单倍同源造血干细胞移植90天内HLA-A*0201/BMLF1-和HLA-A*1101/ lmp2特异性Epstein Barr病毒细胞毒T淋巴细胞的免疫重建

背景

单倍同源造血干细胞移植(haplo-HSCT)受者患eb病毒(EBV)相关疾病的风险较高。EBV-specific CD8⁺细胞毒性T细胞可控制ebv感染的B细胞扩增;然而，目前尚无研究探讨移植后ebv特异性免疫重建，尤其是单倍体移植。因此，在本研究中，我们旨在描述单倍体造血干细胞移植后ebv特异性免疫细胞重建的特征。

方法

HLA-A*1101和HLA-A*0201五聚体与免疫显性EBV多肽折叠用于检测EBV特异性CD8⁺采用流式细胞术检测19例单倍体造血干细胞移植受者外周血单个核细胞中的T细胞，并与对照组进行比较。我们还通过流式细胞术比较了ebv相关疾病患者或非ebv相关疾病患者的ebv特异性五聚体结合细胞频率。

结果

五聚体结合ebv特异性CD8⁺在ebv血清阳性患者接受单倍造血干细胞移植后+ 30、+ 60和+ 90天，从ebv血清阳性供体接受单倍造血干细胞移植后检测T细胞。单倍体hsct患者+ 30天HLA-A*0201/BMLF1-GLC五聚体频率明显低于HLA-A*0201阳性健康对照组(p= 0.019)和+ 60天患者(p= 0.003)。HLA-A*1101/LMP2-SSC五聚体在+ 30、+ 60和+ 90天的频率与健康对照组相比显著降低(p= 0.009, 0.019, 0.039);然而，HLA-A*1101/LMP2-SSC五聚体在+ 30、+ 60和+ 90天的频率在患者之间没有显著差异(p= 0.886)。HLA-A*0201/BMLF1-GLC五聚体在+ 60天的频率在有ebv相关疾病和没有ebv相关疾病的患者之间有显著差异(p= 0.024)。ebv相关疾病患者HLA-A*0201/BMLF1-GLC特异性CD8比例较低⁺T细胞。

结论

单基因hsct受体可产生ebv特异性CD8⁺移植后+ 30天内的T细胞。HLA-A*0201/BMLF1-GLC五聚体细胞频率+ 60天可能是监测单倍体造血干细胞移植患者ebv相关疾病的有用指标。单倍造血干细胞移植后60天内输注ebv - ctl可能对ebv相关疾病有预防作用。

Epstein-Barr病毒(EBV)在造血干细胞移植(HSCT)后经常发生活化[1，2];然而，ebv相关疾病，包括ebv相关移植后淋巴增殖性疾病(PTLDs)，可导致HSCT受者显著的发病率和死亡率。2000年以前，HSCT后PTLDs的死亡率达到84.6% [3.］．自引进ebv相关疾病/PTLDs的新方法以来，包括通过聚合酶链反应(PCR)监测EBV-DNA、预防性治疗和利妥昔单抗及时治疗，结果已经取得了相当大的改善;然而，死亡率仍然很高，大约三分之一被诊断为EBV-PTLDs的患者死亡[4］．

与EBV- ptlds高风险相关的因素包括HLA错配、EBV血清学供体/受体错配(供体+/受体-)、II-IV级急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植前脾切除术和间充质干细胞治疗[5］．此外，据报道，在接受了包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)或阿仑妥珠单抗(Campath)在内的低强度调节(RIC)方案的儿科患者中，PTLDs的发生率很高[6，7］．因此，与其他类型的HSCT接受者相比，接受单倍同源HSCT (haploo -HSCT)的患者可能有更高的ebv相关疾病风险，包括PTLDs。HLA差异和ATG使用是单倍造血干细胞移植后EBV再激活的重要因素。

ebv相关疾病/PTLDs患者治疗的主要目的是恢复ebv特异性免疫[8]，许多临床试验表明，使用来自干细胞捐赠者或第三方银行的ebv特异性细胞毒性T淋巴细胞(ebv - ctl) [9，10，11];然而，对于移植后ebv特异性免疫重建知之甚少，特别是在单基因移植接受者中。因此，目前还没有普遍接受的输血ebv - ctl作为预防ebv相关疾病/PTLDs发生的时间点，在HSCT后的初始阶段。

