犬瘟热病毒的趋向性及其分子发病机制

背景

犬瘟热病毒(CDV)，目前称为犬麻疹病毒属是一种极易感染狗的疾病。它被确定为一种多细胞趋向性病原体，其宿主范围包括大量的物种。作为Mononegavirales在美国，CDV有一个负的单链RNA基因组，编码8种蛋白质。

主体

在分子发病机制方面，血凝素蛋白(hemagglutinin protein, H)在抗原识别和病毒与SLAM、nectin-4等宿主细胞受体的相互作用中起着至关重要的作用。这些细胞受体作为CDV受体在体外不同细胞模型中被广泛研究。SLAM受体位于淋巴细胞中;因此，CDV感染这些细胞会导致免疫抑制，其严重程度可导致临床疾病的变异性，并有继发性细菌感染的可能，直至并包括在其后期出现神经体征。

结论

提高对涉及感染测定的CDV分子的理解，特别是H蛋白，可以帮助增强对广泛的CDV变体、它们的取向和病毒感染的不同步骤之间差异的生化理解。病毒蛋白和确定的宿主细胞受体之间的相互作用区域已被阐明，以促进这一理解。因此，本文综述了CDV的重要分子和细胞特征，这些特征有助于病毒的发病机制。

犬瘟热病毒(CDV)，目前称为犬麻疹病毒属，属于副黏液病毒科家庭,属麻疹病毒属，是犬瘟热的病原[1］．自1760年以来，它被认为是一种高度传染性和犬类急性发热疾病[2］．它与多种细胞嗜性(上皮细胞、淋巴细胞和神经细胞)有关，从而导致全身感染，包括呼吸、消化、泌尿、淋巴、皮肤、骨骼和中枢神经系统(CNS)疾病[3.］．

CDV的寄主范围主要包括该目的种食肉类哪些属于家庭犬科动物(狗，澳洲野狗，狐狸，土狼，豺狼，狼)，浣熊科(浣熊,长鼻浣熊),鼬科(黄鼠狼，雪貂，渔夫，水貂，臭鼬，獾，貂，水獭)，熊科(大熊猫),Ailuridae(小熊猫)，家庭成员广泛猫科(狮子，豹子，猎豹，老虎)，在一个小的扩展，其他重要的科属于不同的目的，如偶蹄目，灵长类动物，啮齿目,长鼻类［2，4］．考虑到受CDV影响的物种数量众多，为了建立系统发育关系，研究了野生动物和驯化物种之间的跨物种传播，以研究它们之间的相互作用[5］．

CDV颗粒是多形性的，通常是球形的，直径约为150nm的包膜病毒粒子，其中包括一个非节段的单负链RNA (ssRNA)，类似于该目的其他成员Mononegavirales(无花果。1a).基因组全长包含15,690个核苷酸，编码8种蛋白质[6(图。1b). CDV基因组结构包括以线性形式组织的6个转录单元(N-P-M-F-H-L)，这些转录单元由长度相对均匀的基因间非翻译区(UTR)隔开，除了基质(M)和融合(F)基因之间的UTR [7］．这些转录单位有助于上述八种蛋白质的形成。然而，P基因编码C和V蛋白，分别使用重叠的开放阅读框(ORF)和RNA编辑，在mRNA合成过程中插入一个非模板G残基[8，9］．这两种替代基因表达策略不仅具有与转录控制和复制相关的功能，而且在病毒逃避宿主的先天免疫反应中发挥重要作用[10，11］．

所有蛋白质都具有与病毒周期和复制相关的特定功能，核衣壳(N)蛋白包裹着基因组RNA，以CDV基因表达为基础，N作为病毒聚合酶(称为L)及其辅因子磷蛋白(P)转录复制的模板。N、P和L蛋白与病毒RNA一起组成核糖核蛋白(RNP)复合体[12］．CDV包膜包括两个完整的膜蛋白，融合(F)蛋白和血凝素(H)蛋白，以及最后一个膜结合蛋白M，它通过介导与RNP的接触而起作用，在宿主细胞膜的出芽过程中被病毒包膜包围[8］．这种认识主要是通过逆向遗传学来实现的，它使人们能够构建嵌合病毒，并将其应用于发病机理研究、疫苗开发和基因治疗载体等不同领域[13］．

和其他成员一样副黏液病毒科家族中，H糖蛋白促进病毒与宿主细胞膜结合，F蛋白实现病毒与宿主膜融合，使病毒RNP进入细胞质[12］．关于CDV宿主的细胞识别和病毒进入，已经描述了两种细胞受体，其中包括外周血单个核细胞中的SLAM(信号淋巴细胞激活分子或CD150) [14]和上皮细胞中的果胶-4 (PVRL4) [15］．也有人推测Nectin-4可以帮助病毒进入呼吸道。16］．基于星形胶质细胞上没有检测到SLAM或nectin-4受体，推测CDV使用另一种受体侵入这些细胞，尽管这一潜在的CDV第三种受体尚未被确定[17］．

