sindbis病毒通过病毒基因组和亚基因组rna中的多个HuR 3 ' -UTR结合序列将细胞质中的HuR蛋白隔离，从而修饰了PCBP2和DST本手稿中使用的所有基因名称的完整列表及其官方完整名称包含在附加文件中1:表S1) [6]。同样，脊髓灰质炎病毒蛋白酶2A (2Apro)能够改变HuR、TIA1和TIAR的细胞定位，从而影响凋亡基因的剪接FAS［7]。此外，水疱性口炎病毒(VSV)感染引发剪接因子hnRNPA1、hnRNPC1/C2和hnRNPKM从细胞核到细胞质的重新定位，其对剪接的功能影响尚不清楚[8]。最后，几项转录组学研究表明，病毒感染后不同细胞模型中的AS失调[9，10，11]。这些AS修饰如何影响病毒感染的过程仍有待研究。

关于影响的研究herpesviridae对细胞剪接的研究主要集中在单纯疱疹病毒1型(HSV-1)及其早期ICP27蛋白。在HSV-1感染期间，ICP27干扰剪接机制，从而导致宿主蛋白合成关闭[12，13]。这种现象涉及到ICP27与剪接机制组件的相互作用以及剪接因子的重新分配[14，15]。然而，对HSV-1感染细胞进行的rna测序研究发现，没有证据表明病毒感染会破坏AS [16]。eb病毒(EBV)调节AS的新证据herpesviridae许多癌症(如伯基特和霍奇金淋巴瘤、胃癌和鼻咽癌)都涉及EBV SM家族，这表明EBV SM蛋白和EBER1/2非编码rna在as调节中的潜在作用。病毒SM蛋白被证明可以改变剪接STAT1基因，导致转录物编码显性阴性STAT1蛋白[17，18]。由于STAT1在干扰素信号转导通路中的作用，剪接改变对传染性的影响可能是重要的。此外，潜伏感染期间积聚在细胞核中的两种非编码rna (EBER1和EBER2)可以改变细胞AS。EBER1被证明与AUF1/hnRNP - D剪接因子相互作用，这两种EBERs在培养细胞系中的表达导致宿主细胞AS景观的显著变化[19，20.]。

除了eber和各种mi- rna外，EBNA1是EBV感染期间所有形式的潜伏期中唯一表达的蛋白[21]。它定位于细胞核，具有多种作用，包括结合细胞和病毒基因组，调节信号通路和基因转录[22，23]。EBNA1也被认为是一种致癌蛋白，并将EBV感染与致癌联系起来。例如，EBNA1可以结合USP7，一种稳定p53和MDM2的泛素蛋白酶。这种竞争性结合会破坏p53和MDM2的稳定性，从而促进细胞存活[24]。此外，EBNA1增加STAT1的水平，SMAD2的周转，抑制NF-κB的活性和DNA结合特性;所有这些蛋白质在肿瘤发生中都有众所周知的作用[25，26]。EBNA1的致癌特性已经在其他地方讨论过[27]。

最近，我们证明EBNA1表达调节各种细胞基因的AS，这些基因在ebv阳性胃癌中也被失调[28]。在目前的研究中，我们提出了这些变化背后的机制调查和可能的原因，这种调制。利用高通量RT-PCR平台研究了EBNA1修饰1238个与癌症相关的细胞基因AS的能力。我们的研究结果强调了AS的病毒调节在肿瘤发生中的潜在关键作用。

生成稳定的EBNA1 HEK293T细胞

利用MSCV-N EBNA1质粒制备表达EBNA1- flag - ha蛋白的稳定HEK293T细胞。MSCV-N EBNA1是来自Karl Munger的礼物(附加基因质粒# 37954)[29]。转染后，用5 μg/mL嘌呤霉素孵育20天。为了保持细胞的选择性，将细胞保存在3 μg/ml嘌呤霉素- dmme -10%胎牛血清中。

