鸭肠炎病毒UL41蛋白的分子特征gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

鸭肠炎病毒(DEV)属于甲疱疹病毒亚科，关于DEV UL41基因的信息有限。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

将DEV UL41基因克隆到pET32a(+)载体中，在原核表达系统中表达。对细菌表达的UL41-His融合蛋白进行抗血清培养，以作进一步实验。分别通过RT-qPCR和western blotting检测不同时间点dev -感染细胞中UL41蛋白的转录和表达水平。利用蔗糖梯度离心纯化DEV病毒粒子，并通过质谱分析鉴定蛋白含量。我们通过药理学试验确认了DEV UL41基因动力学类。采用IFA分析pUL41的胞内定位。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

构建了高表达76.0 kDa融合蛋白的重组表达质粒pET-32a(+)-UL41gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3)经0.2 mM IPTG在30°C诱导10 h后，生成特异性的小鼠抗ul41蛋白多克隆抗体。RT-qPCR和western blot分析显示，UL41转录数在36 hpi达到峰值，蛋白表达在48 hpi达到峰值。药理学试验表明UL41为γ2基因。质谱分析表明，pUL41是一种病毒粒子组分。IFA结果显示，pUL41分布在dev感染的细胞中，但仅分布在转染细胞的细胞质中。DEV pUL47将pUL41转位到DEF细胞核;这种易位依赖于预测的pUL47 NLS信号(40-50 aa和768-777 aa)。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

DEV UL41是一个编码病毒粒子结构蛋白的γ2基因，pUL41定位于整个DEV感染的细胞，但只定位于转染细胞的细胞质。pUL41不能自主定位到细胞核，因为这种核定位依赖于预测的DEV pUL47 NLS信号(40-50 aa和768-777 aa)。gydF4y2Ba

鸭鼠疫(或鸭病毒性肠炎)是由鸭肠炎病毒(DEV)引起的水禽(所有年龄和种类的鸭、鹅和天鹅)的一种急性、发热、脓毒性疾病，由于相关的高死亡率和鸭蛋产量下降，导致全球禽业遭受重大经济损失[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．DEV属于Alphaherpesvirinae亚家族，其基因组由线性双链DNA组成，包括一个独特的长(UL)区域、一个独特的短(US)区域、一个独特的短内部重复(IRS)区域和一个独特的短末端重复(TRS)区域。基因组排列模式为UL-IRS-US-TRS [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

UL41基因在阿尔法疱疹病毒中高度保守[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]， ul41编码的蛋白已在其他阿尔法疱疹病毒亚家族成员中被描述，包括牛疱疹病毒1 (BHV-1) [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，猴B病毒(机器疱疹病毒1;BV) [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，马疱疹病毒-1 (EHV-1) [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]、伪狂犬病毒[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]，以及水痘带状疱疹病毒[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．HSV-1病毒粒子宿主关闭蛋白(VHS)是一种晚期(γ2)被膜蛋白，由UL41基因编码并被包装到病毒粒子中;病毒感染所必需的[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]， VHS被释放到宿主细胞细胞质中，通过其RNase活性选择性地降解细胞mrna，并有助于在感染早期关闭宿主细胞蛋白质合成[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．此外，VHS-RNase活性受到几种HSV蛋白的紧密调控。在感染早期，VHS-RNase首先结合UL47和UL54基因编码的被膜蛋白VP13/14和ICP27, VHS-RNase对mrna的选择性降解受VP13/14的调控。然后，在感染后期，VHS-RNase活性被分别由UL48和UL49基因编码的VP16和VP22中和[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．VHS在BHV-1中的功能[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]， bv [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]和EHV-1 [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]可能在这些病毒的机制中起到同样的作用。PRV VHS蛋白也表现出RNase活性，但与HSV-1 VHS蛋白不相同[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．VZV开放阅读框17 (ORF17)是一种延迟细胞RNA关闭的晚期非结构蛋白，是VHS蛋白的同源物，但在VZV介导的延迟宿主关闭中没有主要功能[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

一些DEV基因的特征已被报道[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba];然而，关于DEV UL41基因的信息有限。生物信息学分析表明，DEV UL41 ORF全长1494 bp，编码497个氨基酸，分子质量56 kDa，与HSV-1 VHS蛋白同源性31%。在这项研究中，我们利用western blot、实时定量反转录PCR (RT-qPCR)、间接免疫荧光分析(IFAs)、药物测试和质谱分析对DEV ul41编码蛋白(pUL41)进行了鉴定。我们的研究结果将为进一步研究DEV UL41提供指导。gydF4y2Ba

