鸭肠炎病毒通过增加胞质钙，激活CaMKKβ-AMPK，引发鸭胚成纤维细胞自噬

背景

我们之前的研究结果表明，在鸭胚成纤维细胞(DEF)中，细胞能量代谢受损有助于鸭肠炎病毒通过5 ' -腺苷单磷酸激活蛋白激酶(AMPK)/结节性硬化复合物2/雷帕霉素通路的哺乳动物靶点诱导自噬。然而，目前尚不清楚是否有其他潜在的AMPK激活机制参与自噬诱导。

方法

研究了DEV感染DEF细胞后CaMKKβ和AMPK的活性。研究了CaMKKβ抑制活性对dev诱导的自噬的影响。此外，还对DEV感染DEF细胞的胞浆钙水平进行了评估。研究了抑制性胞质钙水平对dev诱导的自噬的影响。

结果

在这项研究中，鸭肠炎病毒(DEV)感染在感染后36、48和60 h激活了CaMKKβ及其底物分子AMPK。CaMKKβ抑制剂STO-609或CaMKKβ siRNA显著抑制了DEV向AMPK、LC3I向LC3II转化和GFP-LC3点状分布的激活。此外，抑制CaMKKβ活性也显著降低子代DEV滴度和gB蛋白表达。此外，胞质钙(Ca^{2 +})在dev感染细胞中分别在36、48和60 hpi时高于模拟对照组。用1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N, N, N '， N-四乙酸(BAPTA-AM)处理dev感染细胞可显著降低细胞内Ca^{2 +}离子浓度，以及CaMKKβ和AMPK活性，以及随后的自噬，以及病毒蛋白合成和病毒滴度。

结论

这些结果表明[Ca^{2 +}细胞介导的CaMKKβ激活管理了AMPK的激活，然后正调节自噬，从而为dev -宿主相互作用提供了进一步的见解。

鸭肠炎病毒(DEV)是疱疹病毒科的一员，具有典型的疱疹病毒形态和长约160 Kb的双链线性DNA基因组。DEV可引起水禽多种急性、化脓性和高致死率的感染性疾病，包括鸭病毒性肠炎(DVE)，其特征是由于血管和消化道粘膜损伤造成内出血，以及淋巴器官损伤和病变形成[1］．DVE的发生于1923年在荷兰首次报道，随后蔓延到其他国家。1957年，中国首次报道了DVE的发生，此后在中国南部和东部相对发达的地区普遍存在[2］．DVE广泛且传播迅速，导致高发病率和死亡率，给养鸭业造成巨大的经济损失。然而，分子生物学研究的相对滞后，制约了DVE的防控工作。

病毒感染可诱导自噬，这是一个精确的膜依赖性调节过程，以确保细胞内液体平衡[3.，4，5］．这种反应可以是抗病毒的，也可以促进病毒复制，这取决于病毒的类型和宿主细胞的细胞内环境[6，7］．根据底物类型、种类、调控机制和转运过程的不同，自噬可分为宏自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[8］．大自噬通常是指自噬体通过内质网(ER)与溶酶体融合形成双层膜的过程。在这个过程中，通常被称为自噬，自噬体的内容物被降解。

钙(Ca^{2 +})是一些重要信号转导过程的普遍存在的细胞内信使，包括酶的激活、分化、增殖和基因转录[9，10］．Ca^{2 +}钙敏感蛋白可能在自噬调节过程中发挥双重作用，这取决于细胞类型、细胞内环境和钙^{2 +}丰度(11，12］．过量的细胞质钙从内质网释放出来，然后有报道通过钙/钙调素依赖的蛋白激酶- β (CaMKK)调控的腺苷5′-单磷酸激活蛋白激酶(AMPK)的激活以及随后的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性抑制来诱导自噬[13，14］．