Western blot验证EBNA1表达

HEK293T细胞和表达EBNA1-FLAG-HA的HEK293T稳定细胞在T-75烧瓶中融合生长，在1500 rpm, 5 min下胰蛋白酶化并成粒。将细胞重悬于RIPA Buffer (1% Triton X-100, 1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 7.5和完全蛋白酶抑制剂(ROCHE))中，用13%振幅，5 s的冰上超声裂解2次。细胞碎片在13000 RPM, 4°C, 10 min下成球。如果染色体DNA在离心后仍然漂浮，则进行第二次超声和离心处理。采用标准Bradford法(Thermo Scientific comasassie protein assay)对裂解液进行三份的总蛋白剂量测定。取适量的蛋白质在水中稀释至10微升，用1倍(终浓度)的Laemmli缓冲液补全，在95°C下加热5分钟。样品上载10% sds -聚丙烯酰胺凝胶，在150 V下进行电泳。将凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，温度为4℃，温度为1 h15，温度为100 V。将膜在5%的TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 220 mM NaCl, 0.1% Tween 20)中阻断，室温下1小时。将小鼠抗Flag抗体(Sigma Aldrich)、抗HA或抗EBNA1抗体(Santa Cruz Biotechnology)在2.5%的牛奶/PBS中稀释为1:1000 (Flag, HA)或1:100 (EBNA1)，用TBS-T洗涤后，与膜一起在4°C的潮湿室中孵育过夜。 The membrane was washed 3 times in TBS-T and incubated with a sheep anti mouse-HRP secondary antibody 1:5000 (Amersham Biosciences) during 1 h in a humid chamber at room temperature. Membrane was washed 3 times with TBS-T and one time with PBS. Bound antibodies were revealed using an enhanced chemiluminescence (ECL) kit (Perkin Elmer) and scanned on ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare Life Science). Mouse anti-β-actin loading control (Sigma) was done on the same membrane after stripping the membrane by boiling it in PBS for 1 min. The procedure was then the same from the blocking upon revelation using the anti-β-actin antibody diluted 1:2000 (in 2.5% milk/PBS) and the secondary anti-mouse (1:5000) antibody from Amersham.

稳定表达EBNA1 HEK293T的免疫荧光研究

前一天，将稳定表达EBNA1-FLAG-HA蛋白的HEK293T细胞以5 × 104个/孔的密度接种于24孔板。用PBS洗涤细胞两次，在室温下用4%多聚甲醛和4%蔗糖在PBS中固定20分钟。在室温下，用0.15% triton X-100在PBS中渗透5分钟，然后用10%正常山羊血清(Wisent)阻断细胞。抗ha抗体(Santa Cruz Biotechnologies)室温孵育4小时，检测EBNA1-FLAG-HA蛋白。细胞洗涤后，用DyLight 488标记的山羊抗小鼠二抗(ThermoFisher Scientific)在黑暗中孵育1小时。1 μg/ml Hoechst染色，室温下染色15 min。用SlowFadeGold上载介质(Life Technologies)将盖玻片安装在载玻片上，然后使用Nikon Eclipse TE2000-E可见光/表观荧光倒置显微镜，使用Hoechst和DyLight 488带通滤光片进行荧光显微镜观察。

AS事件的高通量RT-PCR筛选

表达EBNA1-FLAG-HA的HEK293T和HEK293T细胞在融合和成粒后生长。按照制造商的方案，使用TRIzol (Invitrogen)和氯仿对细胞颗粒进行总RNA提取。回收水层，与一体积70%乙醇混合，直接应用于RNeasy Mini Kit色谱柱(Qiagen)。柱上的dna酶处理和总RNA回收按照制造商的方案进行。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies)评估RNA完整性。用转录逆转录酶(Transcriptor)、随机六聚体、dNTPs (Roche Diagnostics)和10单位RNAse OUT (Invitrogen)按照生产商的方案对2.2 μg总RNA进行反转录，总体积为20 μl。所有正向和反向引物分别重悬于20-100 μM的Tris-EDTA缓冲液(IDT)中，并在RNase无dna水(IDT)中稀释为一对引物至1.2 μM。在10 μL终体积中对10 ng cDNA进行终点PCR反应，每个dNTP为0.2 mmol/L, MgCl2为1.5 mmol/L，引物为0.6 μmol/L，铂Taq DNA聚合酶(Invitrogen)为0.2单位。95°C初始孵育2分钟，随后在94°C 30秒、55°C 30秒和72°C 60秒进行35次循环。在72°C下孵育2分钟完成扩增。 PCR reactions were carried on thermocyclers GeneAmp PCR System 9700 (ABI), and the amplified products were analyzed by automated chip-based microcapillary electrophoresis on Caliper LC-90 instruments (Caliper LifeSciences). Amplicon sizing and relative quantitation was performed by the manufacturer’s software, before being uploaded to the LIMS database.

线网络

使用STRING数据库[30.[10.0]版本，基因提交生成蛋白-蛋白相互作用网络智人interactome。P蛋白-蛋白相互作用富集的-值直接从STRING分析中恢复。

基因本体分析

注释、可视化和集成发现数据库(DAVID) [31使用Bonferroni修正的6.8版本。参考背景由高通量RT-PCR分析的所有基因组成，以考虑癌症相关基因的偏倚。

剪接因子的蛋白水平

如前所述，HEK293T细胞和表达EBNA1-FLAG-HA的HEK293T稳定细胞在RIPA缓冲液中经融合、胰蛋白酶化和裂解培养。裂解液加量并装入10%丙烯酰胺凝胶。抗体以1:1000稀释为SF1 (Abgent)， Rbm23 (Abgent);hnRNPA1(兔抗ASASSSQRGR肽多克隆，见[32])、Fox-2 (Abcam)和1:100的SRSF3 (Santa Cruz Biotechnologies)。前4个抗体采用1:5000稀释的兔抗二抗(Cell Signaling Technology)， SRSF3抗体采用1:5000稀释的小鼠抗(Cell Signaling Technology)。本文给出的结果是两到三个独立实验的代表性结果。