病毒细胞和载体gydF4y2Ba

DEV CHV菌株(基因库:JQ647509.1)在实验室分离并保存[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

鸭胚成纤维细胞(DEF)在最低必需培养基(MEM;Gibco, Meridian Road Rockford，美国)补充10% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)胎牛血清(FBS;Gibco，子午路罗克福德，美国)37°C, 5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．对于病毒感染，添加添加2%胎牛血清的维持培养基。实验室制备了常用试剂。gydF4y2Ba

重组β-actin质粒[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]和兔抗ul47蛋白多克隆抗体。gydF4y2Ba

重组表达载体的构建gydF4y2Ba

所有引物均采用Primer Premier 5软件设计(见表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．野生型DEV UL41 (GenBank: AFC61841.1)编码区使用特异性引物(PgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)构建pET-32a(+)-UL41，并在真核质粒pEGFP-C2中使用特异性引物(PgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)创建pEGFP-C2-UL41。野生型DEV UL47 (GenBank:gydF4y2BaAFC61835.1gydF4y2Ba利用特异性引物(PgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba)，创建pcDNA3.1(+)-UL47。接下来，我们构建了真核质粒pcDNA3.1(+)-UL47gydF4y2Ba_{Δ40 - 50gydF4y2Ba}和pcDNA3.1 (+) -UL47gydF4y2Ba_{Δ768 - 777,gydF4y2Ba}它们分别缺失了DEV ul47编码蛋白(pUL47)的40 - 50个氨基酸和768 - 777个氨基酸(aa)。gydF4y2Ba

UL41-his融合蛋白的原核表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba

pET-32a(+)-UL41转化为gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3)活性细胞。细菌培养于含有50μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani (LB)培养基中，37℃。通过添加IPTG诱导蛋白表达(St Louis, MO, USA)。研究了不同诱导浓度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mM)、诱导时间(2、4、6、8和10 h)和诱导温度(25、30和37℃)，以优化条件获得最高水平的UL41蛋白表达[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．IPTG诱导后，在4℃下离心收集不同时间点的细菌，并用超声波中断。同时对病媒控制培养进行了分析。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以12%的溶解凝胶和5%的堆积凝胶分析所有表达水平。gydF4y2Ba

融合蛋白的纯化及多克隆抗体的制备gydF4y2Ba

通过凝胶和电洗脱纯化UL41蛋白，并用纯化后的蛋白在小鼠体内生成多克隆抗体。将约1.1 mg纯化蛋白与等量的QuickAntibody-Mouse3W佐剂(Biodragon, Beijing, China)混合，通过肌内注射免疫11只小鼠。最后一次免疫后1周，取眼球放血，离心(9600×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 20分钟，4℃)。gydF4y2Ba

西方墨点法gydF4y2Ba

如前所述[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，在感染后7、24、36、48、60、72 h (hpi)在6孔培养皿中收集dev感染的DEF细胞，去除上清液。通过12% SDS-PAGE分解的蛋白质进一步转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。膜在5%脱脂牛奶中阻塞2小时，然后用一抗孵育，用酶标二抗(Bio-rad Lab, CA, USA)在37℃下检测1小时。所有抗体用1%的脱脂牛奶稀释。在用PBST清洗几次以去除未结合的抗体后，根据制造商的说明使用Western BLoT化学发光HRP底物(Takara，大连，中国)检测信号。gydF4y2Ba

间接免疫荧光法(IFA)gydF4y2Ba

如前所述[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]， 6孔培养皿中dev感染的DEF细胞在0、7、12、24、36、48、60、72 hpi时收集在盖板上，4%多聚甲醛PBS固定30 min, 0.25% Triton X-100 PBS在4℃渗透30 min, 5% BSA PBS在37℃封闭1 h。此外，细胞先用一抗孵育1小时，再用二抗体孵育1小时(赛默飞世尔科学公司，Meridian Road Rockford, USA)。所有抗体用1% BSA PBS稀释。最后，用DAPI (Roche, Mannheim, Germany)在室温下观察细胞核15分钟。盖片用甘油缓冲液密封在载玻片上，用共聚焦显微镜检查细胞(尼康A1，日本)。gydF4y2Ba