有些病毒可以利用Ca^{2 +}宿主促进复制的离子相关途径[15，16]，如猪圆环病毒2型，可诱导Ca的释放^{2 +}在鸭胚成纤维细胞(DEF)细胞中，ER离子通过肌醇1,4,5-三磷酸受体，被认为是诱导凋亡的原因[17］．轮状病毒编码非结构蛋白4，释放Ca^{2 +}离子进入细胞质，启动自噬激活CaMKKβ信号通路[18］．乙型肝炎病毒X蛋白靶向人类B细胞淋巴瘤2同源物来调节CED-9，从而诱导细胞质Ca的增加^{2 +}离子浓度和随后的细胞死亡秀丽隐杆线虫［19］．单纯疱疹病毒激活钙信号通路[20.]，升高的[Ca2+]细胞介导的camkk β激活恰好管理了AMPK的激活，AMPK通过抑制蓝舌病毒感染细胞的mTOR正调控自噬[21］．

我们之前的研究表明，在DEF细胞中，细胞能量代谢受损通过AMPK/TSC2/mTOR通路参与了dev诱导的自噬[22，23］．然而，AMPK的其他潜在机制是否参与自噬诱导尚不清楚。本研究结果表明，CaMKKβ是DEV感染过程中AMPK的上游调节因子，有助于自噬诱导。CaMKKβ的激活是由胞质Ca的增加引起的^{2 +}内容。本研究为DEV的致病机制研究奠定了基础，并为进一步了解DEV与宿主细胞的相互作用提供了依据。

细胞病毒和质粒

DEF细胞取自9 - 11天的特异性无病原体鸭胚胎，如前所述[24]，在杜尔贝科改良的Eagle 's培养基中培养。不。8116176;Gibco, Grand Island, NY, USA)补充5%胎牛血清(猫。不。1722658;Gibco)和抗生素(0.1 mg/ml链霉素和0.1 mg/ml青霉素)在37°C的5% CO气氛下₂空气/ 95%。DEV株CSC保存于实验室。

为构建GFP-LC3重组质粒，采用引物对LC3F 5’-ATG CAA CCG CCT CTG-3’和LC3R 5’-TCG CGT TGG AAG GCA AAT C-3’从DEF细胞中扩增出与鸭LC3B基因GenBank序列(NW_004676873.1)相对应的LC3基因，并克隆到pEGFP-C1载体中，与GFP蛋白一起表达LC3B蛋白。

病毒感染和药物或小干扰RNA (siRNA)治疗

DEF细胞在37°C下用DEV感染2小时，用无菌磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)洗涤三次，然后在添加胎牛血清的培养基中以2%的浓度维持不同时间点，直到收集样本。然后将细胞在添加胎牛血清的2%培养基中培养，在指定的时间内使用或不使用相同的药物进行预处理。本实验的最佳化学试剂浓度为10 mM 1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N '，N-四乙酸(BAPTA-AM;Abcam, Cambridge, UK)， 5 μM STO-609 (Merck-Millipore, Darmstadt, Germany)，4 μM ionomycin和2.5 μM Fluo-3 AM (Beyotime生物技术研究所，中国海门)。根据制造商的说明，使用WST-1细胞增殖和细胞毒性测定试剂盒(Beyotime)测试药物和sirna的毒性。在感染后36、48和60 h (hpi)，收集DEF细胞进行后续分析。

Western blot分析

根据制造商说明书，使用蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(Beyotime)免疫沉淀裂解缓冲液(Beyotime)从用药物或sirna处理或感染DEV的细胞中提取蛋白质，然后在5×负载缓冲液中煮沸10分钟，用12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到硝化纤维膜上(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK)。用3%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA)在室温下阻断膜2小时，然后与以下一抗在室温下孵育2小时:兔抗lc3b抗体(Sigma-Aldrich Corporation)， mMouse抗camkk β抗体(Sigma-Aldrich Corporation)，兔抗p- ampk抗体(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)，小鼠抗ampk抗体(Thermo Fisher Scientific)，小鼠抗-β-actin抗体(Sigma-Aldrich Corporation)。然后，用IRDye 800 CW山羊抗小鼠或山羊抗兔免疫球蛋白IgG作为二抗，室温孵育1 h。抗体检测采用奥德赛红外荧光扫描成像系统(LI-COR生物科学公司，林肯，NE，美国)。利用Odyssey红外荧光扫描成像系统应用软件3.0版本，通过在图像上添加矩形直接获得数据，实现对western blot图像强度的定量。