RNA immunoprecipation

HEK293T细胞和表达EBNA1-FLAG-HA的HEK293T稳定细胞在P150培养皿中汇合生长，收获并成粒。然后在冷PBS中洗涤两次，并以相同体积的多体裂解缓冲液(10 mM Hepes pH 7.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 1 mM DTT, 100 u/mL RNase抑制剂和完全蛋白酶抑制剂(罗氏))重悬。在冰上孵育5分钟后，在- 80°C冷冻以完成裂解。快速解冻后，试管在4°C, 13000 g下离心20分钟。上清液采用Bradford法(Thermo Scientific comasmase Protein assay)加药，一式三份。每个IP取50 μL Anti-Ha matrix (Roche)， 13400 rpm离心1 min，丢弃上清。用1 mL NT2缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.05% NP-40)洗涤微珠，13400 rpm离心1 min，离心5次。然后用900 μL NET-2缓冲液(NT2缓冲液中添加20 mM EDTA、pH 8.0、1 mM DTT和100 U/mL RNase抑制剂)和100 μL (NT-2缓冲液调节至总蛋白量为2.5 mg)分别加入对照或表达EBNA1细胞的裂解液中。试管倒置几次，在13400 rpm下离心1分钟，4°C，去除100 μL作为输入，以评估RNA降解。所有试管在4°C的转轮上孵育过夜。 Beads were precipitated at 5000 g for 5 min, 4 °C and washed five times with ice-cold NT2 buffer. Upon the last washing, beads were resuspended in 90 μL of NT-2 buffer and 10 μL of RQ1 DNase and incubated at 37 °C for 30 min. Input tubes were directly added 10 μL of RQ1 DNase. Dnase-treated IP were diluted with 1 mL NT-2 buffer, centrifuged and supernatant was discarded. Beads were resuspended in 150 μL of proteinase K buffer (1% SDS, 1.2 mg/mL proteinase K from Boehringer Mannheim), and input tubes were directly added SDS and proteinase K to the same volume. Tubes were incubated at 55 °C during 30 min with inversion at every 10 min. RNA was then extracted with phenol-chloroform, followed by a second chloroform extraction step. Precipitation of RNA using 272 mM ammonium acetate, 122 mM LiCl and 27 μg/mL glycogen in ice-cold ethanol was carried out during 2 h at − 80 °C and followed by high-speed centrifugation. Pellets were washed in 75% ethanol, ethanol was thoroughly removed, and RNA was resuspended in water.

RIP-Seq库准备

在Agilent Nano芯片(目录号5067-1511)上进行质量(输入)和数量(输入和IP)评估。来自对照和EBNA1表达细胞的输入均显示出良好的RNA完整性(RIN分别为8.9和9.2)，因此由于实验程序，底层RNA未被降解。按照制造商的协议，使用Illumina Ribo-Zero rRNA去除试剂盒对RNA进行核糖体去除。利用Illumina SSV21106试剂盒从9 μl的去核RNA中构建RNA-seq文库。使用Agilent DNA HS芯片(目录号5067-4626)评估文库质量。按照Illumina Kappa文库定量方案，采用qPCR进行文库定量。HEK293T和HEK293T- ebna1文库进行多路转换，测序使用Illumina HiSeq 4000在McGill大学和gsamome quacimbec创新中心测序服务进行100 bp配对端读取。

RIP-Seq分析

测序后，对照和EBNA1 RIP文库分别获得22,887,816和21,858,499个reads，平均质量评分分别为39和38。首先使用Trimmomatic (Galaxy Tool Version 0.32.2)修剪与这两种条件相对应的读取并删除适配器。使用STAR(版本2.5.1b)将reads与来自ENSEMBL数据库的注释版本89的hg38人类基因组进行比对。通过samtools(版本1.3.2)按名称对Reads进行排序，并使用rmdup函数去除PCR和测序重复。然后使用samtools(版本1.3.2)和自定义的awk命令删除未映射或映射到scaffold及其在头中的相应ID，因为它们不适合使用RIPSeeker进行分析:

Samtools视图-h文件。b一个m | awk ‘((NR < =197 && length($2) < 10) || (NR > =198 && length($3) < 5 && $3! ~ /[*]/)){print $0}’ > file.out.sam.