RT-qPCRgydF4y2Ba

根据制造商的建议，使用TRIzol试剂l (Invitrogen, CA, USA)从dev感染的DEF细胞在不同时间点(0、2、6、12、24、36、42、45、48和54 hpi)中提取总RNA。分别用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop分光光度计测量光密度(OD260/OD280比值)来评价提取的RNA的完整性和纯度。随后，使用PrimeScript®RT试剂盒和gDNAeraser (Takara, Beijing, China)将RNA反转录为cDNA。UL41 (PgydF4y2Ba_7gydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_8gydF4y2Ba)和β-肌动蛋白(PgydF4y2Ba_9gydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_10gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba使用之前描述的引物检测基因(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．RT-qPCR条件设置如下:95°C初始变性1 min, 95°C变性5 s, 59°C退火20 s, 72°C延伸25 s。所有的反应都在三个重复和至少两个独立的实验中进行。测定阈值时的循环数(Ct值)，分析UL41和β-actin基因的转录，并使用2gydF4y2Ba^{——ΔΔCTgydF4y2Ba}方法(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

药物鉴定病毒粒子基因类型gydF4y2Ba

dev感染的DEF细胞在6孔培养皿中分别用300 μg/ml的阿昔洛韦(Glaxo SmithKline)或50 μg/ml的环己亚胺(Meilunbio, Dalian, China)孵育2 h。用TRIzol在24 hpi下提取总RNA，随后反转录为cDNA。采用引物对UL41进行PCR检测gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)和β-肌动蛋白(PgydF4y2Ba_9gydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_10gydF4y2Ba)，用1%琼脂糖凝胶确认。直接早期(IE)基因UL54 (PgydF4y2Ba_11gydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_12gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，早期(E)基因UL13 (PgydF4y2Ba_13gydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_14gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba36gydF4y2Ba晚期(L)基因Us2 (PgydF4y2Ba_15gydF4y2Ba和PgydF4y2Ba_16gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]作为实验对照。gydF4y2Ba

病毒粒子净化gydF4y2Ba

收集dev感染的DEF细胞，采用低速离心(2000×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 30分钟，4℃)。细胞外DEV病毒粒子经超离心(40000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 2小时，4°C)在贝克曼Ti70转子通过30% (wt/vol)蔗糖垫。用酒石酸钾连续梯度30 ~ 60% (wt/vol)等速梯度超离心收集TBS (40000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 2 h, 4°C)，在贝克曼SW60转子中，TBS稀释10倍，然后通过超离心(20,000×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 60分钟，4℃)。最后将颗粒在TBS中重悬，并在−80°C保存。gydF4y2Ba

质谱分析gydF4y2Ba

纯化的病毒粒样品采用12% SDS-PAGE分析。凝胶经考马斯亮蓝(Sigma)染色后送往中国上海生工生物技术公司进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．所有数据也在NCBI中进行了搜索gydF4y2Ba牛gydF4y2Ba数据库。只有吉祥物得分大于30的序列才被考虑。被至少一种独特肽识别的蛋白质被接受。并使用指数修正蛋白质丰度指数(emPAI)来估计完整病毒粒子提取物的蛋白质相对丰度[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

重组表达载体的构建gydF4y2Ba

采用特异性引物和DEV CHV株序列进行PCR反应。将UL41全长克隆到pMD19-T载体中，再亚克隆到pET-32a(+)表达载体和真核质粒pEGFP-C2中，分别称为pET-32a(+)-UL41和pEGFP-C2-UL41。简而言之，通过融合PCR获得了2个突变体ul47，突变位点为40-50 aa“RRSGKRRTLDR”(Δ40-50)和768-777 aa“KALKRRLTGG”(Δ768-777)。将野生型UL47和两个突变体亚克隆到pcDNA3.1(+)载体中，生成质粒，命名为pcDNA3.1(+)-UL47, pcDNA3.1(+)-UL47gydF4y2Ba_{Δ40 - 50gydF4y2Ba}和pcDNA3.1 (+) -UL47gydF4y2Ba_{Δ768 - 777gydF4y2Ba},分别。gydF4y2Ba

小鼠抗ul41蛋白多克隆抗体的制备gydF4y2Ba

将表达DEV UL41的重组pET-32a(+)-UL41质粒与6-组氨酸标签融合转化为gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3)。SDS-PAGE结果仅在不溶部分检测到明显的条带(约76 kDa)，而在病媒对照培养中未检测到(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．用0.2 mM IPTG诱导最佳蛋白表达水平(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)在30°C(图;gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba) 10 h(图;gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

接下来，用凝胶和电洗脱纯化融合蛋白(图2)。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)， western blotting法检测兔抗dev抗体(图;gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．纯化的蛋白被用于生成小鼠抗UL41蛋白多克隆抗体，该抗体与dev感染细胞中的UL41蛋白发生强烈反应，显示出一个迁移率约为56 kDa的条带(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