共聚焦荧光显微术

为了检测自噬体，在培养皿中70-80%汇合的DEF细胞用2.5 μg GFP-LC3质粒转染磷酸钙转染试剂盒(cat。不。K2780-01;Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA，美国)。在24 hpi时，化学处理或病毒感染的DEF细胞在不同时间点用无水乙醇固定30分钟，细胞核用4 ' -6-二氨基-2-苯基吲哚(cat。不。D1306;Beyotime)。用Leica SP2共聚焦系统(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)共聚焦激光显微镜观察GFP-LC3的绿色荧光。

CaMKKβ核

为了进一步研究细胞自噬对病毒复制的影响，合成了靶向自噬相关基因beclin-1的siRNA(上海吉纳药业股份有限公司，中国上海)。siRNA序列为GCC UAC AAC GAG GAC GAU ATT(正义)和UAU CGU CCU CGU UGU AGG CTT(反义)。用转染试剂转染siRNA和阴性对照(NC)-siRNA转染六孔板24 h，然后用DEV感染。收集细胞样本检测siRNA的作用。

中位组织培养感染剂量(TCID₅₀）

DEF细胞在96孔板中培养，然后用稀释至10的DEV病毒感染⁻¹到10⁻⁸．72hpi时观察细胞并记录病理变化。采用Reed-Muench法测定病毒滴度。

细胞内钙^{2 +}流式细胞仪检测

胞质游离钙^{2 +}使用Fluo-3 AM检测离子。Fluo-3 AM本身不与Ca结合^{2 +}但一旦将染料添加到细胞中，它就可以与Fluo-3 AM杂交，并且Fluo-3 AM在与Ca结合时会发出荧光^{2 +}．DEF细胞用DEV感染或BAPTA-AM处理指定时间，然后用Fluo-3 AM在37°C黑暗中孵育1小时。之后，细胞悬浮在磷酸盐缓冲盐水中。观察荧光，作为细胞内钙的指示物^{2 +}使用流式细胞仪(BD FACSAria™;BD Biosciences, San Jose, CA, USA)，激发波长为488 nm。

统计分析

所有实验结果均以三次独立实验的均数±标准差(SD)表示。统计学分析采用Tukey 's检验。概率(p)值< 0.05为有统计学意义。

CaMKKβ-AMPK可能参与了dev诱导的自噬

DEF细胞通过AMPK/TSC2/mTOR途径诱导DEV自噬。一项旨在确定是否有其他潜在的AMPK激活机制参与自噬诱导的研究表明，与模拟感染的细胞相比，DEV感染在36、48和60 hpi时显著增加了细胞内CaMKKβ及其底物分子磷酸化的AMPK (p-AMPK)水平。微管相关蛋白轻链(LC3)是自噬体膜上的一种自噬标记蛋白。当自噬体形成时，LC3I被磷脂酰乙醇胺(PE)磷酸化成LC3II。LC3II保留在自噬体膜上，直到与溶酶体融合。因此，LC3II的表达在一定程度上衡量了自噬体的数量[22］．LC3II的表达水平也明显升高(图。1 a, b)．这一结果表明CaMKKβ-AMPK可能参与了dev诱导的自噬。

CaMKKβ是AMPK的上游激活因子，参与dev诱导的自噬

接下来，我们进一步验证了CaMKKβ在dev诱导的自噬中的作用。由于CaMKKβ在dev感染的DEF细胞中被激活，因此使用已知的CaMKKβ抑制剂STO-609来评估与CaMKKβ抑制相对应的自噬变化。结果表明，与对照细胞相比，STO-609处理的dev感染细胞AMPK、LC3I向LC3II转化的激活显著降低。此外，在药物处理的对照细胞中观察到较少的DEV gB蛋白(图。2)．

为了消除化学药物的非特异性作用，使用siRNA抑制CaMKKβ的表达。如图所示。2 b，与转染NC-siRNA的细胞相比，转染siRNA的DEF细胞，CaMKKβ、活化AMPK和LC3II的表达水平显著降低(图。2 b)．与对照细胞相比，siCaMKKβ处理的dev感染细胞中GFP-LC3点状蛋白的数量显著减少。2摄氏度)．

由于化学药物或siRNA抑制CaMKKβ会降低病毒蛋白的表达，我们进一步检查了抑制CaMKKβ是否会降低病毒复制。用STO-609或siCaMKKβ处理dev感染的DEF细胞，病毒滴度显著降低。的TCID₅₀，与对照细胞相比，在48 hpi时，如图所示。2d, e这些结果表明，在dev感染的DEF细胞中，自噬与CaMKKβ的激活有关，CaMKKβ是参与dev诱导的自噬的AMPK的上游激活因子(图。2 d, e)．

DEV感染增加细胞内Ca^{2 +}激活CAMKKβ

为了进一步探索自噬诱导的机制，上游调控因子被逐步探索。一些报道显示胞质钙含量增加^{2 +}浓度([Ca^{2 +}cyto)促进自噬过程[14，25］．dev感染的DEF细胞用Fluo-3 AM孵育。然后，在36,48,60处，胞内Ca^{2 +}经流式细胞术检测，胞浆Ca^{2 +}分别在dev感染细胞中高于模拟感染对照细胞(图。3 b)．结果还表明，细胞浆钙含量增加^{2 +}依赖于初始病毒剂量，在48 hpi时DEV感染多重度(MOI)为0.1-10。3)．

BAPTA-AM是一种成熟的细胞内Ca螯合剂^{2 +}离子。用25 μm的BAPTA-AM处理模拟或dev感染的DEF细胞30 h，细胞内Ca^{2 +}采用流式细胞仪检测。结果表明，添加BAPTA-AM可降低细胞内Ca含量^{2 +}水平(无花果。3.c).相应的，CaMKKβ和AMPK活性在bapta - am处理的细胞中显著降低。加入BAPTA-AM后，LC3II的表达和病毒蛋白合成明显降低(图。3 d)．共聚焦荧光显微镜观察到GFP-LC3分布为与自噬空泡相关的离散点。药物治疗后GFP-LC3点状蛋白数量的变化可能与自噬活性的变化有关。据推测，与对照细胞相比，bapta - am处理的dev感染细胞中GFP-LC3点状蛋白的数量显著减少，表明自噬受到抑制(图。3 e)．

与对照细胞相比，bapta - am处理的DEF细胞中gB蛋白的表达降低。与结果一致，与对照组细胞相比，bapta - am处理的DEF细胞的病毒滴度显著降低。TCID₅₀检测DEV病毒滴度(图2)。3 f)．总之，这些数据反映了Ca^{2 +}是dev感染的DEF细胞在CaMKKβ-和ampk依赖过程中自噬功能所必需的。

不受药物治疗影响的细胞活力

siRNA靶向内源性基因或药物可能影响了细胞活力并影响了我们的结果。本研究中使用的化合物对细胞活力的影响由WST-1测定。经处理的细胞的活力几乎等同于模拟细胞，因此siRNA或药物处理不影响DEF细胞的活力(图。4)．

自噬是一种严格调控和进化保守的细胞内过程，细胞破坏和循环溶酶体中的细胞成分。大量证据表明，病毒诱导的自噬在病毒生命周期和致病性中起着重要作用[26］．据报道，许多病毒通过多种途径诱导自噬[6，27］．我们前期的研究结果表明，DEV通过AMPK-TSC2-MTOR信号通路通过细胞能量代谢受损诱导自噬激活。AMPK上游的两个信号分子涉及细胞能量和Ca^{2 +}-介导的CAMKKβ激活。然而，Ca^{2 +}CaMKKβ在dev诱导的自噬过程中可激活AMPK及一系列下游信号通路。本研究结果表明，DEV通过增加胞质钙，激活CAMKKβ及其底物分子APMK，从而触发DEF细胞的自噬^{2 +}浓度。