然后使用samtools将输出文件转换为bam格式，并使用R包RIPSeeker(版本1.10.0)进行分析。之所以选择RIPSeeker包，是因为它是专门设计用于在RIP实验中分配峰值的唯一程序之一[33]。在HEK293T- ebna1和HEK293T上使用RIPSeeker，以HEK293T作为对照，以确定分配峰的可靠性。

数据可用性

本文中讨论的数据已发表在NCBI的基因表达综合数据库[34]，可通过GEO系列注册号GSE107808 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE107808)。

qPCR

在1.7 μg RNA(剪接因子上的qPCR)、600 ng和300 ng (RIP-qPCR，分别复制1和2-3个)上用转录逆转录酶、随机六聚体、dNTPs(罗氏诊断公司)和10单位RNAse OUT (Invitrogen公司)按照制造商的方案进行反转录，总体积为10 μl。所有正向和反向引物分别重悬于20-100 μM的Tris-EDTA缓冲液(IDT)中，并在RNase无dna水(IDT)中稀释为一对引物至1 μM。在CFX-96型热循环仪(BioRad)上，用5 μl 2X iTaq Universal SYBR Green Supermix (BioRad)、10 ng (3 μl) cDNA(剪接因子qPCR)或5 ng (3 μl) cDNA (RIP-qPCR)和200 nM (2 μl)最终引物对溶液，在10 μl孔板上进行定量PCR (qPCR)反应。使用以下循环条件:95℃下3 min;50个循环:在95℃下15 s，在60℃下30 s，在72℃下30 s。使用qBASE框架计算相对表达水平。对于每次PCR运行，在没有模板的情况下对每个引物对进行对照反应，这些反应一致为阴性。

As-PCR

使用Qiazol (Qiagen)按照制造商的方案从细胞中提取总RNA。用1 μg RNA和4 μl iScript Reverse transcription Supermix (BIO-RAD)进行反转录，最终体积为20 μl, PCR程序如下:25°C, 5 min;46℃下20min;在95°C下1分钟。AS特异性引物(IDT)设计为只扩增一个ASE，并在1 μM下重悬在一起。使用的引物和预测的扩增子可在附加文件中找到1表S2。每个反应由ThermoPol缓冲液(NEB)、dNTPs、引物、cDNA和TAQ (NEB)组成，按照以下程序孵育:在94℃下孵育2 min;34次循环:94°C 30 s;55℃下30 s;72℃下1 min;72°C下2分钟(最终伸长率)。PCR产物采用Caliper LC-90毛细管电泳(Caliper LifeSciences)进行分离。

EBNA1在HEK293T中的表达

EBNA1蛋白在病毒癌变方面特别有趣，因为它是所有EBV阳性癌症中唯一表达的EBV蛋白[21]。它在ebv恶性肿瘤中的持续表达表明它具有很强的致病作用。本研究探讨了EBNA1在细胞AS中的作用。数字1a概述了用于研究EBNA1对AS的影响的全局工作流程。为了解释EBNA1在细胞AS中的作用，我们选择了HEK293T细胞系，因为大多数关于EBNA1的机制研究都是在该细胞系中进行的[23，35，36，37]。通过转染，建立了一个稳定的HEK293T细胞系，表达带有HA/FLAG肽标记的EBNA1蛋白。在选择抗生素后，使用针对HA和FLAG标签的抗体和EBNA1特异性抗体，通过Western blot验证EBNA1的表达(图2)。1b).这导致在80 kDa处检测到一个主要的EBNA1条带，与先前的报道一致[38，39，40，41]。在免疫荧光中进一步验证了EBNA1的表达，证实了EBNA1- flag - ha结构的核定位，这与先前的报道一致[22(图。1c)。

EBNA1对AS事件的调节

通过从对照和表达EBNA1的HEK293T细胞中提取总RNA，评估EBNA1修饰癌症相关细胞基因AS的能力。在确认回收的RNA的高质量后，将其置于高通量RT-PCR平台，以评估AS的变化。这项试验的目的是探测1449个AS事件，影响1238个基因，这些基因被怀疑或已被证实与致癌有关[42]。寡核苷酸引物对被设计用于扩增特定的AS事件(AS)，产生不同长度的扩增子(根据AS事件的状态，或短或长)。RT-PCR扩增后，用毛细管电泳分离、检测和定量。使用百分比拼接(PSI)度量来比较两种情况下(即对照细胞和表达EBNA1的细胞)的ase。高|ΔPSI|的ase对应于EBNA1表达时剪接状态的显著改变。只有|ΔPSI|≥10的ase才被认为被EBNA1表达修饰。为了确保从电泳图中选择正确的同工异构体，所有高|ΔPSI|的ase都是手动筛选的。通过对电泳图进行精确峰分配的目视检查，89个酶的剪接模式由于EBNA1的存在而发生了显著的改变(图2)。2一个;表中完整列表1)。例如，由CCDC62核受体辅激活剂LPPR5在表达ebna1的细胞中，两者都表现出从长形式的ASE到短形式的重要转变(图2)。2然而,b)。NTRK2它是一种参与MAPK信号通路的酪氨酸受体激酶，在表达ebna1的细胞中显示出从短形式到长形式的转变。附加的代表性电泳图在补充数据(附加文件)中描述1:图S1)。最后，还应该注意的是，使用空MSCV-N载体转染HEK293T细胞产生的结果与使用对照细胞系(附加文件)相似1:图S2)。