DEV UL41基因的转录动力学gydF4y2Ba

利用SYBR Green i对DEV UL41基因的转录动力学进行了RT-qPCR鉴定，熔融曲线显示引物的特异性很好(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．建立UL41和β-actin基因的标准曲线，以评估分析的效率(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．随后，在不同时间采集dev感染细胞的总RNA，逆转录为cDNA，进行RT-qPCR;结果是用2gydF4y2Ba^{——ΔΔCTgydF4y2Ba}方法。如图所示。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba，在6 hpi检测到UL41基因转录物，转录物水平逐渐升高，在36 hpi达到峰值，之后逐渐下降。gydF4y2Ba

DEV UL41基因表达水平gydF4y2Ba

对感染后不同时间点收集的细胞裂解物进行Western blot分析，用小鼠抗ul41蛋白多克隆抗体检测细胞膜(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．条带密度逐渐增大，在48 hpi处出现峰值表达，此后呈稳定下降趋势。由于β-肌动蛋白周转率低，以β-肌动蛋白抗体作为负荷对照进行评价，β-肌动蛋白水平保持相对恒定。用ImageJ软件分析条带密度。gydF4y2Ba

DEV UL41是一个晚期基因gydF4y2Ba

我们用阿昔洛韦(ACV)或环己亚胺(CHX)治疗感染细胞。IE基因UL54, E基因UL13, L基因Us2的正确条带如图所示。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．β-肌动蛋白带(图;gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)分别在对照组(未处理的感染细胞)、阴性组(未处理的DEF细胞)、ACV组和CHX组中检测到。对照组有UL41带，阴性组、ACV组、CHX组无UL41带。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．结果表明，DEV UL41为L型基因。gydF4y2Ba

UL41蛋白是一种病毒粒子成分gydF4y2Ba

我们用质谱法鉴定了细胞外病毒粒子蛋白含量。结果表明，UL41蛋白存在于成熟的细胞外病毒粒子中。检测到两种独特的DEV UL41肽，而三种独特的肽与DEV gC匹配(gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba)．根据指数修饰蛋白丰度指数(emPAI)， UL41的相对丰度较低(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

DEV UL41蛋白主要定位于新感染细胞的细胞质中gydF4y2Ba

利用IFA检测DEV UL41蛋白(pUL41)在细胞内的定位。总的来说，我们发现UL41蛋白特异性荧光(绿色)分布在整个细胞中，主要在细胞质中明显。此外，ul41特异性荧光在7至36 hpi之间的细胞中很明显，随后在48至72 hpi之间分散在整个细胞中，然后随着时间的推移逐渐增强。在模拟感染细胞中未观察到荧光(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在缺乏其他病毒蛋白的情况下，DEV UL47蛋白可将pUL41转位到细胞核中gydF4y2Ba

真核质粒pEGFP-C2-UL41表达了83 kDa的融合蛋白EGFP-UL41。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)，仅定位于细胞质(绿色)，并通过小鼠抗ul41蛋白多克隆抗体(红色)进一步检测。pEGFP-C2质粒控制分布在整个细胞(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

根据我们之前的研究，pUL41分布在整个感染细胞中，因此我们假设另一种DEV蛋白可能影响这种定位。据报道，另一种HSV被膜蛋白pUL47可与VHS相互作用，使VHS的核定位成为可能[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．为了确定DEV pUL47是否会将pUL41转运到细胞核中，我们构建了真核质粒pcDNA3.1-UL47，该质粒表达89 kDa pUL47(图2)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．将真核质粒pcDNA3.1-UL47和pegfp - 2c - ul41共转染DEF细胞，经兔抗ul47蛋白多克隆抗体(1:1000)检测，pUL47主要定位于DEF细胞的细胞核(红色)。EGFP-UL41融合蛋白也主要存在于细胞核中(绿色)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．因此，我们认为pUL47可以将pUL41移位到细胞核。gydF4y2Ba