在本研究中，我们使用I类主要组织相容性复合体五聚体HLA-A*0201/BMLF1-GLC和HLA-A*1101/LMP2-SSC来研究19例单倍体hsct患者EBV-CTL免疫重建的动态。

患者和血液样本的采集

本研究前瞻性地纳入了2012年11月至2015年1月在上海道培医院采用RIC方案进行单倍体造血干细胞移植的28例患者。

所有患者均接受HLA-A*0201-或HLA-A*1101阳性供体单次单倍体造血干细胞移植。9例患者因移植后100天内复发(3例)或供体淋巴细胞输注(6例)而被排除;最终纳入19例可评估患者。

入选的19例患者供体HLA-A*0201(10例)或HLA-A*1101(9例)阳性，28例健康志愿者(均为EBV长期携带者)携带HLA-A*0201(9例)或HLA-A*1101(19例)，49例阴性对照组均为HLA-A*0201-和HLA-A*1101阴性。根据供体组织类型将患者分为HLA-A*0201组和HLA-A*1101组。患者、供体、健康的长期EBV携带者和阴性对照均在EBV- igm血清序列中呈阴性反应，在EBV- igg血清序列中呈阳性反应。所有患者在移植后+ 30、+ 60和+ 90天的骨穿刺和嵌合检查均为100%供体类型。

在常规实验室抽血时采集患者外周血样品(5ml)。从28名HLA-A*0201-或HLA-A*1101阳性的健康志愿者的血液样本中获得EBV- ctl的基线水平，以确定健康的长期EBV携带者。取HLA-A*0201-和HLA-A*1101阴性志愿者血样作为阴性对照。从19名患者中获得48份血液样本。在HLA-A*0201组中，5名患者分别在+ 30、+ 60和+ 90天提供血液样本;4例患者+ 30和+ 60天;一名患者在单体造血干细胞移植后+ 30天。1例患者死于侵袭性肺曲霉菌病，2例患者死于单倍体移植后+ 74和+ 87天死于ebv相关疾病/PTLDs, 2例患者在+ 90天失去随访(他们没有死亡，并在+ 120天恢复随访)。我们在移植后+ 30天通过骨穿刺和短串联重复(STR)检查发现+ 43天死亡的患者为100%供体型。然而，在+ 33天，该患者出现高热、肺部感染和血细胞减少，并在+ 37天发现嵌合率下降至供体受体的23%。 Secondary graft failure was observed, which was thought to be related to the serious pulmonary fungal infection. In the HLA-A*1101 group, blood samples were obtained from six patients at + 30, + 60, and + 90 days and from three patients at + 30 and + 60 days; the other three patients died because of invasive pulmonary aspergillosis (one case), cytomegalovirus (CMV) pneumonia (one case), and EBV-related gastroenteritis (one case).

检测血清ebv特异性抗体状态

根据制造商说明书，使用抗eb - Barr病毒(EBV- vca) IgM人体外酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒和EBV- vca -IgG人体外酶联免疫吸附试验(艾克生物科学，上海，中国)检测患者、供体、健康的长期EBV携带者和阴性对照在HSCT前的血清EBV-IgM和IgG状态。

HLA的差距

HLA-A, HLA-B, HLA-Cw和HLA-DRB1分型使用高分辨率DNA技术，根据制造商的说明。试剂(Special Monoclonal Tray- asian HLA Class I和Micro SSP HLA Class I和II ABDR DNA分型托盘;一个Lambda, Canoga Park, CA)被商业进口。

嵌合现象分析

单倍体造血干细胞移植后，连续6个月每月检测骨髓嵌合。嵌合性测定采用STR DNA指纹图谱和染色体荧光原位杂交(FISH)两种方法之一。通过性别匹配的供体-受体对受体BM细胞中STR的DNA指纹图谱评估嵌合性;然而，在性别不匹配的供体-受体配对中，用FISH分析嵌合性。