H蛋白已成为研究CDV变异和进化最合适的靶点。它被认为是遗传变异最大的基因，在CDV毒株之间有高达11%的核苷酸差异。这一事实使得分别基于遗传分化和分子流行病学进行CDV系统发育和系统动力学研究成为可能[12，18］．基于在全球不同地理位置检测到的几种CDV毒株H基因的完整序列，已经进行了系统发育研究，以推断CDV的遗传多样性。基因分型分类考虑到每个基因型内的核苷酸差异应小于5% [19］．按照这一标准，迄今为止已经描述了17种不同的基因型:美洲-1(包括几乎所有商业上可用的疫苗株)、美洲-2至5、北极、岩本样、亚洲-1至4、非洲-1和2、欧洲野生动物、欧洲/南美洲-1、南美洲-2和3(图2)。2) [20.，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30.］．

关于CDV疫苗接种，一种减毒的CDV疫苗于20世纪50年代发布，它的广泛使用帮助控制了许多国家的CDV疾病[2］．然而，在过去的几十年里，犬类数量的增加导致了零星病例和大规模的CDV疾病爆发，即使在已经接种疫苗的动物中，包括家养动物和野生动物[31，32］．有人认为，疫苗株与流行野生型株之间的抗原差异可能是致病因素之一[33]，因为最近几天CDV基因型的数量有所增加。

CDV被认为是一种替代模型麻疹病毒(MeV)，这是一种密切相关的麻疹病毒。两种病毒引起的总体发病机制相似。然而，人类和非人类灵长类动物是MeV的唯一储存库[8］．因此，有必要在MeV实验数据的基础上对CDV的发病机制和趋向性进行广泛的研究，以阐明由病毒进化和逃避宿主先天免疫反应导致的偶尔CDV暴发的原因。

这些病毒模型之间的等价性以及逆向遗传研究等方法的存在使得利用重组病毒来评估病毒基因组变化的影响，特别是关于病毒生命周期和分子发病机制方面的影响。虽然逆向遗传学应用于病毒属于Mononegavirales然而，随着新技术的应用，救援效率不断提高，使其成为研究包括CDV和MeV在内的病毒生物学基本方面的合适工具。这包括研究病毒进入细胞和在细胞间传播的分子决定因素，以及开发减毒活疫苗载体[34］．

最初，CDV是从基于Onderstepoort菌株的全长cDNA克隆中抢救出来的，类似于先前对MeV和所做的牛瘟病毒，获得与Onderstepoort株在疾病进展和合胞体形成方面无差异的重组CDV，除了在L蛋白编码区引入由两个核苷酸变化组成的遗传标签[35］．在细胞培养物和动物模型中，将绿色荧光蛋白(GFP)引入cDNA克隆以研究病毒感染已被证明在MeV研究中非常有用[36，37］．对于CDV，具有神经毒力的Snyder Hill菌株获救，表达增强的GFP (eGFP)或红色荧光蛋白(dTom)，能够对病毒在体内的传播途径进行敏感的病理评估;这表明病毒如何迅速绕过脑脊液屏障，并诱发严重的病毒性脑膜脑炎[38］．一种对雪貂具有高致病性的野生型菌株5804也被拯救出来，表达GFP，保持完全的毒性，并照亮了通过受感染宿主免疫系统的淋巴细胞途径[39］．麻疹病毒受体SLAM和nectin-4在传播中的作用也通过反向遗传学进行了评估。H基因残基突变的重组CDVs (rCDVs)无法识别其中一种受体(SLAM-blind和nectin-4 -blind)，被生成并接种于雪貂，表明SLAM和nectin-4受体都是传播所必需的，证明了在CDV发病和传播中连续使用这两种受体的重要性[40］．通过使用表达多色荧光蛋白(绿色、红色或蓝色)的重组病毒进行体内竞争和传播，评估病毒进入、宿主内传播和宿主间传播，表明CDV通过鼻子或肺接种时能够进入宿主，并且通过结膜注射感染宿主，尽管效率较低，但也有可能[41］．然而，反向遗传学不仅有助于了解蛋白质在病毒生命周期、传播和传播中的作用等分子机理，而且有助于疫苗载体的开发。表达CDV糖蛋白H单独或与F蛋白联合的病毒载体已被测试为减毒活疫苗，而基于表达H和F蛋白的金丝雀痘载体的一种疫苗已上市。重组NYVAC痘苗病毒和表达CDV H/F的ALVAC金丝猴痘病毒已经过测试，两者均可预防症状性犬瘟热的发展[42］．狂犬病毒(RABV)也是一种高效、安全的重组(rRABV)二价疫苗的生成平台，也表达H/F CDV蛋白。只表达H蛋白的减毒rRABV-CDVH可在犬体内对强毒性CDV的攻击提供全面保护[43]，而使用灭活版本的类似方法只能在雪貂的野生型挑战后产生部分保护。然而，表达H/F蛋白的灭活rRABV完全保护雪貂免受致命的CDV挑战，证明了针对F蛋白的免疫反应在控制CDV和其他麻疹病毒感染方面的关键作用[44］．相反，CDV也被用作RABV G糖蛋白表达的病毒载体。动物研究表明，rCDV-RVG对小鼠和狗的挑战是安全有效的[45］．