根据预测软件gydF4y2Bahttps://www.predictprotein.orggydF4y2Ba/， DEV pUL47有两个明显的核定位信号(nss)，分别为40 ~ 50 aa和768 ~ 777 aa。为了确定这两个pUL47序列是否将pUL41转移到细胞核中，我们构建了质粒pcDNA3.1-UL47gydF4y2Ba_{Δ40 - 50gydF4y2Ba}和pcDNA3.1-UL47gydF4y2Ba_{Δ768 - 777gydF4y2Ba}，分别删除pUL47的40-50 aa和768-777 aa(图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．IFA显示，大部分ΔpUL47定位于细胞质(绿色)(图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba）;因此，我们得出结论，40-50 aa和768-777 aa都影响pUL47核的定位。接下来，我们共转染pcDNA3.1-UL47gydF4y2Ba_{Δ40 - 50gydF4y2Ba}pEGFP-C2-UL41和pcDNA3.1-UL47gydF4y2Ba_{Δ768 - 777gydF4y2Ba}和pEGFP-C2-UL41。在两个共转染的细胞中，EGFP-UL41融合蛋白主要定位于细胞质(绿色)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

到目前为止，关于DEV UL41基因的信息还很有限。刘金雄及同事[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba作者以DEV基因组的UL41基因为插入位点，构建了一种重组病毒rDEV-ul41HA，作为鸭DEV和H5N1感染的二价减毒活疫苗。其他疱疹病毒基因组中的UL41被确定为病毒复制的非必需区域[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba];结果表明，UL41并不是一个理想的外源基因插入位点。作为研究DEV UL41蛋白性质和特征的第一步，我们进一步探索了DEV pUL41的功能，本文结果的主要特征如下。gydF4y2Ba

疱疹病毒周期的特点是两个不同的阶段:潜伏期和生产周期或裂解周期。在生产周期中，疱疹病毒表现出严格调控的基因表达时序级联，分为三个阶段:IE、E和L。IE基因首先表达，并编码在转录和转录后水平上刺激病毒E和L基因表达的核调节蛋白。第二，E基因参与病毒DNA复制机制。病毒DNA复制增强了编码病毒颗粒大部分结构成分的L基因的表达。L基因根据其明显的DNA复制要求被细分为泄露晚期(γ1)和严格晚期(γ2)两类。γ1基因的表达较早期基因延迟，而γ2基因则严格要求DNA裂解扩增的开始或完成[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．HSV-1 VHS蛋白是一种γ2被膜蛋白，有助于细胞信使rna (mRNAs)的降解和宿主蛋白质合成的整体减少[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．此外，VZV ORF17也表达为一种L蛋白，在病毒复制周期中关闭细胞RNA [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．传染性喉气管炎病毒(ILTV)的UL41基因被归类为E/L基因，因为它同时具有E和L特性[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了鉴定DEV UL41基因类型，我们分别采用RT-qPCR和western blot方法研究了其在感染后不同时间点的转录和表达动力学。根据以往的研究[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]，我们认为DEV pUL41的积累可能发生在感染后期。IE基因在蛋白质合成抑制剂CHX的存在下表达，而E和L基因的转录在CHX的存在下受到抑制[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．为了进一步研究这一点，我们用DNA聚合酶抑制剂ACV和蛋白质合成抑制剂CHX处理感染细胞，并观察到在ACV和CHX组中UL41基因都被抑制。因此，DEV UL41基因是γ2基因，严格依赖于DNA裂解扩增的开始或完成。质谱法是鉴定复杂样品蛋白质组成的有效手段，已被应用于各种疱疹病毒的分析[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．基于emPAI,DEV pUL41是一种低丰度的病毒粒子成分，这意味着DEV pUL41可能与HSV-1 VHS蛋白具有相同的特征，这对病毒感染至关重要。gydF4y2Ba

细胞内病毒蛋白定位与病毒蛋白功能相关，但细胞内DEV pUL41定位未见文献记载。我们利用小鼠抗ul41蛋白多克隆抗体IFA分析了DEV pUL41的细胞内定位。结果表明，DEV UL41蛋白特异性荧光分布于细胞各处，信号主要存在于细胞质中。根据以往的研究[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]， HSV-1 VHS蛋白被运送到新感染细胞的细胞质中，以降解细胞mrna。这一降解过程有助于关闭宿主蛋白质合成，重定向细胞机制从宿主到病毒基因表达，并破坏预先存在的多核糖体。这些过程构成了病毒阻断宿主对感染反应的主要早期机制。其他调查人员的研究[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]的研究表明，野生型HSV-1 VHS蛋白最初定位于细胞核，然后易位到细胞质。该蛋白可以在细胞核和细胞质之间穿梭，包含一个假定的核输出信号(NES)，但尚未发现明显的NLS。另一种晚期被膜HSV-1蛋白pUL47(或VP13/14)，与RNA结合并在细胞质和细胞核之间穿梭[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]，可调节一些病毒和与之相互作用的细胞蛋白的亚细胞定位，可能参与VHS向细胞核的转运[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．VHS-RNase和VP13/14必须在VHS-RNase/VP13/14转位到细胞质之前与核中新合成和处理的mRNA组装，然后VHS-RNase降解mRNA。在感染早期，VHS功能受VP13/14调节，VP13/14可减弱感染细胞中所有动力学类病毒mrna和稳定宿主mrna的降解，而对富含au的mrna的稳定性没有明显影响[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．序列预测结果显示，DEV UL41含有NES基序，不含NLS基序。基于这些报道，我们还发现DEV pUL41不能自主定位到细胞核，在缺乏其他病毒蛋白的情况下，DEV pUL47将pUL41易位到细胞核中;这些过程依赖于预测的pUL47 NLS信号。gydF4y2Ba