自噬首先与细胞内钙有关^{2 +}监管。随后的研究发现，去除细胞内或细胞外Ca^{2 +}离子抑制自噬[28］．虽然Ca^{2 +}信号和自噬调控已被报道，其潜在机制尚不清楚。Ca^{2 +}离子对自噬的控制分为两种对立的观点，即Ca^{2 +}离子抑制自噬，促进自噬。在本研究中，DEV感染诱导细胞内Ca升高^{2 +}并激活DEF细胞中自噬体的形成。

CaMKKβ是最有效的Ca^{2 +}依赖性蛋白激酶，参与多种信号转导过程。众所周知，AMPK (Thr172)、CaMKI (Thr172)、CaMKIV (Thr200)可以被CaMKKβ直接磷酸化参与自噬[29］．此外，CaMKKβ的激活主要依赖于Ca结合引起的构象变化^{2 +}和钙调蛋白。因此，游离钙的水平^{2 +}对CaMKKβ的激活至关重要[30.］．

Ca^{2 +}CaMKKβ与T细胞、下丘脑神经细胞和内皮细胞中AMPK的激活有关，提示Ca^{2 +}代谢可能在ampk - mtor调控的自噬过程中发挥重要作用[14］．最近的研究发现，在轮状病毒感染的细胞中，CaMKKβ因Ca的增加而被激活^{2 +}水平，进一步激活AMPK，导致随后的自噬[18］．人巨细胞病毒感染可激活CaMKKβ/AMPK通路促进细胞糖代谢和病毒复制[31］．在这里，虽然DEV感染确实增加了Ca的细胞质含量^{2 +}离子的作用机制尚不清楚。然而，据推测，该病毒可能编码一种或多种蛋白质，改变生物膜对钙的渗透性^{2 +}，导致[Ca .^{2 +}起源于ER或高尔基体的cyto [Ca .^{2 +}]储存，或细胞外环境[18，32］．我们前期的研究结果证实了内质网应激反应参与了dev诱导的自噬，提示内质网应激与[Ca^{2 +})阶段。

本研究结果表明，CaMKKβ是DEV感染过程中AMPK的上游调节因子，有助于自噬诱导。CaMKKβ的激活是由胞质Ca的增加引起的^{2 +}内容。本研究为DEV的致病机制研究奠定了基础，并为进一步了解DEV与宿主细胞的相互作用提供了依据。

AMPK:

腺苷5 ' -单磷酸活化蛋白激酶

BAPTA-AM:

1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N, N, N '， N-四乙酸

DEF:

鸭胚成纤维细胞

戴夫:

鸭肠炎病毒

呃:

内质网

资金

黑龙江省自然科学基金项目(QC2018033)、黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD2016006)、中央公益性科研单位基础基金项目(NO.1610302017013;NO.1610302018013)。

作者的贡献

HC、LZ和HY构思并设计了该研究。HY和SL进行了实验并分析了数据。YW和HH画了图。HY和LZ撰写了这篇论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

数据和材料的可用性

本研究中分析的数据集可由通讯作者根据合理要求提供。

作者指出

1. 尹海昌和赵丽丽对这项工作同样有贡献。

作者及隶属关系

1. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，动物生物技术国家重点实验室，黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，哈尔滨哈平路678号，150069

   尹海昌，赵丽丽，王一平，李思琪，霍红，陈红艳

2. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江齐齐哈尔161006

   海昌阴

3. 黑龙江省寒区抗性基因工程与生物多样性保护重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006

   海昌阴

相应的作者

对应到支陈．

伦理批准并同意参与

该研究得到了哈尔滨兽医研究所的批准，并按照动物伦理准则和批准的协议进行。动物伦理委员会批准文号:黑龙江- syxk -2006-032。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明，这篇文章的发表不存在利益冲突。

出版商的注意

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