临床结果

从临床特征看，当犬感染CDV时，可观察到卡他性和神经性表现，或两者兼有，慢性神经性表现。在急性期，病毒可在给定动物的每一种分泌物中发现[46］．这一阶段之后出现各种临床症状，包括皮肤皮疹、严重的鼻及眼分泌物、结膜炎及厌食，随后出现胃肠道及呼吸道症状，这些症状常伴有继发性细菌感染及神经系统疾病[2，47］．

神经体征包括肌阵挛、眼球震颤、共济失调、姿势反应障碍、四肢瘫痪或瘫痪[48，49］．然而，改善免疫系统可促进动物康复，主要是通过增加病毒特异性中和抗体的产生[50］．尽管病毒从不同的器官和外周血中被清除，但CDV可以留在一些组织中，包括葡萄膜、中枢神经系统、淋巴器官和脚垫。此外，一些受感染的动物表现出发育迟缓和患病，并有中度免疫反应，并有一些难以察觉的早期临床症状[51］．

在病毒感染中枢神经系统后，可以感觉到一些紊乱。一般来说，患有中枢神经系统疾病的狗无法存活。然而，有些人可能会康复，并出现终生的神经系统症状[3.］．脱髓鞘性白脑炎(DL)也常在疾病的晚期由CDV引起，就免疫病理过程、胶质反应和早期轴突变性而言，CDV引起的DL与其他引起脱髓鞘的疾病(如人或动物模型中的多发性硬化症)具有某些共同特征[52］．先前的研究表明，CDV感染的慢性阶段产生DL [3.］．病毒滴度的降低，成熟的改变，星形胶质细胞的可塑性，原发性轴突病变，以及雪旺细胞介导的再生的可能作用是DL的关键事件[3.］．当病毒能够扩散到大脑的某些区域而不引起炎症反应时，可以用一些CDV毒株观察到病毒在中枢神经系统中的持久性，例如A75/17毒株。已知该菌株感染细胞系的效率非常低，合胞体形成有限[53］．

CDV蛋白及其在发病机制中的作用

CDV基因组在6个转录单位内编码8种蛋白质。CDV蛋白在病毒复制和感染周期中具有特定的活性。N蛋白不仅是RNP螺旋结构的基础，而且在一些病毒复制过程中也是必不可少的[54］．在其多种功能中，N蛋白保护基因组免于降解，避免在相反极性的病毒RNA之间形成dsRNA，并将RNA包装成RNP。此外，由于其与RNA和L蛋白的动态相互作用，它控制了模板RNP内RNA的L通路，并使子代RNP的组装成核。因此，N蛋白由于与基因组RNA相互作用[36]同时控制复制过程和转录过程[49］．另一方面，L蛋白表现出聚合酶活性，由病毒颗粒携带。P蛋白作为它的辅因子，有两个基本功能。一是识别RNP作为聚合酶模板，二是稳定新生N蛋白[54］．

H和F蛋白的主要功能是介导CDV与宿主细胞的识别、附着和融合过程。附着蛋白H缺乏在其他病毒中观察到的神经氨酸酶作用，它附着在宿主细胞质膜上的受体上，如神经胶质细胞中的SLAM、nectin-4和其他[55］．此外，M蛋白在CDV颗粒的组装和出芽过程中至关重要，通过M与N的C端和N端以及H和F蛋白的细胞质尾部相互作用，在RNP和糖蛋白表面之间起中介作用[56］．V和C蛋白在病毒复制过程中不是必需的，但对于防止宿主免疫反应至关重要。因此，它们之间的合作行为对于有效地逃避宿主的免疫反应并在体内引起疾病至关重要[57］．

因此，除了CDV蛋白的功能外，重要的是要提到所有的分子相互作用取决于分子的性质和氨基酸序列，它们共同定义了所有的蛋白质功能。这些因素不仅影响宿主细胞的反应，而且影响CDV感染周期，清楚这一分子过程对于理解CDV细胞向性和发病机制至关重要。在接下来的段落中，我们将进一步详细介绍每种CDV蛋白在病毒复制、生命周期和发病机制中的作用。

感染周期

基于F和H糖蛋白的存在，CDV可以通过由四聚体H和三聚体F组成的异低聚复合物成功地突破质膜，质膜被认为是宿主的第一道细胞防御屏障。H糖蛋白通过识别特定的氨基酸，广泛参与与特定宿主细胞受体的相互作用。最近的研究表明，在F的球状头结构域中存在一个中央口袋，调节F三聚体亚稳、预融合构象态的稳定性[58］．这种相互作用是由位于F球状头结构域的ig样结构域的两个疏水残基介导的，这有助于受体与H柄的膜近端结构域之间的相互作用[46］．此外，据报道，由H四聚体获得的f触发刺激的强度受H蛋白的起源和接触受体的分子性质的影响[58］．这是由于关键残基位于诱导这种融合机制的步骤中涉及的前h结合位点[59］．蛋白质复合体的这种结构重排有助于病毒附着在细胞膜表面，形成融合孔，进而将RNP复合体引入宿主细胞质。病毒在细胞间的传播也需要膜融合，从而形成称为合胞体的多核细胞，这是麻疹病毒的一个显著的细胞致病特征[60］．

所有CDV的复制和转录策略都与该家族的其他成员相似Mononegavirales顺序，如图所示。3.［61］．聚合酶复合体由两种不同的蛋白质组成:亚基L，其结构域参与RNA合成、盖帽和盖帽甲基化，以及磷蛋白P，与L的功能有关的基本辅因子。62］．

CDV基因组模板的一个重要特征是与核蛋白N有关，即构成螺旋核衣壳并形成N- rna结构[63］．当聚合酶进行时，它识别开始和结束基因信号，并产生6个亚基因组mRNA。因此，在开始基因信号时，聚合酶开始mRNA的合成，在结束基因信号时，它释放合成的RNA。然后，聚合酶检测基因间区域以定位下一个起始基因信号。这一过程对每个基因都进行，有证据表明甲基帽的添加和聚a，这两者都是聚合酶转变为拉长模式所必需的[63，64］．有趣的是，P ORF也具有RNA编辑形式，其中RNA转录酶在RNA编辑基序的RNA模板上犹豫，导致伪模板鸟嘌呤的添加。因此，V蛋白具有与P蛋白相同的氨基末端结构域，但具有不同的羧基末端结构域。与V蛋白相反，C mRNA的转录始于另一个起始密码子[64］．

如前所述，麻疹病毒基因组由6个转录单位组成，这些转录单位由长度相对一致的非翻译区(UTR)隔开(约100至200个核苷酸)，但M和F基因之间的UTR至少长3倍且高度可变[65］．已有文献证明CDV的f5 ' UTR在翻译异常长的F信号肽(FSP)中至关重要[66］．该信号与经典信号序列有很大不同，因为该区域在体外和体内(在雪貂疾病模型中)都具有调节功能，这表明CDV M和F基因之间的区域通过控制F蛋白的表达来调节毒力[67］．另一方面，在野生型cdv - m3 ' UTR[中发现了一个短的假定ORF [68］．m3 ' UTR的近端部分调节病毒基因组复制的开始，并参与疾病在雪貂中的延长延伸，这表明特定的序列元素和一般长度都需要维持野生型毒力[65，69］．

与MeV复制周期相似，M蛋白的组装至关重要，它在病毒粒子的组装和出芽中起着重要作用，被认为是RNP和表面糖蛋白之间的中介，并协调病毒粒子的组装过程[56，70］．在宿主感染细胞的质膜的特定区域，RNP和糖蛋白通过病毒和细胞因子的协调相互作用形成完整的感染性CDV颗粒[71］．经证实，N蛋白的c端是其与M蛋白相互作用的基础;其内部的突变或缺失抑制了RNP复合物通过感染向质膜的运输，这证明了M蛋白在RNP复合物整合到CDV颗粒中的重要性[71］．对于MeV，已证明M蛋白的突变或整个蛋白的缺失会减少病毒的组装并影响发病机制[70］．基于这些事实，考虑到副粘病毒M蛋白足以形成病毒样颗粒，在其他蛋白缺乏的情况下，M蛋白导致CDV组装和出芽[71］．CDV出芽被认为独立于宿主细胞出口运输所需的细胞内体分选复合物(ESCRT)机制，特别是由CDV M蛋白进行[72］．

最后，F蛋白和H蛋白被认为是在细胞内环境中组装的。M蛋白附着在细胞质中的RNP复合物上，并将其携带到质膜，在质膜中，F和H蛋白与出芽病毒颗粒聚集在一起。这可能与观察到CDV包膜蛋白H和F被分割成细胞抗洗涤剂膜(DMRs)有关，DMRs可能形成膜筏的结构基础。因此，脂筏在病毒组装和释放中的作用被提出，因为存在病毒包膜胆固醇的必要性，因为含有CDV包膜蛋白的细胞膜中胆固醇的消耗导致合胞体形成减少。因此，包膜蛋白与drm的结合及其与胆固醇的相互作用可能是病毒进入和释放所必需的[73］．此外，已证明CDV H细胞质结构域的前10个残基强烈影响其与由CDV基质(M)蛋白形成的病毒样颗粒的结合。此外，这一结构域是确保新生蛋白正确易位到内质网以遭受翻译后修饰所必需的[74］．

向性与发病机制

CDV被认为是一种多细胞病原体，能够感染三种不同类型的宿主细胞，包括上皮细胞、淋巴细胞和神经细胞。感染不仅可因吸入气雾剂液滴或空气中的病毒颗粒而发生，也可因直接接触体液或通过污染物而发生[41］．作为一种影响大量器官和组织的系统性感染，一些CDV宿主细胞受体已被广泛研究，如SLAM，它在活化的T-和B-淋巴细胞以及树突状细胞(dc)和巨噬细胞上表达。它们的行为类似于麻疹病毒的常规进入受体。其他被广泛研究的受体包括nectin-4，它被认为是一种上皮细胞受体，目前被认为是一种宿主出口受体[75，76］．