根据这些数据，我们得出结论，DEV UL41是一个γ2基因，编码一种类似于HSV-1 VHS的结构蛋白。DEV pUL41可能是病毒感染所必需的，它在被感染细胞的细胞质中起作用，并与pUL47相互作用以影响病毒和宿主基因，但需要进一步的研究来证实这一点。gydF4y2Ba

DEV UL41是一个编码结构蛋白的γ2基因。ul41编码的蛋白在整个DEV感染的细胞中定位，但pUL41不能自主定位到细胞核，因为这种核定位依赖于DEV pUL47预测的NLS信号(40-50 aa和768-777 aa)。gydF4y2Ba

无环鸟苷:gydF4y2Ba

无环鸟苷gydF4y2Ba

BHV-1:gydF4y2Ba

牛疱疹病毒1gydF4y2Ba

BV:gydF4y2Ba

猴B病毒(机器疱疹病毒1型)gydF4y2Ba

CHX:gydF4y2Ba

环己酰亚胺gydF4y2Ba

DAPI:gydF4y2Ba

4, 6-diamidino-2-phenylindolegydF4y2Ba

戴夫:gydF4y2Ba

鸭肠炎病毒gydF4y2Ba

EHV-1:gydF4y2Ba

马herpesvirus-1gydF4y2Ba

HSV:gydF4y2Ba

单纯疱疹病毒gydF4y2Ba

ifa:gydF4y2Ba

间接免疫荧光分析gydF4y2Ba

ILTV:gydF4y2Ba

传染性喉气管炎病毒gydF4y2Ba

新经济学院:gydF4y2Ba

核输出信号gydF4y2Ba

NLS:gydF4y2Ba

核定位信号gydF4y2Ba

减压阀:gydF4y2Ba

假狂犬病病毒gydF4y2Ba

PVDF:gydF4y2Ba

聚偏二氟乙烯gydF4y2Ba

rt - pcr:gydF4y2Ba

实时定量逆转录PCRgydF4y2Ba

sds - page:gydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳gydF4y2Ba

带状疱疹:gydF4y2Ba

水痘一带状疱疹病毒gydF4y2Ba

感谢AJE集团美国(gydF4y2Bawww.aje.cn/acgydF4y2Ba)，以编辑本手稿草稿的英文文本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究得到国家重点研发计划项目(2016YFD0500800)、中国农业科研体系项目(CARS-42-17)、四川省动物疫病与人类健康重点实验室专项资金(2016JPT0004)和四川省国际科技合作计划项目(批准号2017HH0026)资助。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究中分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 四川农业大学预防兽医研究所，温江611130gydF4y2Ba

   何天琼，王明树，曹雪莲，程安春，吴颖，杨乔，刘马峰，朱德康，贾仁勇，陈顺，孙昆峰，赵欣欣gydF4y2Ba

2. 四川农业大学动物医学院禽病研究中心，温江611130gydF4y2Ba

   何天琼，王明树，曹雪莲，程安春，吴颖，杨乔，刘马峰，朱德康，贾仁勇，陈顺，孙昆峰，赵欣欣，陈晓月gydF4y2Ba

3. 四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室，温江611130gydF4y2Ba

   何天琼，王明树，曹雪莲，程安春，吴颖，杨乔，刘马峰，朱德康，贾仁勇，陈顺，孙昆峰，赵欣欣gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

DZ和ML进行了大部分实验并起草了手稿。AC和MW对手稿和实验设计进行了严格的修改。YW, QY, ML, DZ, RJ, SC, KS, XZ, XC对实验有帮助。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaAnchun程gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

本研究获四川农业大学动物伦理委员会批准(2016-17)。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba