UL41零型伪狂犬病毒变异体的体外和体内生成和鉴定

背景

甲型疱疹病毒病毒粒宿主关闭(vhs)基因UL41可诱导宿主mrna降解并关闭宿主蛋白质合成。vhs在HSV-1和HSV-2中的作用在以往的研究中得到了广泛的研究，但对PRV的vhs蛋白知之甚少。

方法

提出了一种结合CRISPR/Cas9和Gibson组装的新方法来生成UL41 null PRV变体。进一步研究了UL41 null PRV的体内外特性。采用荧光素酶法、Western-blot和RT-qPCR检测PRV变异株UL41蛋白vhs活性。

结果

基于同源重组的Gibson组装可以高效地实现病毒DNA片段一步插入供体质粒(> 80%)。Cas9/gRNA进一步大大提高了同源重组的效率。利用该方法，我们能够快速生成UL41型PRV变异的零病毒和可逆病毒。与野生型(JS-2012)相比，UL41缺失病毒在Vero细胞中表现出明显更小的斑块和更低的滴度，并在小鼠中表现出受损的致死率和神经侵袭性。不同PRV株UL41蛋白的vhs活性差异较大，其中JS-2012株的vhs活性明显弱于欧美株。此外，UL41空病毒在感染早期也能显著降低宿主基因的表达，提示其他病毒因素可能也参与了宿主关闭。

结论

CRISPR/Cas9结合Gibson组装高效生成UL41 null PRV。与野生型相比，UL41缺失PRV的体外复制能力和体内神经侵袭能力均有所下降。此外，PRV变异体UL41蛋白的vhs活性明显弱于欧美样PRV SC，提示PRV变异体UL41蛋白缺乏vhs活性。

伪狂犬病毒(PRV)是病毒的一员alphaherpesviridae亚科(1］．它是奥耶斯基氏病的病原，可引起新生仔猪严重的神经系统紊乱和母猪生殖失败[2］．结合DIVA(区分受感染动物和接种疫苗的动物)疫苗接种策略，使PRV在许多国家(主要是欧洲、美国和新西兰)被根除或得到良好控制，仅发生零星疫情[3.］．然而，最近在中国接种了Bartha-K61疫苗的养猪场出现了新的PRV变种，在猪中显示出增强的毒力，并造成了巨大的经济损失[4，5］．从这些疫情中分离出的PRV变异的基因组分析表明，它们在进化上不同于欧美菌株[6］．

PRV的基因组由约150kb的线性双链DNA组成，其中包含70个基因，其蛋白产物尚未得到很好的表征[2］．同源重组(HR)和细菌人工染色体(BACs)定点诱变传统上被用于操纵疱疹病毒基因组和研究其基因功能[7］．如今，CRISPR/Cas9正成为一种用于多种生物DNA工程的新工具[8］．通过CRISPR/Cas9工程的大型DNA病毒也有报道，包括腺病毒，单纯疱疹病毒1 (HSV-1) [9]，甚至PRV [10］．RNA引导的Cas9核酸酶通过简单地在其引导RNA (gRNA)中指定一个20-nt靶向序列，用于有效的真核细胞基因组工程。Cas9/gRNA介导的DNA切口涉及两种主要修复机制之一:HR或容易出错的非同源末端连接，经常导致小的插入或缺失[11］．由Daniel Gibson博士及其同事开发的Gibson组装是一种新颖的克隆方法，在将DNA片段克隆到线性化载体时，无需限制性内切酶消化[12］．它允许在等温条件下单步组装和克隆寡核苷酸，并且只需要一个线性化的矢量和两端具有短序列的线性插入，这些短序列彼此同源。

UL41基因编码病毒粒子宿主关闭蛋白(vhs)，这是阿尔法疱疹病毒病毒粒子中的一种被膜蛋白[13］．该蛋白导致宿主和病毒mRNA的急剧降解，并在感染早期关闭宿主细胞蛋白质合成[14，15］．此外，vhs的内切酶活性已通过兔网织红细胞体外翻译系统得到证实[16]和体外荧光素酶报告试验[17］．vhs在HSV-1和HSV-2病毒中的作用已被广泛研究，但对其他病毒的vhs蛋白知之甚少。PRV vhs蛋白也由UL41编码，在氨基酸水平上与HSV-1 UL41蛋白的同源性约为38.4% [18］．进一步研究表明，纯化后的vhs蛋白来源于欧美菌株(TNL菌株)，表达于大肠杆菌在体外显示核糖核酸酶活性[19］．随后Lin等人生成了一种gfp标记的UL41空型欧美PRV毒株，并将其vhs活性与野生型PRV (TNL毒株)进行了比较，结果表明PRV vhs参与宿主关闭，并在小鼠模型中对PRV的毒力有贡献[20.］．

本研究将CRISPR/Cas9技术与Gibson组装法相结合，实现了对PRV突变体的操纵和拯救。结合Cas9/gRNA一步Gibson组装和切口，大大提高了构建突变病毒的效率。使用这种新方法，我们能够快速生成UL41零病毒和还原病毒的PRV变种。与野生型相比，UL41空型病毒在体外实验中表现出明显更小的斑块和更低的滴度，并且在小鼠体内的致死率和神经侵袭性受损。不同PRV株UL41蛋白的vhs活性差异较大，其中JS-2012株的vhs活性明显弱于欧美株。此外，UL41空病毒在感染早期也能显著降低宿主基因的表达，提示其他病毒因素可能也参与了宿主关闭。

细胞和病毒

猪肾(PK)-15、Madin-Darby牛肾(MDBK)、非洲绿猴肾(Vero)和人胚胎肾293T (HEK293T)细胞在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle 's培养基(DMEM)中培养。细胞培养在37°C的5% CO中保持₂细胞培养箱。JS-2012株(GenBank接入号:KP257591)是在中国分离并保存在我们实验室的PRV变种[21， SC菌株(GenBank Accession No.;KT809429.1)是中国较早的PRV分离株，其UL41基因来源于Bartha疫苗株(属于欧美毒株的毒株的衍生物)[22］．

质粒、寡核苷酸和酶试剂

质粒pEGFP-C3购自Clontech(志贺，日本)，pMD-18 T购自Takara(中国大连)。用质粒pCMV-3 × Flag (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)表达PRV JS-2012和SC的UL41蛋白，分别生成pCMV-3 × Flag-JS-2012 UL41和pCMV-3 × Flag-SC UL41。本研究中使用的pLentiCRISPRv1是张锋实验室的礼物，之前已经描述过[23］．所有低聚物或引物均由Genewiz(中国苏州)合成。T4多核苷酸激酶(PNK)，生态房车,BsmBI,生态RI,萨尔I, Gibson Assembly®Master Mix和T4 DNA连接酶购自New England Biolabs (Ipswich, MA)。

供体质粒构建

为了将eGFP标记插入到病毒基因组中，我们首先生成了一个供体质粒pBlue-eGFP-linker。简单地说，eGFP盒式磁带片段(附加文件1:图S1)和UL41 ORF序列侧翼的两个片段(附加文件1:图S1)分别从pEGFP-C3和JS-2012基因组中PCR扩增，引物分别为EGFP-F&R、Up arm F&R和Low arm F&R(表1)1)．凝胶纯化PCR产物克隆到pMD-18 T中，经DNA测序证实。同时，质粒pBluescript II SK(+)通过消化线性化生态房车。将共10 μL纯化质粒和PCR产物混合物(质粒:各产物摩尔比= 1:5)组装于10 μL Gibson Assembly®Master Mix中，50℃孵卵1 h，用10 μL Gibson反应混合物转化100 μL DH5α残基大肠杆菌遵循标准转换协议的单元。用引物GFP-F&R对eGFP序列进行靶向PCR鉴定阳性克隆1)，经DNA测序证实。