AS变化的表征

在表达ebna1的细胞中，AS谱被修饰的基因属于许多家族，具有广泛的活性。例如，编码ATP结合盒转运蛋白的转录本(ATP11A，ATP6V1C2)、免疫反应效应器(IL37，IRF7)、转录因子(我们，ZNF493)、RNA剪接因子及其调控因子(CLK1，CLK2，ZRANB2)、蛋白酶(CAPN9)，以及信号蛋白(BMP4，CD37)在表达ebna1的细胞中进行AS修饰。使用PANTHER对蛋白质类进行分析，揭示了这些基因编码的蛋白质活性的广泛多样性，其中水解酶和核酸结合酶是最丰富的(图2)。3.a).接下来，利用STRING network评估受EBNA1剪接调节的基因属于特定网络或通路的可能性。蛋白质-蛋白质相互作用显示出一个小而显著的网络(p= 0.03)，涉及RUNX2、PAX2、SYK、BMP4和ITGB1等(图2)。3.b).有趣的是，许多这些蛋白是转录因子或在形态发生和细胞分化中具有已知的作用。为了确定EBNA1是否靶向了特定的生物学作用，我们使用DAVID对KEGG通路和分子功能进行了基因本体分析。正如预测的那样，许多与癌症相关的通路，如PI3K-AKT通路，都是富集的，因为该试验专注于与癌症相关的基因(图2)。3.c).有趣的是，许多与粘附相关的术语，如局灶性粘附、ecm受体相互作用、细胞粘附分子(CAMs)和细胞粘附分子结合都被富集，这可能表明as对参与粘附的基因有优先调节作用。

AS的EBNA1调制解译

高通量研究揭示了细胞在特定条件/环境下发生的全局图景，从而可以同时揭示导致观察到的全局图景的各种分子机制。解剖这些机制及其对观察结果的贡献是这类研究的主要挑战。在目前的情况下，许多不同的机制可能解释EBNA1蛋白如何能够实现AS的调节，如图所示。4a.首先，EBNA1可以通过直接的蛋白-蛋白相互作用与剪接因子结合，从而影响剪接因子的活性和/或其与新生pre- mrna的结合。其次，EBNA1的表达会导致剪接因子表达的改变，从而干扰pre-mRNA上剪接因子增强和沉默的比例。最后，EBNA1可以与细胞核中新生的pre-mRNA结合，从而阻止剪接因子的结合和/或充当剪接增强剂或抑制剂。值得注意的是，EBNA1与剪接因子的相互作用先前已被证明，因为EBNA1能够结合hnRNPH1剪接因子[28]。既然第一种可能性已经被证明了，我们就把重点放在后两种可能性上。

在之前的研究中，我们发现ebv阳性胃癌中，与健康组织相比，几个剪接因子的表达发生了变化[28]。为了研究EBNA1破坏剪接因子表达的可能性，我们在HEK293T和HEK293T-EBNA1细胞中评估了剪接因子(SF)的蛋白水平。我们检测了来自hnRNP家族(hnRNPA1和hnRNPH1)、SR家族(SRSF2、磷酸化-SRSF2、SRSF3、SRSF6、SRSF9和SRSF10)以及一般SF (ESRP1、FOX-2、RBM23和SF1)的各种SF。Western blotting蛋白水平分析清楚地表明，EBNA1使SF1、RBM23、hnRNPA1和FOX-2的丰度降低了1.5 ~ 4倍(图2)。4b).然而，在EBNA1表达后，hnRNPH1、p-SRSF2、SRSF3、SRSF6和SRSF10的蛋白水平保持不变。具有代表性的SRSF3蛋白Western blot结果如图所示。4b.注意，对ESPR1、SRSF2和SRSF9的Western blots检测结果不确定。这些剪接因子(SF1、RBM23、hnRNPA1和FOX-2)的基因表达水平也通过qPCR进行了量化，但未能检测到EBNA1对这些基因的转录作用有统计学意义(图2)。4c)，提示EBNA1的表达可以在蛋白水平上通过影响剪接因子的翻译或稳定性来改变特定剪接因子的表达。

