一种强毒性伪狂犬病毒及其一系列体外传代株的比较基因组分析

背景

伪狂犬病毒(PRV)科Herpesviridae是奥耶斯基氏病的病原体体外连续传代抑制PRV是一种行之有效的方法;然而，病毒基因组在这一过程中发生的动态变化尚未被描述。

方法

对一株强毒性伪狂犬病毒及其一系列空斑纯化株进行体外传代基因组测序和比较基因组分析，并进一步研究其体内外特性。

结果

与亲代病毒相比，高传代F50、F91和F120的体外复制增强。相反，小鼠的致死率随着传代数的增加而逐渐降低。F50、F91和F120的基因组测序显示，缺失了一个含有gE的大片段，这可能与它们的衰减有关。此外，在F50、F91和F120的许多基因中发现了单核苷酸变异。在传代菌株的特定基因中也检测到帧内和移码缺失。特别是在高传代菌株中观察到移码突变，导致pUL46被截断但过表达。

结论

在Vero细胞中通过序列传代衰减PRV的过程中，先后出现了大缺失、单核苷酸变异、帧内小插入、帧移突变等动态变异模式，促进了病毒群体的进化，使病毒逐渐衰减。这些数据为更好地理解传代过程中的PRV衰减提供了线索。

伪狂犬病毒(PRV)科Herpesviridae,亚科Alphaherpesvirinae［1]，是猪的主要病毒性疾病奥杰斯基病的病原体，是病毒的天然宿主。它会导致新生仔猪严重的神经系统疾病和高死亡率，以及母猪繁殖失败[2]，导致全球养猪业遭受重大经济损失。除猪外，PRV可感染许多哺乳动物，引起神经系统疾病及急性死亡[3.］．

长期以来，预防狂犬病的有效疫苗一直存在[4］．在使用的各种疫苗中，由广泛传代产生的一种毒性毒株衍生而来的减毒巴沙疫苗株是最常用的[5］．迄今为止，大规模疫苗接种结合实施有效的诊断测试以区分受感染动物与接种疫苗的动物，已使许多国家能够根除家猪中流行的prv [6］．然而，自2011年以来，在中国接种疫苗的猪中再次出现了伪狂犬病。从这些疫情中分离出的PRV变异的基因组分析表明，它们在进化上不同于欧美菌株[7]，实验证实Bartha-K61疫苗缺乏完全保护[8，9］．这促使人们需要充分了解病毒衰减，以开发新的候选疫苗。

自20世纪80年代以来，开展了一些研究，以确定Bartha和其他疫苗株的全基因组突变，从而阐明了其衰减的遗传基础。在病毒基因组独特的短(US)部分中，发现了一个含有两种非必需糖蛋白(gI和gE)的大缺失，并被证明有助于病毒的衰减[10，11，12］．随后的研究进一步表明，活疫苗株Bartha的其他基因缺陷也导致其减毒表型[13，14］．最近，Illumina高通量测序(HTS)被用于确定该疫苗株的基因组多样性，结果发现了Bartha和PRV毒株之间许多以前未知的编码差异[15］．这些研究为了解PRV的衰减和变异提供了非常重要的线索。然而，如果在这类研究中包含来自衰减过程中间通道的病毒，可能会将更多的遗传变异信息与特定的表型差异联系起来，从而在遗传水平上获得对衰减的清晰见解。

在我们之前的工作中，我们通过在Vero细胞中连续传代变体JS-2012，在40°C下繁殖120代，开发了一种减毒的PRV [16］．所得到的菌株F50、F91和F120(按传代数命名)对仔猪的致病性表明，随着传代数的增加，致病性逐渐下降，JS-2012-F120对2周龄仔猪无毒性[16］．但在序列传代过程中病毒衰减与遗传变异之间的关系尚不清楚。

为了更好地了解遗传变异和病毒衰减之间的关系，在本研究中，我们进一步在体外和体内对这些JS-2012传代PRV毒株进行了表征。与亲本病毒相比，第50至120代的毒株产生了更高的滴度，但相对较小的斑块。病毒在小鼠模型中的致死率随着传代数的增加而逐渐降低。全基因组测序显示，在所有传代菌株中都存在大量缺失，包括US8、US9和US2基因。此外，在许多基因中检测到可变数量的单核苷酸变异，主要是在基因组的UL区域。此外，在一些基因中发现了小的帧内和移码索引。特别是在UL16和UL46基因中观察到移码突变，后者产生了截断但过表达的pUL46，这可能有助于增强病毒在体外的复制和在动物体内的衰减。这些数据为更好地了解PRV的衰减和变异提供了重要线索，并为进一步了解病毒的进化提供了线索。

病毒和细胞

PRV JS-2012是从患病新生仔猪中分离出来的PRV变种。通过37℃下三轮单空斑克隆，从相应的病毒原液中纯化出株JS-2012-F50、-F91和-F120，并根据其各自的文章命名。Vero和PK-15细胞在Dulbecco改良Eagle 's培养基(DMEM) (Gibco，美国)中培养，并添加10%胎牛血清(Gibco，美国)。

小鼠感染

选用6 ~ 8周龄SPF级BALB/c小鼠50只，随机分为5组，每组10只。第1 ~ 4组用含10⁴50%组织培养感染剂量₅₀)，分别为JS-2012、F50、F91和F120。第5组小鼠接种100 μL DMEM，作为对照组。在攻毒后的前2天，每12小时观察小鼠的神经症状和生存状况，因为在这段时间内小鼠一般没有表现出明显的症状。在剩余的监测时间内，小鼠逐渐出现神经症状，因此在剩余的8天中，每6小时观察一次，以捕捉每只小鼠的生存状态的变化。同时测定各组小鼠的神经症状评分水平。其中，无神经系统症状的小鼠记0分，轻度神经系统症状如不安、兴奋、偶尔瘙痒记1分，严重神经系统症状(严重瘙痒、自残)记2分。得分为2的小鼠被认为“死亡”，并出于动物福利的原因对其实施安乐死[17］．所有动物实验均按照研究所的《实验动物护理和使用指南》进行，并根据机构动物护理和使用委员会批准的协议进行。

Illumina文库制备和测序

JS-2012株全基因组序列(GenBank Accession no.;KP257591)已在前面描述[7］．其他菌株的基因组DNA按先前所述制备[15］．基因组文库使用Nextera XT DNA样本制备试剂盒(Illumina, USA)制备，测序在Illumina Miseq平台上进行，该平台位于上海马约比奥生物制药科技有限公司(中国上海)。为每个菌株生成的序列读取的数量列在附加文件中1:表S1。

PCR扩增和sanger测序

对HTS无法确定的几个开放阅读框(ORF)区域或需要进一步验证的基因在50 μL反应中进行pcr，反应中含有2 μL模板DNA (50 ng)、25 μL 2 × GC buffer II (Takara)、0.5 μL Ex Taq聚合酶(Takara)、0.5 mM引物、脱氧核苷三磷酸盐和蒸馏水。将预期大小的PCR产物克隆到pMD-18 T载体(Takara)中，每个PCR产物随机选择3个克隆进行Sanger测序。

基因注释及蛋白编码序列分析

首先用SeqPrep程序对F50、F91和F120的原始Illumina reads进行解适应并合并成单个较长的reads，然后将质量控制的测序片段与参考基因组(GenBank Accession no. 433)进行比对。KP257591)采用BWA软件，然后由genous 8分别进行组装。采用PCR扩增和Sanger测序方法测定间隙。对每个病毒ORF进行BLAST分析，并手动调整JS-2012参考序列，对F50、F91和F120的基因组进行注释。标记的基因组序列存入GenBank序列数据库，登录号为MG551316 (F50)、MG551317 (F91)和MG589642 (F120)。在单核苷酸变异分析中，利用MEGA v.5.0中实现的Muscle (Codons)算法，将三个传代菌株的每个ORF的核苷酸序列与JS-2012进行比对，以确定每个传代菌株中单核苷酸变异的数量和频率[18］．同时，表中汇总了F50、F91和F120与JS-2012相比在氨基酸和核苷酸水平上的所有变异1和附加文件2:表S2，帧内和移码索引在表中描述2．

cDNA末端3’快速扩增(RACE)

使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)提取被指定病毒感染的PK-15细胞的总RNA，用RNase-free DNase I (Ambion)处理，然后用引物Q反转录_T3 ' 5 ' -CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGA (t16.1)。将得到的cDNA产物和引物UL16 F597/Q进行PCR反应，获得UL16和UL46的mRNA 3 '端₀(5 ' -CGAGTGCCGCGTGGACCAC-3 '和5 ' -CCAGTGAGCAGAGTGACG-3 ')和UL46 F453/Q₀(5 ' - gcacccgttcaagcacag -3 '和5 ' -CCAGTGAGCAGAGTGACG-3 ')。UL16 F597和UL46 F453是经过UL16和UL46基因退火的低聚物，Q₀Q的锚引物是吗_T．将PCR片段亚克隆到TA克隆载体pMD-18 T (Dalian, China)中，进行DNA测序。

Western blot分析

感染24小时后，将细胞收集到冰冷的PBS中，离心，用RIPA缓冲液裂解30分钟，然后在4°C下离心3分钟。收集上清液，煮沸10分钟，在10%聚丙烯酰胺凝胶上SDS-PAGE分离，并使用Bio-Rad半干转移池转移到硝化纤维膜上。用5%的含TBS-T缓冲液的脱脂牛奶阻断膜，用VP5 (UL19)(1:1000)、UL16(1:50)和UL46(1:50)的小鼠多克隆抗体，用稀释在2%含TBS-T缓冲液的脱脂牛奶中的gE单克隆抗体(1:1000)和β-肌动蛋白(1,6000)孵育，然后用稀释在TBS-T缓冲液中的山羊辣根过氧化物酶偶联二抗孵育。使用ImageJ (NIH)凝胶分析仪模块测量蛋白带强度。

含有移码突变的UL46和UL16的ORF分析

UL46和UL16含有移码突变的ORF使用国家生物技术信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，并使用EditSeq (DNASTAR)手动计算每个病毒株对应蛋白质的分子量。

高温连续传代产生高效价的弱毒菌株

为了进一步表征传代菌株的复制特性，我们从串联传代的各个位点上选取菌株进行纯化评价。PK-15细胞的一步生长动力学显示，来自高传代(F50至F120)的PRV株在感染后的前12小时内表现出更高的复制率，在随后分析的时间点上显示出更高的病毒滴度(图5)。1a).相比于JS-2012, F50、F91和F120的斑块逐渐变小(图。1c)。此外，在小鼠模型中，传代菌株的致死率随着传代量的增加而逐渐降低，F50仍保持一定的致死率，而F91和F120在小鼠中没有致死率(图1)。1d)。

PRV传代过程中发生的单核苷酸变异

为了更好地了解所观察到的表型的遗传变异，使用Illumina和Sanger测序组合对菌株F50、F91和F120的全基因组进行测序。将所有orf序列进行比较，确定PRV JS-2012及其传代株的株间多样性。变异分析显示，许多基因存在单核苷酸变异。具体来说，在三个传代菌株和JS-2012中鉴定出119个可变位点(图2)。2)．单核苷酸变异主要发生在病毒基因组的UL区，特别是UL28、UL26、UL18和UL17，每一个都包含10个以上的单核苷酸变异位点(图2)。2)．因此，UL28、UL26、UL18和UL17的单核苷酸变异频率(单核苷酸变异数/ORF长度)分别在0.5、1.0、1.2和0.8%时非常高(图2)。2)．其他基因的变异位点均不超过5个，其发生率均低于0.5%(图2)。2)．

在连续传代过程中，大的缺失和小的插入都参与了PRV的进化

其中最显著的变异之一是覆盖在US8 (gE)、US9和US2区域的大量缺失(表2)1)．US8 (gE)缺失也存在于Bartha和其他经体外大量传代减毒的疫苗株的基因组中。此外，我们在传代菌株的基因组中发现了小的indels。在UL17、UL26、UL26.5和UL28的orf中均存在帧内索引，其中部分(但不是全部)与短序列重复序列的数量变化有关。例如，菌株F91的UL26中3-nt的缺失显然是由短序列重复序列“GCC”的一个重复的缺失引起的2)．

移码突变也被鉴定出来。DNA和mRNA水平的测序证实，一些传代菌株的UL16和UL46基因存在移码突变。具体来说，F91和F120的UL16中的突变(胞嘧啶的插入)发生在均聚物(CCCCCCC)核苷酸片段内，而F120的UL46中的移码突变是由29-nt短序列重复序列(GGACGACGACGACGGCGCCCCCTGGGCCC)的插入引起的。3.a).这些基因的特异性3’RACE进一步揭示了两个移码突变对两个基因的转录终止没有影响;也就是说，所研究的所有菌株的UL16和UL46 orf都转录并终止在同一位置(图2)。3.b).然而，对这些orf的生物信息学分析表明，突变导致F120的UL46提前终止密码子(图12)。3.c)。事实上，通过对f120感染细胞的细胞提取物进行Western blot分析，可以检测到预测的65.9 kda截断的UL46产物(图。3.d).另一方面，ORF Finder预测，UL16基因移码突变导致F91和F120的终止密码子延迟(图。3.c).然而，该突变仅导致蛋白大小发生0.3-kDa的变化，western blot分析无法检测到(图。3.d).此外，UL46的移码突变与其他菌株相比，相应产物在F120中的表达水平相对较高，而UL16的突变对其蛋白产物在F91和F120中的表达没有显著影响(图。3.d)。

病毒在细胞培养中复制时可以获得突变，而只有有利于病毒体外复制的突变才会在群体中迅速被选择和富集。这在培养的大量传代中尤其重要，导致病毒具有新的获得性遗传等位基因和进化的表型，通常在自然宿主中致病性较低，但更适合在细胞中复制[19，20.］．

在我们之前的研究中，PRV JS-2012菌株在高温下连续传代120代。随着传代数量的增加，病毒在仔猪感染模型中逐渐衰减，直至完全失去通过传代导致仔猪死亡的能力120 [16］．为了表征传代过程中病毒群体的进化和变异，本研究对几个具有代表性的菌株在连续传代的各个步骤进行了体外和体内表征，并对F50、F91和F120的基因组进行了测序和进一步分析。生长曲线和空斑分析表明，在传代过程中，病毒更适合在细胞系中复制和释放，但传播能力似乎略有减弱(图2)。1)．此外，随着传代数量的增加，传代菌株在小鼠中的致死率逐渐降低，这与我们之前在仔猪中的结果一致(图2)。1)．因此，在体外传代过程中，病毒在细胞中获得了更好的复制能力，而在动物中则大大减弱，这可能是病毒遗传变异和快速进化的结果。

为了深入了解JS-2012在体外连续传代过程中的进化，我们对三个具有代表性的菌株(F50、F91和F120)进行了测序和分析。值得注意的是，在三个菌株的基因组中都发现了包括US8 (gE)、US9和US2在内的大DNA片段的缺失。Western blot分析进一步证实了三株传代菌株均无gE表达。3.d).若干研究表明，从PRV基因组中删除gE可导致病毒的衰减[21，22］．因此，JS-2012在传代过程中的衰减很可能与含有gE片段的缺失有关。在其他疱疹病毒和在培养物中广泛传代的大型DNA病毒中，存在较大的缺失或某些基因的缺失是非常常见的[23]，这表明这可能是大型DNA病毒在细胞培养中进化的独特特征。除大缺失外，单核苷酸变异是许多基因的显性变异模式，特别是在病毒基因组的UL区。此外，在UL17、UL26、UL26.5和UL28基因中鉴定出的小帧内indes有助于病毒的进化。其中一些indels似乎是通过特定短序列重复的收缩发生的，最有可能是通过重组或聚合酶滑移机制[15］．但其余的indels与短序列重复无关，提示PRV进化过程中可能存在其他机制参与了indels的生成。

先前在兔肾细胞的序列传代中观察到PRV基因组中的移码突变[24]，也存在于抗阿昔洛韦的HSV-1株的TK基因和人巨细胞病毒的RL5A、RL13、UL131A和UL130基因中[25，26］．并证实移码突变可能与PRV在细胞培养中的适应性有关[24］．在Vero细胞中连续传代PRV JS-2012时也发生了移码突变。在相应传代菌株的UL16和UL46基因的DNA和mRNA水平上证实了移码突变的存在。在一个均聚核苷酸片段(CCCCCCC)中插入一个胞嘧啶，在F91和F120的UL16基因中产生移码，在F120的UL46基因中插入一个29-nt短序列重复序列(GGACGACGACGACGGCGCCCCCTGGGCCC)产生移码。因此，两种突变均与短序列重复序列的改变有关。具体的3’RACE进一步揭示了两个移码突变对两个基因的转录终止均无影响，说明病毒基因的转录停止信号是保守的。进一步分析表明，突变导致F120的UL46密码子提前终止，F91和F120的UL16密码子延迟终止(图1)。3.c)。因此，通过Western blot分析，在f120感染的细胞提取物中检测到预测的65.9 kda截断的UL46产物(图。3.d).此外，F120表达的截断UL46产物的表达水平高于低传代病毒产生的全长蛋白。这些变化对病毒生长和衰减的影响值得进一步研究。

总之，PRV在体外大量传代可导致大量变异，极大地改变病毒的生物学特性。在本研究中，我们发现在Vero细胞中通过序列传代来衰减PRV的过程中，先后出现了包括大缺失、单核苷酸变异、小帧内插入和帧移突变在内的动态变异模式，这有助于病毒种群的进化，并使病毒逐渐衰减。特别是，UL46中的移码突变影响了相应蛋白的大小和表达水平，并可能对病毒特征产生潜在的重要影响。所有这些数据为更好地了解PRV的衰减和变异提供了重要线索，并进一步深入了解病毒的进化。

在Vero细胞序列传代PRV衰减过程中，先后出现了大缺失、单核苷酸变异、帧内小缺失、帧移突变等动态变异模式，促进了病毒种群的进化，使病毒逐渐衰减。特别是，UL46中的移码突变影响了相应蛋白的大小和表达水平，并可能对病毒特征产生潜在的重要影响。所有这些数据为更好地了解PRV的衰减和变异提供了重要线索，并进一步深入了解病毒的进化。

DMEM:

杜尔贝科改良的鹰牌中号

高温超导:

高通量测序

子:

开式阅读架

减压阀:

假狂犬病病毒

种族:

cDNA末端快速扩增

TCID₅₀：

50%组织培养感染剂量

感谢Editage (https://www.editage.cn/)以编辑本手稿的文字。

资金

本研究得到国家重点研发计划项目(2016YFD0500100)、中国农业科研体系项目(NYCYTX-009)、上海市农业科技重点项目(2015,1 - 7,2016,4 - 2)的支持。

数据和材料的可用性

本研究中包含的数据集可根据要求从通讯作者处获得。

作者指出

1. 叶超和吴继强对这项工作同样做出了贡献。

作者及隶属关系

1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海市闵行区紫月路518号，邮编200241

   叶超，吴继强，童武，单铜陵，程雪飞，徐晶晶，梁超，郑浩，李国新，佟广智

2. 江苏省重大动物传染病与人畜共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009

   佟武，单铜陵，郑浩，李国新，佟广智

贡献

GT和GL设计了这项研究，CY撰写了手稿。CY、JW、WT、CL、XC、JX、HZ进行了相关实验和分析。TS为改进稿件提出了一些有益的建议。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到国新公司李或Guangzhi通．

伦理批准

本研究依据中国农业科学院上海兽医研究所《实验动物护理使用指南》进行。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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