为了通过HR从病毒中删除eGFP盒，构建了另一种供体载体pBlue-linker。两个序列(附加文件1使用Forward arm-F&R和Backward arm-F&R引物从JS-2012的基因组中扩增出UL41 ORF侧翼的HR(表S1)1)．同样，要还原病毒基因组上的UL41，需要两个PCR产物(附加文件1采用引物UL41-up- f&r和UL41-down- f&r，从JS-2012基因组中PCR扩增出包含UL41侧翼区和3 '端有框内HA标签的UL41 ORF(表S1)1)．然后，使用上述相同的组装方法将相关插入克隆到线性化的pBluescript II SK(+)向量中。阳性克隆经PCR鉴定，DNA测序证实。

pLentiCRISPRv1-gRNA表达载体的构建

切割eGFP编码序列的特定gRNA设计如前所述[24]，如表所示1．简而言之，低聚物gRNA-eGFP-F和gRNA-eGFP-R分别在无rnase的水中重悬至最终浓度为100 μM。然后将1 μL合理低聚物(gRNA-eGFP-F)、1 μL反向低聚物(gRNA-eGFP-R)、1 μL 10 × T4 PNK反应缓冲液、0.5 μL T4 PNK和6.5 μL RNase-free水混合。将得到的10 μ l反应混合物进行退火和磷酸化，克隆得到的双链gDNABsmpLentiCRISPR载体经T4 DNA连接酶双酶切。DNA测序进一步验证正确插入。

产生病毒突变体

为了生成UL41无病毒，我们首先必须将eGFP盒导入病毒基因组，以HR取代UL41 ORF，并生成ΔUL41 eGFP病毒(图4)。1)．然后，将UL41 ORF侧翼的序列和含有帧内HA标记的UL41序列分别克隆到pBluescript II SK(+)中，分别与ΔUL41 eGFP病毒基因组和靶向eGFP的plenticrisprv1 - grna表达载体共转染。在荧光显微镜下选取无荧光信号的斑块，并通过PCR和测序进行验证，以鉴定UL41无病毒和UL41可逆病毒(图。2)．

简单地说，如前所述，从受感染的Vero细胞中提取PRV基因组DNA [25］．然后，使用FuGENE HD转染试剂(Promega, Madison, WI)将相应的供体质粒(2 μg)和来自j -2012的病毒基因组DNA，或来自ΔUL41 eGFP病毒(6 μg)和pLentiCRISPRv1-gRNA (1 μg)的基因组DNA共转染到Vero细胞中。当观察到大约80%的细胞病变效应时，收获转染的细胞。通过空斑纯化选择重组病毒，通过存在(ΔUL41 eGFP病毒)或不存在(UL41无病毒或UL41逆行病毒)绿色荧光、特异性PCR和Western-blot进行鉴定。经过三轮空斑纯化，获得重组病毒原液。

动物实验

为评价每种病毒对小鼠的致病性，将6 ~ 8周龄SPF级BALB/c小鼠分为7组(每组10只)。1 ~ 3组小鼠鼻内接种10 μL 10⁵50%组织培养感染剂量₅₀)、UL41空病毒和UL41逆行病毒在全麻麻醉下的表达。4 ~ 6组小鼠鼻内接种10 μL 10⁴TCID₅₀在麻醉状态下，分别对PRV JS-2012、UL41空病毒和UL41逆转录病毒进行免疫应答。第7组小鼠在麻醉状态下接种等量DMEM，作为对照组。在10天的时间里，每天对动物进行监测并记录它们的健康状况。感染后每天监测临床症状和死亡人数(表2)2)．

为分析每种病毒对小鼠神经的侵袭性，采用10 μL 10鼻内接种小鼠⁴TCID₅₀在麻醉下注射PRV JS-2012、UL41零病毒和UL41逆病毒，每日测量感染小鼠的体重变化。然后在指定的时间牺牲幸存的小鼠。采集小鼠三叉神经节、脑干、嗅球、大脑和小脑，80℃冷冻。然后将组织解冻，均质，然后再次冷冻。匀浆被解冻，超声，离心，并用TCID滴定₅₀Vero细胞单层检测。

所有动物实验均按照中国农业科学院上海兽医研究所《实验动物护理与使用指南》进行。

vhs活性的功能测定

该测定方法是根据以前的一项研究进行的，只是进行了微小的修改[17］．简而言之，采用引物PCR扩增了PRV JS-2012的UL41编码序列生态RI-vhs-F (ggaattcaatggggctcttttggcctttta)和萨尔将I-vhs-R (gcgtcgacttattttctcctatgggcgtt)克隆至3 × Flag标记表达载体pCMV-3 × Flag生态RI -萨尔I消化和T4 DNA结扎。采用引物SC-UL41- f (catcgatagctgatagggctcttggcctttta)和SC-UL41- r (gagtcgactggtaccgatttatttttttctcctatgggcgt) pcr扩增PRV SC的UL41编码序列，并将其克隆到线性化的pCMV-3 × Flag中生态Gibson组装反应中的RV裂解。转染前24小时将HEK293T细胞接种到6孔微量滴度板中，然后用200 ng SV40荧光素酶报告基因(pgl3 -对照)单独转染或与pCMV-3 × Flag- j -2012 UL41、pCMV-3 × Flag- sc UL41或pCMV-3 × Flag空载体以2 μg剂量联合转染细胞，使用Lipofectamine™3000试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)。转染36 h后，用200 μL 1 ×被动裂解缓冲液(Promega)裂解细胞，测定荧光素酶含量。用Bradford蛋白测定法(Bio-Rad, Hercules, CA)检测裂解物的总蛋白浓度。每个样品的荧光素酶值归一化到各自的总蛋白量。采用兔单克隆抗flag抗体(Sigma-Aldrich)检测JS-2012 UL41-Flag或SC UL41-Flag的表达;使用单克隆抗-β肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich)检测β-肌动蛋白的表达，以β-微管蛋白作为负荷对照。

RNA提取和RT-qPCR

每种PRV株以10倍感染倍数(MOI)模拟感染或感染Vero细胞。另一方面，对于环己亚胺(CHX)分析，Vero细胞在感染前未处理或加100 μg/ml CHX处理。然后在感染后3小时，使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取每个样本的总RNA。用紫外分光光度法测定RNA收率和质量。

接下来，1 μg总RNA用2u RNase-free DNase I (Ambion, Austin, TX)进行DNase处理。然后使用Superscript III RT-PCR系统(Invitrogen, Carlsbad, CA)根据制造商关于寡核苷酸(dT)引物cDNA合成的说明反转录rna。利用SYBR Premix Ex Taq (Takara)对cDNA进行qPCR，检测宿主基因GAPDH和β-actin的表达，以及病毒基因UL41和IE180的表达;同时，28S rRNA在每次运行中都被用作内参基因。相应引物见表3.由Genewiz合成。qPCR扩增子用Eppendorf (Hamburg, Germany)热循环仪检测，最终体积为25 μL，循环条件为:95°C 2 min, 95°C 15 s, 60°C 30 s，循环40次。每个候选基因的相对数量用ΔΔCt法测定。

吉布森组装允许有效的单步克隆多个片段到一个载体

为了简化供体质粒的构建，采用Gibson组装方法将多个片段一次性克隆到pBluescript中。等量的摩尔碎片(0.15 pmol每个)和线性载体(0.03 pmol)混合在一起进行体外组装，然后进行转化。接下来，一些大肠杆菌随机选取菌落进行PCR分析。在构建pblue - egfp -连接子的过程中，20个菌落中有17个呈阳性，并通过引物GFP-F&R进行PCR鉴定;在构建pBlue-linker的过程中，通过Forward arm-F&R PCR, 18个菌落中有15个被证实为阳性(图2)。3）;对于用于UL41逆转的供体质粒，几乎所有选择的菌落(11/12)都是阳性的(数据未显示)。DNA测序证实，每个片段都正确准确地插入到载体中(数据未显示)。这有力地证明了Gibson组装是将多个片段无缝单步克隆到目标载体的强大工具。

CRISPR/Cas9切口增强了供体质粒与PRV基因组间的HR效率

为提高供体质粒与PRV基因组之间发生HR的概率，本研究采用CRISPR/Cas9技术，生成UL41零病毒和UL41逆转录病毒。与未加Cas9/gRNA的组相比，Cas9对eGFP序列的切割使大多数病毒感染细胞中的eGFP表达失活(图9/gRNA处理组)。3 b)，表明Cas9具有较高的切口效率。为了筛选UL41空病毒，从cas9处理组中选取22个无绿色荧光的病毒空斑，提取DNA并进行PCR验证。其中12个斑块经PCR验证为阳性(54.5%)。3 c)和Sanger测序。对于UL41逆行病毒的筛选，PCR验证19个病毒斑块中有18个呈阳性(图41)。3 c)．特异性PCR(图;3 d)和Western-blot(图。3 e)都确认了UL41的null或UL41的反转。最后，RFLP分析表明，所有菌株都具有相同的RFLP模式，并保持了每个病毒基因组的完整性(图。3 f)．因此，CRISPR/Cas9切口可在很大程度上提高供体质粒与PRV基因组之间的HR效率。

PRV中UL41突变体的鉴定

先前对其他疱疹病毒UL41基因的研究表明，UL41缺失PRV突变体在体外复制效率较低。正如预期的那样，在Vero细胞中，UL41空PRV的滴度显著低于JS-2012和可逆病毒(图2)。4)，斑块大小也明显变小(图。4 b, c)．特别是，在感染24小时后，UL41零突变体的滴度几乎比JS-2012和可逆病毒低一个数量级(图2)。4)．而在PK-15和MDBK细胞中，UL41无病毒细胞的复制能力没有受到太大影响，仅略低于JS-2012和可逆病毒(图2)。4)．UL41空病毒在MDBK细胞中的空斑大小明显小于JS-2012和逆反病毒，而在PK-15细胞中的空斑大小与JS-2012相当，但明显小于逆反病毒(图2)。4摄氏度)．相比之下，JS-2012及其可逆病毒的复制和传播能力在所有三个细胞系中非常相似(图2)。4)．

为评价UL41在小鼠PRV变异致病性中的作用，采用JS-2012、UL41零病毒和UL41逆病毒鼻内接种BALB/c小鼠。小鼠接种了这两种疫苗⁵TCID₅₀和10⁴TCID₅₀三种病毒都表现出神经系统症状，如不安、瘙痒、抑郁和咬皮肤(表2)．10点⁵TCID₅₀结果表明，JS-2012和UL41逆转病毒组小鼠在接种后3天内全部死亡，而UL41无病毒组小鼠在接种后延迟1天死亡。5)．10点⁴TCID₅₀结果表明，JS-2012和UL41逆反病毒组小鼠均死亡4 dpi, UL41无病毒组小鼠存活2/10(图2)。5)，临床症状较其他组延迟1天(表2)．由此可见，UL41缺失在一定程度上可以延缓和降低小鼠的临床症状和致死率。

PRV JS-2012、UL41恢复病毒和空病毒的神经侵袭动力学

目的研究PRV各毒株的神经侵袭、病毒在脑组织中的复制及10株感染小鼠体重的变化⁴TCID₅₀对UL41可逆病毒和空病毒进行了评估。感染PRV后，感染小鼠的体重在1 dpi时增加，在2 dpi时开始下降(图。6)．但是，与感染JS-2012或UL41逆反病毒的小鼠相比，感染UL41无病毒的小鼠体重减轻程度显著降低(图2)。6)．此外，在病毒感染的小鼠中，可以在三叉神经节中检测到传染性病毒的滴度(图。6 b)、脑干(图;6摄氏度)和嗅球(图;6 d)，相比之下，在大脑和小脑内未检测到传染性病毒(数据未显示)。3株病毒在三叉神经节均检出感染性病毒，3株病毒在三叉神经节100%(5/5)均检出感染性病毒(数据未显示)，平均JS-2012滴度约为3.9 × 10⁴TCID₅₀UL41病毒平均滴度约为3.1 × 10⁴TCID₅₀UL41零病毒平均滴度显著降低，为3.2 × 10^3.TCID₅₀(图/毫升/组织。6 b)．与三叉神经节相比，脑干的感染性病毒滴度相对较低，感染性病毒滴度在3 dpi时达到最高(图。6摄氏度)，而在JS-2012脑干3 dpi分别只检测到80%(4/5)、40%(2/5)和0%(0/5)的感染性病毒、UL41空病毒和UL41逆病毒(数据未显示)。嗅球内各时间点病毒平均滴度均小于10²TCID50 / mL /组织(无花果。6 d)，并且在UL41空病毒组所有小鼠中均未检测到感染性病毒。与此相反，在大脑和小脑未检出传染性病毒。

检查主机关闭活动

对PRV UL41的多序列比对显示，与欧美株和中国早期株PRV SC相比，PRV变体JS-2012在多个氨基酸上存在差异。7一个)，是一种可能的巴沙疫苗和中国地方性毒株的重组株[22］．为了比较UL41蛋白在不同PRV株间的vhs活性，将SV40荧光素酶报告质粒与pCMV-3 × flag - j -2012 UL41或pCMV-3 × Flag-SC UL41结合转染HEK293T细胞。令人惊讶的是，PRV SC的UL41蛋白可以显著降低荧光素酶信号，而PRV JS-2012则不能将荧光素酶的表达显著降低到SC的水平(图。7 b)，提示与其他PRV株相比，PRV JS-2012 UL41的vhs功能可能存在缺陷。此外，已有研究表明，PRV UL41可显著降低β-actin的表达[20.］．Western blot检测PRV UL41转染实验中β-actin的表达，结果显示SC UL41比JS-2012更能显著降低β-actin的表达(图2)。7 b)．同时检测prv感染和模拟感染Vero细胞中β-actin和GAPDH基因表达的变化。同样，这两种基因在sc感染细胞中的表达水平比在JS-2012及其可逆病毒感染细胞中的表达水平明显降低。但与模拟处理组相比，JS-2012及其可逆病毒仅能轻微降低宿主基因的表达(图2)。7 c)．

此外，令人惊讶的是，UL41空病毒感染可显著下调β-actin的表达(图。8)和GAPDH(图;8 b在感染后3 h，这种下调比JS-2012病毒和可逆病毒引起的下调更为显著;CHX处理病毒感染细胞可显著降低病毒UL41基因表达10倍以上(图2)。8 c)，但对β-肌动蛋白的下调无显著影响(图;8)和GAPDH(图;8 b)病毒感染引起的表达。与CHX处理对UL41转录的强烈抑制相反，每个PRV株中唯一的即早基因(IE180)比未经过CHX处理的株显著上调了数倍(图2)。8 d)．由此可见，PRV变异体UL41蛋白与病毒感染早期的宿主关闭关系不大。

从2011年开始，重新出现的PRV变种在中国各地的养猪场中越来越多地分离出来[4，21，26，27，28］．基因组分析显示，这些变异在进化上不同于欧美菌株[6］．据报道，甲型疱疹病毒UL41编码一种病毒粒子成分，诱导宿主mrna降解并关闭大多数宿主蛋白质合成。相比之下，PRV的UL41同源物的功能还不太清楚。因此，在本研究中，通过一种新方法生成了PRV变体的UL41零突变体，并在体外和体内进行了表征。

以前，依赖于细胞重组和修复机制的HR方法被用于将可选择的标记引入病毒基因组，从而实现突变病毒的富集和纯化。然而，这一过程费时费力，突变体携带的可选择标记可能会影响突变病毒的特性。BAC技术是研究疱疹病毒的一种非常成功的工具，因为BAC可以容纳这些病毒的大基因组DNA [7］．此外，原核基因组工程可以在比哺乳动物细胞重组程序更短的时间内有效地改变BACs。然而，构建和操纵含有BACs的病毒是复杂的，对于缺乏经验的研究人员来说可能很困难。

在这里，我们采用了一种结合CRISPR/Cas9和Gibson组装的新方法来操纵PRV基因组。与使用限制性内切酶的传统克隆方法相比，Gibson组装可以在不引入任何额外序列的情况下无缝、单步、高效地克隆多个片段(图2)。3)．在本研究中，它只需要相邻DNA片段之间的短重叠序列，范围从20到37 bp(表1)．利用Gibson组装，我们成功地将多达三个不同长度的DNA片段(1238 bp, 1544 bp和1709 bp)一步克隆到线性化的载体中。通过与JS-2012基因组的HR，通过筛选显示绿色荧光的病毒斑块，很容易获得ΔUL41 eGFP病毒。随后，采用同样的策略，通过将UL41 ORF的上游(1238 bp)和下游(1537 bp)区域或两个含有UL41 ORF和HA-tag的PCR产物(884 bp和1799 bp)分别插入到pBluescript II SK(+)中，一步成功构建了两个供体载体，用于生成UL41无病毒和UL41可逆病毒。由此证明，基于同源重组的Gibson组装可以非常高效地实现病毒DNA片段一步插入供体质粒。

研究表明，CRISPR/ cas9触发的位点特异性切割可以提高原核和真核细胞基因组的HR效率，也可以提高DNA病毒基因组的HR效率[8，29，30.］．因此，我们采用Cas9/gRNA技术生成UL41空病毒和UL41逆转录病毒。为了降低脱靶和非靶切割的概率，使用了先前验证的用于切割eGFP序列的gRNA(表2)1)．正如预期的那样，在ΔUL41 eGFP病毒的eGFP盒中切开Cas9/gRNA，通过重组修复显著增强了供体质粒与病毒基因组的整合，并进一步促进了生成的病毒储存中超过50%的HR的发生(图)。3 c)．相比之下，哺乳动物细胞中自发HR的发生率通常很低，在0.002至0.3%之间[31］．在本研究中，单纯的人力资源效率也很低(图。3 b)，而Cas9/gRNA的应用可以大大提高HR的效率，减少了从荧光病毒中选择重组病毒(无荧光病毒)的繁琐过程(图9)。3 b, c)．

进一步研究了UL41零病毒的体内外特性。UL41基因不是PRV在细胞培养中生长所必需的，但它的缺失导致三种不同细胞类型的斑块变小和滴度降低。特别是，在Vero细胞中，UL41空病毒的复制和传播能力比其他两种细胞中表现出更明显的受损(图2)。4)，表明UL41的缺失只会损害特定物种细胞系的复制。可以推测，病毒在不同物种中的适应性也不同。至于体内特征，UL41缺失病毒似乎损害小鼠的致死率，至少在一定程度上。然而，值得注意的是，UL41无效毒株在易感动物中仍然保持着强毒力，只有在以相对较低剂量挑战的组中，小鼠的致死率才显著降低(10⁴TCID₅₀)．与野生型PRV相比，通过监测小鼠的临床体征和死亡数量，UL41零病毒接种小鼠的感染进展延迟，这表明UL41零病毒在小鼠中的致病能力部分不足。进一步评估了UL41无病毒、UL41逆病毒和JS-2012的神经侵袭能力。急性感染期间(1 ~ 3 dpi)，可在三叉神经节、脑干和嗅球检测到感染性病毒(图2)。6)．3株三叉神经节感染病毒均可检出，且均表现出较高的滴度，3 dpi时，JS-2012和UL41逆行病毒的平均滴度显著高于UL41无病毒。脑干和嗅球的PRV滴度低于三叉神经节。由此可见，三叉神经节是PRV感染的主要靶点，急性感染时UL41缺失可显著损害PRV在三叉神经节的复制和感染。

在许多阿尔法疱疹病毒中，UL41基因一直被认为是病毒粒子宿主关闭基因。先前的研究表明，HSV-1可以通过vhs蛋白的RNase活性诱导包括β-actin在内的宿主mRNA的快速降解[32，33，34］．为了表征PRV变异体UL41基因的宿主关闭活性，本文采用荧光素酶法检测了PRV UL41蛋白的vhs活性。令人惊讶的是，PRV SC(欧美样品系)的UL41蛋白能显著降低荧光素酶信号，而PRV JS-2012的UL41蛋白却不能将荧光素酶的值显著降低到SC的水平(图。7 b)，表明PRV变种UL41的vhs功能可能与欧美菌株相比部分缺失。此外，既往研究表明PRV TNL(欧美样株)感染可显著降低β-actin的表达。Western blot检测PRV UL41转染实验中β-actin的表达，结果显示SC UL41比JS-2012更能显著降低β-actin的表达(图2)。7 b)．同样，sc感染细胞中β-actin和GAPDH的mRNA表达水平明显低于JS-2012及其逆反病毒(图2)。7 c)．但与模拟处理组相比，JS-2012及其可逆病毒也能轻微降低宿主基因的表达(图2)。8)．由此可见，不同PRV株UL41蛋白体外vhs活性差异较大，其中JS-2012株的vhs活性明显弱于欧美株。此外，令人惊讶的是，无论是CHX降低UL41蛋白表达，还是PRV变异病毒基因组上的UL41缺失，都不能影响每种病毒感染早期宿主基因表达的下调(图2)。8)，表明JS-2012的UL41蛋白在病毒感染早期没有或非常弱的vhs活性，而其他病毒因子可能参与了宿主关闭。

综上所述，我们将CRISPR/Cas9技术与Gibson克隆方法相结合，生成了PRV UL41零病毒和UL41可逆病毒。Cas9/gRNA的Gibson组装和切口分别大大提高了构建供体质粒和同源重组的效率。与野生型(JS-2012)相比，生成的UL41空病毒在体外表现出更小的空斑和更低的滴度，以及在小鼠模型中受损的致死率。更重要的是，在PRV变异病毒基因组上缺失UL41不能影响病毒感染早期宿主基因表达的下调;此外，由于基因型特异性菌株UL41蛋白的残基差异，PRV变异型UL41蛋白的vhs活性明显弱于欧美样PRV SC，这表明PRV变异型UL41蛋白缺乏vhs活性。

CRISPR/Cas9结合Gibson组装高效生成UL41 null PRV。与野生型相比，UL41空型PRV的体外复制能力和体内致死率均有所下降。此外，PRV变异体UL41蛋白的vhs活性明显弱于欧美样PRV SC，提示PRV变异体UL41蛋白缺乏vhs活性。

BAC:

细菌人工染色体

CHX:

环己酰亚胺

CRISPR:

有规律地聚集在一起的短回文重复

dpi:

接种后天数

gRNA:

指导RNA

人力资源:

同源重组

1型单纯疱疹病毒:

单纯疱疹病毒1

HSV-2:

单纯疱疹病毒2

我:

感染多重性

减压阀:

假狂犬病病毒

存在:

定量实时逆转录pcr

TCID₅₀：

50%组织培养感染剂量

vhs:

病毒粒子宿主关闭

感谢Editage (https://www.editage.cn/)以编辑本手稿的英文文本。

资金

本研究得到国家重点研发计划项目(2016YFD0500100)、中国农业科研体系项目(NYCYTX-009)、上海市农业科技重点项目(2015,1 - 7,2016,4 - 2)的支持。

数据和材料的可用性

本研究中包含的数据集可根据要求从通讯作者处获得。

作者及隶属关系

1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海市闵行区紫月路518号，邮编200241

   叶超，陈静，王涛，徐晶晶，郑浩，吴继强，李国新，于志清，童武，程雪飞，周莎莎，佟广志

2. 江苏省重大动物传染病与人畜共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009

   郑浩，李国新，童武，佟广智

贡献

CY进行了最多的实验并起草了手稿。GT批判性地修改了手稿。JC、TW、JX、HZ、JW、GL、ZY、WT、XC、SZ参与实验。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Guangzhi通．

伦理批准并同意参与

本研究依据中国农业科学院上海兽医研究所《实验动物护理使用指南》进行。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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