Haplo-HSCT过程

调节方案为:阿糖胞苷(2.0 g/m²)，每日一次，第13 - 12天，氟达拉滨(30mg /m²)每日1次，第11至第7天;布硫凡(0.8 mg/kg，每6 h)，第6至第4天;ATG(费森尤斯，5 mg/kg)，每日1次，第5至第2天(11例);或静脉注射阿糖胞苷(2.0 g/m²)，每日1次，在−14至−13天，氟达拉滨(30mg /m²)，每日一次，在−12至−8天，硫替帕(125 mg/m²)，每日1次，第8至第5天;ATG(费森尤斯，5mg /kg)，每日1次，第5至第2天(8例患者)。

对于GVHD的预防和管理，每位患者给予环孢素A (CSA, 2.5 mg/kg，每日两次，静脉注射)，短疗程的甲氨蝶呤(15 mg/m²每日1次，静脉注射，第1天和10 mg/m²+ 1 ~ + 14天口服霉酚酸酯(7.5 mg/kg，每天两次)作为GVHD的预防。如果患者出现病毒活化，包括CMV或EBV，并且当时没有GVHD，则取消CSA。如果患者发生aGVHD < II级，则给予甲基强的松龙(0.25 mg/kg/天)。只有2例患者发生III级aGVHD，发生在CSA变细之前。

采集造血干细胞:分别于第01天和第02天采集供体骨髓和外周血，使用粒细胞集落刺激因子(7.5 μg/kg/d，第4天至第02天)。

所有患者的支持性护理相似。所有血液制品都进行了辐射，白细胞被清除。在调节过程中常规使用卡泊芬净进行抗真菌预防，移植后使用伏立康唑。肺孢子虫预防，典型的是甲氧苄啶-磺胺甲恶唑，直到移植后6个月。阿昔洛韦，通常400毫克口服，每天两次，直到移植后24个月。

EBV在外周血中的再激活监测和EBV相关疾病的定义

EBV-DNA拷贝数用外周血标本或活检标本定量PCR (qPCR)测定。简单地说，基因组DNA是从250 μL全血或消化组织中分离出来的，使用Axyprep Mag组织血液基因组DNA试剂盒(Axygen, Union City, CA,USA)，根据制造商的说明。qPCR在ABI 7300热循环仪上使用市售EBV PCR试剂盒(Daan Gene Technology, Guangzhou, China)进行，结果显示为全血DNA拷贝数/mL, EBV的检测阈值为500拷贝数/mL。

在单倍体造血干细胞移植后30天内每周监测EBV-DNA拷贝数，随后每隔一周监测一次，直到移植后3个月或直到外周血中检测不到EBV-DNA为止。

EBV-DNAemia定义为连续两个时间点EBV-DNA载量超过500拷贝/mL，没有任何ebv相关疾病的迹象或症状，包括可能的和已证实的PTLDs。可能的ptld被定义为显著的淋巴结病、肝脾肿大或其他末端器官表现，伴有EBV-DNA高血负荷和缺乏组织活检和其他有文献记载的原因[12］．经证实的PTLDs诊断为在组织标本中检测到EBV核酸或EBV编码蛋白，同时伴有受感染器官的症状和/或体征[12］．

MHC i类肽五聚物(五聚体)和试剂

使用了两个EBV肽表位:HLA-A*0201限制性表位GLCTLVAML，来自裂解周期蛋白BMLF1(氨基酸259-267)，HLA-A*1101限制性表位SSCSSCPLSK，来自潜在周期蛋白LMP2(氨基酸340-349)。五聚物HLA-A*0201/BMLF1-GLC和HLA-A*1101/LMP2-SSC购自ProImmune, Ltd. (Oxford, UK)。五聚体用藻红菊酯(PE)标记。单克隆抗体，包括抗cd3(橄榄素叶绿素蛋白-[PerCP])、抗cd8(异硫氰酸荧光素-[FITC])和抗cd19(异藻蓝蛋白-[APC])，购自BD生物科学公司(Franklin Lakes, NJ, USA)。实验方案和操作由ProImmune, Ltd. (Oxford, UK)的Pentamer手册推荐。根据协议，细胞从不匹配的五聚体(不相关的MHC等位基因和/或不相关的肽)获得。可用于控制非特异性染色，排除B细胞可能会减少大部分非特异性背景，我们以HLA-0201和1101阴性的成年志愿者作为阴性对照，加入抗cd19单克隆抗体去除B淋巴细胞。简单地说，正向和侧面散射体被用来门控活细胞群，和CD3⁺CD19⁻然后获取细胞以删除B淋巴细胞。接下来,CD3⁺CD19⁻CD8⁺获得CD8细胞⁺T淋巴细胞，最后是五聚体染色的CD3⁺CD8⁺CD19⁻获取细胞作为靶细胞进行FACS分析。EBV- ctl百分比计算如下:EBV- ctl百分比=(患者EBV- ctl百分比或健康长期EBV携带者EBV- ctl百分比(健康对照组)- EBV- ctl阴性对照组百分比)× 100%。

在单倍体造血干细胞移植后+ 30、+ 60和+ 90天采集患者的血液样本，而健康志愿者的血液样本仅采集一次，分别为HLA-A*0201-或HLA-A*1101阳性和阴性对照。基于ebv特异性CD8的百分比，我们评估了HLA-A*0201/BMLF1-GLC和HLA-A*1101/LMP2-SSC五聚体的性能⁺四色流式细胞术检测T细胞。所有实验均重复三次。

五聚体染色测定

将FACS溶解液(BD Biosciences)添加到血液样本中溶解红细胞。细胞清洗两次，在含1%胎牛血清(FCS)和0.1%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬。在显微镜下计数有核细胞的数量，并调整到每管包含1-2 × 10⁶有核细胞。然后将滴定过的五聚体加入样品中。在室温(25°C)无光照下孵育10分钟后，加入滴定的单克隆抗体(分别为PerCP-、FITC-或apc偶联CD3、CD8或CD19)进行表面染色。在4℃无光条件下孵育20 min后，用含1% FCS和0.1%叠氮化钠的PBS洗涤两次，然后在4℃条件下保存于1%多聚甲醛中。样品在6小时内在FACS Calibur仪器(BD Biosciences)上进行分析。至少有5000个活CD3⁺流式细胞术计数淋巴细胞。使用CellQuest (BD Biosciences)进行分析。五聚体结合CD8的频率⁺根据CD3的百分比计算T细胞⁺CD8⁺CD19⁻T细胞与五聚体结合。HLA-A*0201-和HLA-A*1101阴性患者的血液样本作为阴性对照。

统计数据

使用SPSS 21.0软件(SPSS, Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国)进行统计分析。正态分布的定量资料以均数±标准差表示。连续变量和无正态分布的定量数据用中位数和极差表示。采用独立样本比较两组间五聚体的百分比t测试。采用Wilcoxon秩和检验比较有和无ebv相关疾病患者+ 60天HLA-A*0201/BMLF1-GLC五聚体的频率。采用方差分析比较多组间五聚体反应细胞的百分比。所有分析均为双尾和p< 0.05被认为是显著的。

病人的特点

本研究纳入的19例患者的特征见表1．一般资料包括性别(p= 0.770)，年龄(p = 0.967)、疾病(p= 0.669)，以及调理方案(p= 0.849)在HLA-A*0201组与1101组间无显著性差异。

19例患者在单体造血干细胞移植后+ 30天嵌合率均为100%。HLA-A*0201组1例患者因严重侵袭性肺曲菌病，在HSCT后+ 37天失去100%嵌合，+ 43天死亡。其余患者一生中保持100%嵌合。

在10名患者的血液或组织样本中检测到EBV-DNA，其中5名患者患有EBV-DNA血症，5名患者患有ebv相关疾病。5例ebv相关疾病的正电子发射断层扫描(PET-CT)成像或组织活检结合qPCR检测EBV-DNA拷贝数，均为可能的PTLDs，由于样本量小，未进行原位杂交组织学检查以检测ebv编码的小RNA转录本或病毒抗原。5例ebv相关疾病患者中，3例有发热、扁桃体炎、腺病和高外周血EBV-DNA载量;2例患者外周血未检测到EBV-DNA。然而，在这两名患者中，其中一名患者通过结肠镜获得的肠道活检标本中发现了EBV-DNA，另一名患者通过腰椎穿刺收集的脑脊液中发现了EBV-DNA。

HLA-A*0201/ ebv - bmlf1 - glc特异性ctl在健康对照组和单倍体造血干细胞移植患者中的百分比

阴性对照来自ebv血清阳性、HLA-A*0201和1101阴性患者(图2)。1)．

HLA-A*0201/ bmlf1 - glc特异性ctl的平均百分比在健康对照组为2.222%±1.665%，单株造血干细胞移植后+ 30天为0.587%±0.365%，单株造血干细胞移植后+ 60天为2.101%±1.328%，单株造血干细胞移植后+ 90天为1.244%±0.157%。+ 30天HLA-A*0201/ bmlf1 - glc特异性ctl的平均百分比显著低于HLA-A*0201阳性健康对照组(p= 0.019)，而+ 60天和+ 90天的平均百分比无显著差异(p= 0.867, 0.117)。单倍体造血干细胞移植后三个时间点(+ 30、+ 60和+ 90天)的比较表明，+ 30天和+ 60天HLA-A*0201/ bmlf1 - glc特异性ctl的平均百分比有显著差异(p= 0.003)，而+ 30天和+ 90天的差值(p= 0.529)和+ 60至+ 90天之间(p= 0.262)均无统计学意义(图;2)．

HLA-A*1101/ ebv - lmp2 - ssc特异性ctl在健康对照组和单倍体造血干细胞移植后患者中的百分比

在这些实验中，阴性对照也包括ebv血清阳性、HLA-A*0201和1101阴性患者。

健康对照组HLA-A*1101/ lmp2 - ssc特异性ctl的平均百分比为2.508%±1.766%，单次移植后+ 30天为0.774%±0.747%，单次移植后+ 60天为0.945%±0.828%，单次移植后+ 90天为0.886%±0.572%。与健康对照组相比，+ 30、+ 60和+ 90天HLA-A*1101/ lmp2 - scs特异性ctl的平均百分比显著降低，(p= 0.009, 0.019, 0.039)。对比单体造血干细胞移植后三个时间点(+ 30、+ 60、+ 90天)，三组间无明显差异(p= 0.886)(图3.)．

单倍体造血干细胞移植后健康对照组和患者HLA-A*0201/ ebv - bmlf1 - glc特异性和HLA-A*1101/ ebv - lmp2 - ssc特异性ctl的比较

HLA-A*1101/ lmp2 - ssc特异性ctl的百分比与ebv血清阳性健康对照中HLA-A*0201/ ebv - bmlf1 - glc特异性ctl的百分比相似(2.508%±1.766% vs 2.222%±1.665%)。p= 0.688)。+ 60天HLA-A*1101/ lmp2 - scs特异性ctl的百分比明显低于HLA-A*0201/ ebv - bmlf1 - glc特异性ctl的百分比(0.945%±0.828% vs 2.101%±1.328%)，p= 0.042)。两种ebv特异性ctl在+ 30和+ 90天的平均百分比比较，差异无统计学意义(0.774%±0.747% vs 0.587%±0.365和0.886%±0.572% vs 1.244%±0.157%，p= 0.491, 0.211)(图;4和表2)．

有与无ebv相关疾病患者HLA-A*1101/ ebv - lmp2 - ssc特异性ctl的比较

在9例HLA-A*1101/EBV- lmp2 - ssc特异性CTL数据的患者中，5例没有EBV再激活的证据，2例有EBV- dnaemia, 2例有EBV相关疾病;1名患有ebv相关肠胃炎的患者死亡。

ebv相关肠胃炎患者外周血中未同时检测到EBV-DNA拷贝。我们推测血液中检测到高EBV-DNA拷贝并不总是与ebv相关疾病同步。因此，我们没有将EBV-DNA拷贝与ebv - ctl联系起来。

单倍体hsct后+ 30、+ 60、+ 90天，与无ebv相关疾病患者HLA-A*1101/ ebv - lmp2 - ssc特异性ctl的平均百分比无显著差异(p= 0.500, 0.889，而且分别为1.000)。

有与无ebv相关疾病患者HLA-A*0201/ ebv - bmlf1 - glc特异性ctl的比较

在9例HLA-A*0201/EBV- bmlf1 - glc特异性CTL数据的患者中，3例没有EBV再激活的证据，3例有EBV- dnaemia, 3例有EBV相关疾病;2名患有ebv相关疾病的患者死亡。ebv相关脑炎患者外周血中未同时检测到EBV-DNA拷贝。这9例患者的特征见表3.．

单倍体造血干细胞移植后+ 30天HLA-A*0201/ bmlf1 - glc特异性ctl的平均百分比与无ebv相关疾病患者无显著性差异(p= 0.909)。但HLA-A*0201/ bmlf1 - glc特异性CD8的平均百分比存在显著差异⁺ebv相关疾病患者和非ebv相关疾病患者+ 60天T细胞(p= 0.024)，有ebv相关疾病的患者比无ebv相关疾病的患者比例低(图2)。5)．HLA-A*0201组中有5例患者在+ 90天有EBV-CTL百分比数据，但没有人患有ebv相关疾病。因此，我们没有分析+ 90天HLA-A*0201/ ebv - bmlf1 - glc特异性ctl的差异。

多项研究表明EBV特异性T细胞在控制EBV感染方面的重要性，特别是在HSCT之后[13，14］．然而，目前对HSCT后ebv特异性免疫重建知之甚少。我们目前的研究结果为ebv特异性CD8的早期重建提供了见解⁺含ATG的RIC方案单倍体造血干细胞移植后的T细胞。我们对单体造血干细胞移植后早期EBV特异性免疫重建动态的研究将有助于确定EBV特异性免疫治疗的适当时间点，以预防或治疗EBV感染。

HLA-A*0201/BMLF1- glc四聚体或五聚体可用于检测健康的长期EBV携带者、传染性单核细胞增多症患者以及接受实体器官移植或HSCT的患者中识别BMLF1溶循环蛋白的EBV- ctl [15，16，17，18］．HLA-A*1101/LMP2- ssc四聚体常用于检测鼻咽癌或淋巴瘤患者中针对LMP2潜伏周期蛋白的ebv - ctl [19，20.]，但并不经常用于筛选移植受者。我们分别使用GLC-和ssc -五聚体检测了所有单倍体hsct后患者和健康志愿者的ebv - ctl，这些五聚体特异性于裂解周期蛋白bmlf1和潜在周期蛋白lmp2。结果表明，这两种五聚体也可用于检测HSCT患者外周血中的ebv - ctl。

来自健康成年志愿者的样本分别在EBV-IgM和EBV-IgG血清阵列中产生阴性和阳性反应。因此，EBV- ctl的频率可能反映了健康的长期EBV携带者的EBV- ctl水平。在本研究中，与EBV- ctl相关的EBV溶性抗原BMLF1-GLC和潜伏性抗原LMP2-SSC在健康长期EBV携带者中的频率分别为2.222%±1.665和2.508%±1.766%。这些结果表明，在健康的长期EBV携带者中，EBV- ctl对即刻早期溶解周期蛋白和潜在周期蛋白的频率具有可比性。另一项研究也表明，EBV特异性CD8+ T细胞可在健康的EBV携带者中轻易检测到[16］．然而，ebv特异性CD8的丰度⁺研究发现，抗HLA*A2/GLC和HLA*B8/RAK溶蛋白表位的T细胞数量分别高于抗HLA*A2/SVR和HLA*B8/FLR溶蛋白表位的T细胞数量[16］．两项研究的差异表明，需要更大的样本量和更多不同抗原表位的五聚体数量来检测统计学意义。此外，我们的结果还需要使用ELISPOT等其他方法进一步验证。

本研究是对单倍体造血干细胞移植后glc特异性和ssc特异性EBV-CTL重建动态的初步研究。与健康EBV携带者相比，glc特异性EBV- ctl在单倍体移植后+ 30天出现，尽管水平明显较低，但随后在+ 60天恢复到正常水平，并在+ 90天略有下降。9例患者在单体造血干细胞移植后+ 30、+ 60和+ 90天均检测到ssc特异性ebv - ctl;然而，其频率明显低于健康EBV携带者，这表明识别潜在蛋白LMP2的ssc特异性EBV- ctl在单倍体造血干细胞移植后90天内没有恢复到正常水平。+ 60天HLA-A*1101/ lmp2 - scs特异性ctl的频率明显低于HLA-A*0201/ ebv - bmlf1 - glc特异性ctl的频率。两种ebv - ctl的频率在HSCT后+ 90天达到平衡。ebv特异性免疫重建的动态与传染性单核细胞增多症患者的免疫结构相似，后者表现出丰富的对溶解周期蛋白的反应性ebv - ctl，而对潜在周期肽的ebv - ctl可检测到，但水平较低。急性感染后3 ~ 8个月，抗溶抗原的ebv - ctl逐渐减少，而识别潜伏抗原的ebv - ctl开始增加，直至两组ebv - ctl达到稳态。马歇尔等人。[21]在一名移植术后患者中报告了类似的结果;移植后+ 30天，患者的ebv - ctl抗溶出和潜伏期抗原肽水平显著降低。然而，在+ 60天，针对溶出抗原或潜伏抗原的ebv - ctl明显增加，识别溶出抗原的ebv - ctl占优势。他们还发现ebv特异性免疫反应在HSCT后+ 30天恢复。

这些关于ebv特异性免疫重建动力学的结果可以促进ebv特异性免疫治疗。因此，我们比较了有或没有ebv相关疾病患者的ebv - ctl水平。有ebv相关疾病的患者在单倍体移植后+ 60天的glc特异性ebv - ctl水平低于无ebv相关疾病的患者。这表明在+ 60天对溶出蛋白BMLF1-GLC反应较低的患者发生ebv相关疾病的风险较高。Annels等人[18]同时分析了病毒载量和T细胞重建，得出了类似的结论，表明在EBV再激活的初始阶段缺乏EBV特异性T细胞扩增的患者，先发制人干预的有效性可能有限。我们的发现也与D 'Aveni等人报道的结果一致。[22]，他们在HSCT后+ 60、+ 100、+ 180和+ 360天用Elispot法监测ebv特异性T细胞定量。对于EBV DNAemia发生并自发清除的病例，他们的ELISPOT结果表明每10个中存在超过> 1000个斑点形成细胞⁶PBMCs。

这一发现提示单倍体移植后+ 60天ebv - ctl识别BMLF1-GLC的低频率可作为ebv相关疾病发生的标志。单倍造血干细胞移植后60天内输注ebv - ctl可能对ebv相关疾病有预防作用。然而，我们分析了少量可能导致较大偏差的病例。我们需要更大样本量的进一步研究来验证我们的发现。

与类似研究相比，本研究中的患者在供体类型、移植物来源、调理、ATG来源和剂量以及免疫抑制预防类型方面相对相同。然而，我们的研究只有少量的患者，因此研究结果应谨慎解释。总之，我们的数据表明，单倍体移植后ebv特异性免疫重建显著影响ebv相关疾病的控制。因此，单倍造血干细胞移植后60天内输注ebv - ctl可能对ebv相关疾病有预防作用。

aGVHD:

急性移植物抗宿主病

APC:

Allophycocyanin

ATG:

Antithymocyte球蛋白

客服人员:

环孢霉素的

ctl:

细胞毒性(CD8⁺T淋巴细胞

EBV:

爱泼斯坦巴尔病毒

FCS:

胎牛血清

FITC:

异硫氰酸荧光素

Haplo-HSCT:

单倍体造血干细胞移植

PBS:

磷酸盐

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

体育:

藻红蛋白

PerCP:

周围素叶绿素蛋白

PTLDs:

移植后淋巴增生性疾病

里克:

降低强度的调节

我们要感谢Editage (https://www.editage.cn)进行英文编辑。

资金

上海市卫生局奖励项目(项目编号:20124209)

数据和材料的可用性

不适用。

作者及隶属关系

1. 上海市闵行县和庆路801号，复旦大学附属上海市第五人民医院，邮编200240

   周玲，卢道培

2. 上海道培医院，上海市闵行县瑞丽路126号，邮编200240

   Dao-pei陆

贡献

LZ完成了这项研究，并参与了隔离收集和实验、数据收集、数据分析和手稿的撰写;DL是这项研究的主管。两位作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到凌周．

伦理批准并同意参与

本研究方案经上海道培医院伦理委员会批准。研究参与者知情同意。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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