基于MeV，在宿主感染的第一阶段，呼吸道中的常住dc和肺泡巨噬细胞与肺泡腔中表达CD150的其他细胞一起被感染[64］．与MeV类似，CDV H蛋白通过CD150细胞受体附着在细胞上[77］．据信存在细胞内CD150库转位到细胞膜表面。被感染的细胞携带病毒到引流淋巴结，然后在那里被激活的t细胞和b细胞通过CD150受体被感染，导致病毒扩增和原发性病毒血症的开始(图。4) (78］．病毒扩散到次级淋巴器官，包括脾脏、胸腺、扁桃体[39]然后在整个免疫系统中进行系统性传播。除了对非特异性淋巴细胞的抑制外，白细胞(WBCs)或白细胞数量的下降是显著的(白细胞减少)，当CDV在整个免疫系统中传播时，非特异性淋巴细胞持续增加[79］．由于在这个感染点外周血单个核细胞(pmcs)中检测到的感染水平并不显著;这类免疫细胞迁移到感染部位一定是导致白细胞减少和病毒诱导细胞死亡的一个重要因素。这种免疫抑制可引起一些机会性感染和继发感染，从而导致麻疹病毒的发病率和死亡率[80］．

病毒传播到远端部位，包括肝脏、皮肤、胃肠道、生殖器和呼吸道粘膜表面，导致病毒扩散并随后传播到未感染的个体(图2)。4b) (78］．在整个呼吸道中，CDV感染被认为是通过循环中CDV感染的T、B和dc的迁移而发生在管腔上皮基底外侧[39］．此时，nectin-4位于粘附连接内，并与病毒颗粒相互作用，病毒颗粒被携带到这些受感染的淋巴细胞表面，从而使病毒能够进入上皮细胞。CDV通过其顶端表面从上皮细胞排出。在没有nectin-4的情况下，CDV仍然是嗜淋巴性的，并产生原发性和继发性病毒血症。因此，上皮受体结合的病毒无法从呼吸途径传播，这表明蜜胶-4在感染后期而不是在感染初期的病毒排出中起着重要作用[16，39，81］．

先前的一项研究报道，通过上皮受体感染CDV是发生临床疾病所必需的，但对免疫抑制不是必需的，这源于这样一个事实，即在动物接种了上皮受体盲CDV菌株(缺乏上皮细胞受体识别域)后，它们没有表现出任何临床症状。然而，免疫细胞迅速有效地扩散，产生相同水平的白细胞减少和抑制淋巴细胞增殖活性，这是麻疹病毒免疫抑制的信号[82］．此外，已通过雪貂体内实验证实，在大多数感染了通过逆向遗传系统获得的SLAM或nectin-4-盲CDV菌株的动物中，传播并不明显，尽管所有感染了nectin-4-盲病毒的动物都出现了持续的病毒血症。指出上皮细胞感染和顺序CDV H蛋白相互作用(开始时与SLAM，然后与nectin-4受体)对于向幼稚宿主传播的重要性[40］．这一事实也强调了体内选择压力对CDV H蛋白与SLAM受体相互作用的重要性。

在感染后6 - 10天结束时，呼吸和胃肠道临床病理是最常见的体征，并伴有皮疹(CDV的典型症状)，其形式为直径在3 - 8毫米之间的红斑斑块。颈部和面部是最先受到影响的身体部位。随着感染的进展，口腔周围出现越来越多的斑块[64，79］．此外，皮肤成为病毒的另一个目标。与其他麻疹病毒相似，CDV可以感染多种物种的表皮细胞。足垫角化细胞通常被感染，因为在足垫活组织检查中显示病毒抗原可作为CDV的诊断[83］．

Neuropathogenesis

CDV也被研究为一种神经性药物;大量的毒株可导致脊髓灰质炎脑炎，其中几个毒株主要产生DL。正如人们所相信的那样，CDV必须以不同的方式到达大脑，迄今为止已经提出了一些感染途径。神经入侵最重要的途径之一是通过受感染的pmbc扩展，这些pmbc通过血脑屏障运输;随后，病毒释放，导致驻留的上皮细胞和内皮细胞感染[3.］．在体内，使用小鼠感染模型，已经证明CDV感染通过感染脑室壁的神经室管膜细胞以及毗邻脑室区的海马和皮层的神经元，从循环的脑脊液通过顺序途径进入中枢神经系统。然后它会引起大脑表面的广泛感染，然后是实质和皮层[84］．

然而，在雪貂中，已经证明CDV可以通过位于嗅觉粘膜的神经元进入大脑，入侵嗅觉神经丝、嗅觉肾小球和更深的中枢神经系统结构。如前所述，细胞受体有助于神经病理包括nectin-4(图。4c) (78]三分之一在星形胶质细胞中[85]，由于SLAM受体在中枢神经系统中表达不足[3.，86］．此外，据报道，病毒持久性和神经疾病与星形胶质细胞中病毒细胞间传播的CDV有关，这使得病毒能够避免免疫系统的检测。这种CDV感染是基于被感染者和目标星形胶质细胞之间的膜融合，预示着病毒核衣壳的自由通过[87］．此外，已有研究证明，功能性异寡聚病毒H/F复合物以及膜融合是CDV在原代星形细胞培养物中传播所必需的[88］．因此，中枢神经系统、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、室管膜细胞、脉络膜丛细胞，以及如对CDV最严格的研究所证明的，包括一些具有雪旺细胞样结构的特化大胶质细胞在内的促进生长的胶质细胞家族可被感染，从而导致神经CDV感染的发展[47］．

值得一提的是，作为CDV神经病理学的一个暗示，DL的早期阶段是直接病毒介导的损伤和CD8+细胞毒性T细胞侵袭的结果，这与促炎细胞因子如白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-12的上调有关，并且缺乏免疫调节细胞因子如IL-10和转化生长因子(TGF)-β的反应。CD4 +介导的延迟型超敏反应和细胞毒性CD8+ T细胞导致慢性期髓鞘损失。此外，在晚期病变中，干扰素-γ和IL-1必须上调[47］．一旦狗克服了由CDV感染引起的免疫抑制，就可以注意到免疫介导的脱髓鞘，就像MeV在人类中所做的那样，以及包括体脑炎的某些方面。因此，老狗脑炎发生在一个人从CDV感染中恢复很长一段时间后，并与MeV亚急性硬化性全脑炎有相同的临床和病理特征[64］．

宿主-病毒与免疫系统的相互作用和逃避

V和C蛋白在CDV发病机制中的作用仍是研究人员的兴趣所在。研究表明，它们与CDV的发病机制和对抗宿主干扰素(INF)反应有关。先天免疫和病毒介导的免疫抑制的关联影响感染的发展[64］．免疫反应最初是通过模式识别受体(PRR)诊断病原体相关分子模式(PAMPs)激活的，包括toll样受体、黑色素瘤分化相关因子5 (MDA-5)、视黄酸诱导基因(RIG)- i样受体和核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLRs)。通过PRR对病毒感染的定义引导我们使用干扰素调节因子(IRF)-3、IRF7和活化B细胞的核因子κ轻链增强子(NF-κB)。因此，不仅观察到I型IFN的产生，而且还观察到炎症细胞因子[64]也被识别出来。

一般来说，对于副黏液病毒科家族，V蛋白与RIG-I样受体MDA-5和LGP2相互作用，提示RIG-I-和MDA-5介导的抗病毒反应的阳性调节因子，旨在抑制IFN的诱导。此外，病毒通过与其他细胞因子相互作用而逃避MDA-5的检测[64］．通过使用体内模型，有报道称CDV的V蛋白在抑制pmcs中IFN-α/β诱导和其他重要细胞因子如肿瘤坏死因子α (TNF-α)、γ IFN、IL-6和IL-4等控制细胞和体液免疫激活中起关键作用[11］．使用神经致病性CDV A75/17毒株进行的详细分子分析表明，V蛋白特异性地削弱STAT1和STAT2的核输入，而不影响其激活的磷酸化状态[89］．此外，IFN-α/β依赖信号的抑制与V蛋白与V的n端和c端区域的STAT分子有效相互作用的能力相关，在IFN逃避中发挥协同作用[89］．此外，V蛋白的一个结构域(由于其替代基因表达而与P蛋白共享)可以阻碍I型和II型IFN反应。这种作用归因于氨基酸110和130与酪氨酸110，酪氨酸110是一种与信号传感器和转录激活因子1 (STAT1)分子结合的必要氨基酸。据报道，V蛋白的抑制导致I型IFN抑制作用的70%丧失，因为该区域通过与MDA-5相互作用直接抑制IFN-β的合成[90］．

通过系统诱变，揭示了天冬氨酸248和苯丙氨酸246对于抑制STAT2核易位都是必不可少的。相对而言，精氨酸235对副粘病毒的MDA-5干扰是必需的。因此，由于V蛋白与宿主细胞因子的关系，它对于麻疹病毒毒性的重要性，特别是与MeV和CDV相关的重要性已经得到证明。这也表明V蛋白序列可能在分子相互作用和调节宿主免疫反应中起着至关重要的作用[90］．

H蛋白结构是CDV向性的关键分子因素

H蛋白是一种附着蛋白，属于跨膜糖蛋白II型的单体，由一个小的n端胞浆尾、一个跨膜结构域和一个大的c端胞外结构域组成。该外畴被证实为位于中心空腔附近的茎和六叶(B1-B6) β-螺旋桨褶皱。每个叶片装有四股反平行β-薄片(S1-S4) [12，91］．据推测，H蛋白与靶细胞上的特定受体结合后，诱导柄结构域上的寡聚构象变化，进而可能转化为F激活。此外，外畴柄支持膜-远端立方头区域[58］．许多研究证明，副粘病毒附着蛋白柄结构域与F三聚体发生物理相互作用，并与F三聚体的大球状头结构域形成短程接触，从而形成H-F重叠关联模型，其中H头位于F头之上[92］．

此外，由于H蛋白被认为是CDV毒株中最易变的基因，分析CDV抗原表位在初始相互作用、毒力、宿主范围、免疫系统反应和中和中氨基酸变异的发生率是完全相关的[18］．一些比较研究表明，与其他CDV基因相比，不同菌株H蛋白的这种异质性与更高的遗传-抗原变异有关;因此，中和相关位点受到影响，然后观察到重要表位的干扰。H型CDV基因的这种遗传多样性打乱了新出现的CDV毒株的抗原性(这适用于目前用作疫苗的CDV毒株)，在意大利分离的CDV毒株证明了这一点[93］．

尽管SLAM受体在确定的免疫细胞中作为CDV受体被广泛研究，并与CDV介导的淋巴组织溶细胞感染相关的免疫抑制相关，但有证据表明，其他类型的受体必须促进CDV进入nectin-4，因为上皮细胞受体有助于CDV的多向性。与MeV类似，通过对CDV H蛋白的位点定向突变分析，已鉴定出该蛋白的11个残基，该蛋白可调节和介导上皮角质形成细胞的质膜识别和后路融合[94］．此外，SLAM受体与CDV H蛋白的特定区域结合，该区域包含500至550个氨基酸[94］．

总的来说，有几种机制可以了解H蛋白和宿主细胞之间的分子相互作用，作为CDV进入的中介。计算工具和定向突变的H蛋白是一些有用的策略，以研究这些类型的相互作用。关于计算生物学，遗憾的是，迄今为止还没有能够进行结构研究的结晶化CDV H结构[94］．因此，我们从参考菌株(GenBank代码:AAG15490.1)中建立了CDV H蛋白模型。数字5展示了基于MeV H蛋白结构(PDB代码:2RKC)，在modeler的帮助下通过同源建模构建的CDV模型。

H蛋白的结构研究证实了其与细胞受体相互作用位点的存在。SLAM受体与具有多个接触位点的区域相互作用[94，如图所示。5(95］．类似地，nectin-4受体也与CDV H蛋白建立了一些相互作用位点(图2)。5b) (95］．这些相互作用位点的报告基于MeV [95，96］．因此，有结构和功能证据表明，H表面表现为一个多受体结合域，并给出了高选择性的想法，这表明H蛋白和受体界面之间可能存在差异，这对于引导CDV进入和感染特定细胞至关重要[94］．

CDV作为一种潜在的跨物种制剂

到目前为止，还没有证据表明人类感染了CDV。然而，据报道，它可以从人类癌细胞系中分离出来，例如在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中观察到的那些癌细胞系。如我们所知，CDV有效地利用狗的SLAM受体，但对人的SLAM却不能。因此，与此相反，如前所述，存在于癌细胞系中的人类nectin-4也与CDV受体一样有效[57］．这一现象背后的解释是，人类、小鼠和狗之间的nectin-4序列存在微小的物种相关变异，以至于小鼠的nectin-4可以作为MeV的受体，而人类的nectin-4可以作为CDV的受体。然而，小鼠SLAM既不能作为MeV受体，也不能作为CDV受体，而且这种连接似乎是由该蛋白V环中的氨基酸序列决定的。97］．

nectin-4的V环也参与了病毒附着的过程。然而，与人类蛋白质序列相比，狗同源物的V结构域中只有3个氨基酸不同，小鼠的V结构域中只有6个氨基酸不同[75］．2013年，Otsuki等人证明Ac961 CDV株在人上皮细胞NCI-H358细胞中复制，表达nectin-4，并适应它们。令人惊讶的是，H蛋白的氨基酸变化并不需要适应。因此，利用人nectin-4的能力是野生型CDV菌株的内在表型特征[98］．2006年，在表达犬SLAM受体的Vero细胞中分离到CYN07-dV CDV株。经过系统发育分析，发现该毒株与中国CDV暴发期间观察到的毒株相似。然而，YN07-dV使用猕猴SLAM和猕猴nectin4受体的效率分别与狗SLAM和狗nectin4一样高[99］．

2014年，De Vries等人通过反向遗传学生成重组CDV，并通过在naïve和mev疫苗中表达EGFP，研究其毒力和向性猕猴猕猴，发现在幼稚动物中，CDV通过感染表达SLAM受体的淋巴细胞和树突状细胞而产生病毒血症和发热[One hundred.］．这些事实表明，CDV可以感染非人类灵长类动物;然而，在接种了mev的猕猴中，有部分保护作用，这可以通过控制病毒复制来证明。此外，CDV感染和MeV接种均未诱导明显的交叉反应中和抗体。在接种了mev疫苗的猕猴中，mev特异性中和抗体水平因CDV感染而增加，这表明交叉反应性表位确实存在[One hundred.］．

在其他研究中，发现从猴子中分离出的CDV (Monkey-BJ01-DV)在表达SLAM受体的Vero细胞中有效复制，这些细胞来源于狗和猴子。然而，它不会在表达SLAM受体的人类起源细胞中自我复制。在这方面，其根本原因可能是分离的H蛋白和CDV H蛋白的取代。而犬类SLAM与猴类SLAM的氨基酸序列同源性仅为63.6%;monkey - bj01 - dv菌株能够像源自猴子SLAM的Vero细胞一样有效地在表达SLAM受体的狗的Vero细胞上复制自己[101]，表明了潜在的跨物种事件。