ebna1结合RNA的rip测序

最后一种解释EBNA1调节AS的可能性涉及EBNA1直接与mrna结合。有趣的是，先前已经证明EBNA1能够结合RNA和RNA g -四重体(G4)结构(即由堆叠的鸟嘌呤四重体形成的富含鸟嘌呤的二级结构)[35，43，44]。此外，EBNA1 mRNA含有这样的G4结构，导致假设EBNA1可以结合自己的mRNA [35]。这提出了EBNA1可能以序列或结构依赖的方式与细胞核中新生的前mrna结合，潜在地改变细胞转录物的剪接的可能性。为了找出EBNA1是否与剪接被调节的mrna结合，我们对表达EBNA1的HEK293T和HEK293T细胞进行了RIP-seq。附加文件中概述了RIP-Seq协议的流程图1:图S3。进行了大量的实验对照，以确保恢复高质量的RNA测序。首先，免疫沉淀通过Western-Blotting验证，显示EBNA1蛋白仅在表达EBNA1的细胞中有效免疫沉淀(附加文件)1:图S4)。总裂解物也被处理成IP部分，然后在Agilent纳米芯片上通过核糖体28秒/18秒的比率评估RNA降解。获得满意的RNA完整性数(EBNA1细胞为9.2;8.9为对照细胞)，因此揭示了非常有限的RNA降解导致的实验过程(附加文件1:图5)。免疫沉淀部分也显示28S和18S核糖体rna的强峰，可能是由于在免疫沉淀过程中携带了大量的rRNA1:图5)。为了确保合适的测序深度，使用Illumina Ribo-Zero对这些rnas进行了去除。耗尽后，样品完全不含rRNA，从安捷伦纳米芯片分析的结果可以看出(附加文件)1:图S6)。建立图书馆，然后评估图书馆的质量;结果显示在附加文件中1图S7。测序后，从两种条件下获得了超过2000万个高质量的reads。为了确定RIP数据中的富集峰，使用标准的生物信息学方案对reads进行处理(使用Trimmomatic进行修剪，在hg38基因组上使用STAR进行比对，使用samtools rmdup进行PCR和测序重复去除，使用RIPSeeker进行峰调用)。分析得到503个峰，对应527个独特的注释;结果可在线获得原始读数(GEO系列登录号GSE107808)。为了确保足够的严谨性，使用严格的统计阈值对数据进行过滤:benjamin -correctedP-值小于0.05;错误发现率小于0.1;EBNA1数据集的计数高于对照数据集，相对于对照数据集的富集倍数大于1.5(图2)。5a).进一步使用这些区域的读取覆盖率进行人工管理，确定了12个假阳性峰，将可能与ebna1结合的rna列表缩小到50个。人工管理还允许验证峰的真实位置，并进一步分离重叠组蛋白的峰HIST1H2AC和HIST1H2BC分成两个分开的峰。表S3显示了手动管理的峰值的完整列表。有趣的是，绝大多数这些注释对应于蛋白质编码基因(94%)，其余的是两个假基因和一个非编码RNA(图2)。5b).使用DAVID生物信息学数据库进行的基因本体分析显示，与核糖体生物发生、翻译和染色质组织相关的生物过程中富集(图2)。5c、Bonferroni调整p值< 0.05)。细胞腔室和分子功能分析证实，EBNA1结合转录本中富集了编码核小体和核糖体蛋白的基因，以及具有核糖体结构成分和聚(A) RNA结合等功能的基因。有趣的是，粘附一词也丰富了，正如之前在EBNA1对as的调制中所看到的那样。3.)。这可能表明EBNA1可以通过AS调节和直接RNA结合来靶向这一途径。为了进一步验证这些结果，我们在HEK293T和HEK293T- ebna1细胞的生物复制体中进行RIP实验，并使用qPCR定量免疫沉淀rna的水平。将每个免疫沉淀归一化为其输入RNA，并比较表达EBNA1的细胞和对照细胞中11个EBNA1相互作用物的相对表达，这些相互作用物是我们的ip - seq实验预测的。当EBNA1存在时，免疫沉淀rna的水平在统计学上更高HIST1H2BJ，HIST1H4H，RPL10A,RPS3AP6(无花果。6a)，因此表明EBNA1能够与细胞rna如mRNA (HIST1H2BJ，HIST1H4H，RPL10A)和非编码RNA (RPS3AP6)。对于其他7个预测的EBNA1靶点，无法像RIP-Seq预测的那样证明结论性的统计学富集。然而，RIP-Seq预测的EBNA1结合靶点都不属于在EBNA1表达后剪接被调节的已鉴定基因(表2)1和附加文件1表S3)。由于我们之前只关注了大约1500个AS，一种可能性是EBNA1结合的转录本不在我们最初的AS筛选范围内。为了评估EBNA1结合转录本通过EBNA1相互作用调节剪接的可能性，我们分析了RIP-Seq测定的51个相互作用区域，以寻找潜在的ASE区域。其中3个区域覆盖外显子盒，另外3个区域跨越两个外显子之间的内含子(可能存在内含子保留)(表S2)。在这些与EBNA1结合的潜在ase上设计的RT-PCR未能验证这些区域剪接结果的任何变化(图2)。6b).因此，这些发现表明EBNA1不通过直接结合细胞mrna来调节AS，但提供了EBNA1结合细胞mrna的明确证据在cellulo。

先前的研究已经表明，EBV可以通过几种不同的机制干扰细胞基因的剪接。例如，病毒SM蛋白作为剪接因子，招募SRSF3来调节剪接，并与SRSF1竞争rna结合。唯一已知的受SM影响剪接的基因是STAT1，其中SM能够支持STAT1β亚型，这是STAT1α的显性负抑制因子[17，18]。此外，EBV在潜伏感染期间表达两种长链非编码rna EBER1和EBER2。EBER1未被证明影响细胞基因的剪接，但由于它与AUF1/hnRNP - D剪接因子相互作用，因此很可能影响细胞基因的剪接[19]。两种EBERs在细胞中的表达都会导致细胞基因的表达和剪接发生显著变化，但未研究单独表达EBER1和EBER2的作用[20.]。目前的研究是第一个使用高通量方法观察AS修饰的研究，旨在了解单个EBV分子(蛋白质或RNA)如何影响宿主细胞中的AS模式。然而，这样的实验最终应该在不同的细胞环境中重复，如B细胞和上皮细胞，以便更好地理解细胞类型特异性的变化，而不是那些普遍存在的变化。这些研究也将对这些变化背后的机制以及在EBV感染中更精确的作用提供重要的见解。此外，本文关注的是与癌症相关的基因，但使用RNA-Seq观察整个细胞AS的更广泛的方法，因为它最近被用于病毒感染的背景下，可能已经确定了更多由EBNA1调节的ase，这是当前方法的缺点之一[9，10]。然而，尽管我们的结果是有限的，但它们建立了足够的证据来证明后续研究使用高通量测序技术，敲除试验来确认反向表型，并在其他细胞系中表达EBNA1以进一步验证这些发现。

在表达ebna1的细胞中，一些剪接改变的基因在病毒癌变和复制方面特别有趣。例如，calpain CAPN9在胃癌中被证实下调[45，46]，这导致了这种蛋白质可能作为肿瘤抑制因子的假设。EBNA1的调制CAPN9剪接(ΔPSI = 19)可以影响表达蛋白的水平或其异构体比例。由于已知EBV与胃癌有关，剪接修饰可能是降低CAPN9蛋白水平的另一种方式，但在转录后水平。这一领域的进一步研究对于更好地理解病毒的致癌作用具有很大的潜力。另一方面，EBNA1也调节先前已知的在其复制周期中有潜在影响的基因剪接。IRF7是已知的抗病毒免疫的关键角色，它与EBV的BamHI Q启动子(Qp)结合[47]。这种相互作用抑制Qp下游EBNA1基因的转录。然而，Qp启动子仅用于1型潜伏期，其特征是EBNA1的独家表达和低水平的IRF7蛋白。IRF7在III型潜伏期被另一种EBV蛋白LMP-1上调，导致Qp的IRF7失活。在这种类型的潜伏期中，其他启动子被用来转录EBNA1。这导致了IRF7可能参与EBV潜伏期调节的假设。EBNA1的修饰IRF7剪接(ΔPSI = 13)可能是通过IRF-7转录后调控调控EBV启动子使用的另一种方式。

目前的研究还利用高通量测序技术研究了与EBNA1结合的细胞rna的性质。我们的分析显示，相对较少的细胞rna可能与EBNA1结合。这部分是由于用于选择数据的统计过滤器的高度严格性。这也可能是由于实验的背景噪声和EBNA1蛋白的转录效应，即一些基因似乎在表达EBNA1的细胞中过度表达，从而可能导致更多的非特异性免疫沉淀RNA转录物。然而，我们验证了在EBNA1免疫沉淀过程中富集的四种不同rna(图2)。6a)主要属于RIP-Seq分析中富集的氧化石墨烯项，即组蛋白或核糖体蛋白的基因(图2)。5c)，证明RIP-Seq数据代表了EBNA1与细胞rna结合的生物学作用。有趣的是，这些rna在EBNA1 RIP中的富集程度相对较低。这一发现可能表明EBNA1与细胞RNA的结合要么是短暂的，要么是低亲和力的。一个有趣的假设是，EBNA1与细胞rna的紧密结合可能会使该蛋白在潜伏期远离其在EBV发作体复制和分离中的主要作用，因此对病毒潜伏期有害[36，44]。当不需要EBNA1维持病毒片段时(即不在细胞分裂期间)，研究EBNA1与细胞rna结合的作用将是有趣的。由于先前提出EBNA1可能与自身mRNA结合[35，48]，我们还研究了RIP-Seq数据，以质疑这种结合是否发生在细胞中。我们的研究结果表明，HEK293T-EBNA1中有近7000个reads来自EBNA1 mRNA，而在对照HEK293T中没有检测到reads(附加文件)1:图S8)。这表明EBNA1在细胞环境中与其自身mRNA相互作用。先前的研究表明，EBNA1可能与位于甘氨酸-丙氨酸重复序列(GAR)结构域编码序列中的g -四重体(G4)结合，即位于EBNA1编码序列的核苷酸270和984之间[35]。为了验证EBNA1是否确实拉下了其自身mRNA的特定区域，使用了与先前用于验证EBNA1结合mRNA (RIP-qPCR)相同的方法。引物设计用于扩增EBNA1编码序列的起始(37-131)、中间(1137-1278)和末端(1752-1837)区域(附加文件中红色部分)1:图S8)。然而，该实验未能验证编码序列中任何区域的富集(附加文件)1:图S8)。显然，需要进一步的研究来清楚地了解EBNA1与其自身mRNA的结合。研究EBNA1与细胞rna及其自身mRNA相互作用的动力学将有助于更好地了解EBNA1对ebv阳性潜伏细胞的影响。

令人惊讶的是，与高通量RT-PCR测定的基因相比，ebna1结合的rna的剪接没有差异(表2)1)与RIP-Seq峰(表S3)或通过对预测EBNA1将被RIP-Seq结合的ASE区域进行AS-PCR(图3)。6b).如图所示。4第三种假设是，通过与细胞rna的直接相互作用来调节AS是EBNA1可能潜在地改变细胞基因AS的一种方式。然而，我们的研究结果并不支持这一假设，并指出了另外两种被提出的机制(剪接因子表达的调节和与剪接因子的相互作用)是EBNA1用来调节as的机制(图2)。4a). EBNA1调节SF1、SF2、hnRNPA1和FOX-2等剪接因子表达的能力(图2)。4B和c)证实了第二个假设。然而，使用DREME进行差异基序富集分析[49在用于RT-PCR的引物对之间的序列上，与随机选择的89个不变的ase相比，在可能与as变化相关的序列中没有显著的富集。事实上，很可能所有这些SF表达变化的总和导致了选择性剪接的变化，因此对于我们分析的每一个ase，都存在一些剪接因子的特定组合，这些剪接因子的表达发生了变化，导致了AS的变化。这可能解释了为什么富集分析不能确定特定的基序。如前所述，EBNA1与剪接因子hnRNPH1相互作用[28(第一个假设)。需要进一步的研究来解释剪接因子表达的变化以及与剪接因子在细胞基因AS上的直接相互作用，以及EBNA1蛋白在EBV感染、潜伏期和癌变过程中如何利用这些特征。

在病毒感染和癌变的背景下，人们很容易推测，针对病毒诱导的剪接修饰的剪接开关寡核苷酸的发展可能有助于预防和治疗由病毒感染引起的疾病。这类工具的发展已经在加速，鉴定由病毒调节的剪接事件可能对病毒复制或癌变有影响，这可能是在这种情况下使用它们的第一步。

本研究表明，EBV EBNA1蛋白在细胞中的表达诱导了许多先前显示或怀疑与癌症有关的细胞基因的AS模式的变化。这些修饰可能对病毒癌变和EBV潜伏期有重大影响，因为它们可能改变表达ebna1细胞的蛋白质组多样性。总的来说，这些数据为更好地理解病毒与宿主的相互作用、疱疹病毒的潜伏期、病毒的致癌作用以及这些现象中剪接的含义铺平了道路。

我们要感谢Mathieu Durand、Elvy Lapointe和Philippe Thibeault在RT-PCR和AS-PCR分析、qPCR分析、文库制备和数据生物信息学处理方面的帮助。我们还要感谢Benoit Chabot和Johanne Toutant提供的针对fox2和hnRNPA1的抗体，以及Sonia Couture和Sherif Abou Elela提供的针对SRSF2的抗体。我们也感谢Vincent Boivin, Jean-Michel Garant和Scott实验室的其他成员在生物信息学分析方面的帮助。

资金

这项工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会(NSERC) (MB)的资助。SB拥有加拿大卫生研究院(CIHR)的Vanier加拿大研究生奖学金。

作者及单位

1. 加拿大舍布鲁克大学，舍布鲁克，舍布鲁克，舍布鲁克，舍布鲁克，舍布鲁克，魁北克，j1e4k8

   Simon Boudreault, Victoria E. S. Armero, Michelle S. Scott, Jean-Pierre Perreault和Martin Bisaillon

贡献

概念化、MB、SB、JPP和MSS;方法论、MB和SB;验证,某人;调查、SB和VESA;资源,MB;数据管理，SB和VESA;写作-原稿准备，SB和MB;写作—审编、SB、MB、JPP、MSS;可视化,某人;资金收购，MB, JPP和MSS。 All authors read and approved the final manuscript.

相应的作者

对应到马丁Bisaillon。

相互竞争的利益

作者声明无利益冲突。资助者在研究的设计中没有任何作用;数据分析:对数据的收集、分析或解释;在撰写稿件时，还是在决定发表结果时。

出版商的注意

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