即使CDV可以感染非人类灵长类动物，由于人类SLAM与狗SLAM受体的顺序不同，其与CDV附着蛋白的不相容性可能导致基于感染周期的人类没有感染，因为人们认为表达SLAM受体的细胞在一开始就被感染了。此外，MeV和CDV之间的交叉反应性免疫可能保护人类免受CDV感染[57，88］．已证实MeV和减毒CDV可引起犬瘟热不完全免疫应答[102］．其他研究比较了MeV和CDV疫苗预防幼犬犬瘟热的效果，这些幼犬也受到CDV毒株的挑战(Snyder-Hill)。所有的狗都受到了保护，只表现出一些临床症状[103］．因此，在人类中发展跨物种感染的想法仍然存在威胁，因为体外H蛋白的准时突变允许CDV使用人类SLAM受体感染细胞[57］．

本文从分子角度总结了CDV趋向性和发病机制的最重要方面，不仅包括病毒蛋白与宿主细胞受体的相互作用，还包括宿主因素对CDV毒力的影响以及从神经到胃临床症状的不同病理发展。不同受体的使用界定了CDV的细胞向性，因为淋巴细胞、上皮细胞和中枢神经系统细胞具有不同的受体，在不同阶段涉及CDV感染，这表明源自特定向性的发病机制是受体依赖的。

由于CDV的向性范围广，其发病机制具有多样性和动态性。了解CDV在犬体内产生毒力的机制，即宿主细胞受体和病毒蛋白之间的分子相互作用，有助于更准确地阐明CDV的趋向性和发病机制，并有助于理解某些情况下疫苗接种失败的原因。毫无疑问，缺乏关于CDV分子相互作用的信息限制了对其多向性的分析。然而，利用MeV感染可以推断出大量有价值的数据。因此，CDV感染周期的分子过程基本上是基于所涉及的MeV机制来理解的。反向遗传学技术在这种理解的构建中发挥了重要作用，特别是通过对CDV H蛋白的研究，使人们能够阐明来自广泛的CDV菌株的某些反应，因为CDV与其细胞受体之间的相互作用依赖于H蛋白。这一事实变得非常相关，因为所有CDV感染的第一步都涉及到这种病毒蛋白。因此，了解CDV变异中H蛋白一级结构修饰的发生率成为必要。

CDV由于病毒颗粒与宿主之间不同的相互作用而诱导多种致病效应。它与免疫系统的相互作用以及随后的短暂免疫抑制被认为是CDV感染不同临床症状发展的关键。这种免疫抑制被认为是病毒蛋白相互作用的结果，因为它们的修饰抑制了免疫抑制。

麻疹病毒，即CDV，在食肉动物中传播。考虑到人类与狗等家养动物的接近性，上述事实表明需要持续治疗，因为已经证明了非人类灵长类动物的感染。此外，使用人nectin-4作为进入受体的病毒在人类细胞系中复制，使人们怀疑CDV是否可以因为病毒适应而在人类中启动跨物种事件。

因此，许多计算机研究和定向突变在硅，作为初步工具，已经证明体外和体内实验对于更好地了解实际的疫苗接种问题、种间交叉传播和与CDV相关的各种病理体征是必要的，不仅可以开发新的替代治疗方法和治疗家犬表现出的症状，而且最重要的是避免CDV的种间交叉传播给人。

CDV:

犬瘟热病毒

中枢神经系统:

中枢神经系统

DL:

脱髓鞘leukoencephalitis

dTom:

红色荧光蛋白

EGFP:

增强型绿色荧光蛋白

ESCRT:

运输所需的内体分选复合物

兆电子伏:

麻疹病毒

子:

开式阅读架

pamp:

病原体相关的分子模式

PBMCs:

外周血单个核细胞

PRR:

模式识别受体

RNP:

核糖核蛋白复杂

猛击:

信号淋巴细胞激活分子

utr:

基因间非翻译区

作者感谢Juan David Rodas博士对手稿的修订和批判性阅读，以及Carolina Quintero博士对硅蛋白建模的支持。

资金

这项工作得到了哥伦比亚科学行政部门(Departamento Administrativo de Ciencia)的资助，Tecnología e Innovación - COLCIENCIAS资助号123171249669，部分由CONADI -哥伦比亚大学合作(SRM和JRS);和Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do里约热内卢Grande do Sul - FAPERGS, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES，和Propesq-UFRGS (RFB和CWC)。

数据和材料的可用性

不适用。

作者及隶属关系

1. Grupo de Investigación en Ciencias Animales - GRICA，哥伦比亚合作大学兽医与动物医学学院，哥伦比亚布卡拉曼加

   Santiago Rendon-Marin和Julian Ruiz-Saenz

2. Laboratório de virrologia, dade de Veterinária，南大联邦大学(UFRGS)，阿雷格里港，RS，巴西

   Renata da Fontoura Budaszewski & Cláudio Wageck运河

贡献

JRS构思了这项研究;SRM、RFB、CWC和JRS参与了研究的所有其他方面:数据收集、数据分析、起草和编辑论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到朱利安Ruiz-Saenz．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明，他们没有任何关于这篇手稿的利益冲突需要披露。

出版商的注意

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