干扰素-γ-诱导蛋白16 (IFI16)是维持eb病毒潜伏期所必需的gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)具有溶性和潜伏性(Lat。I, II和III)阶段。所有EBV相关的癌症，包括伯基特淋巴瘤、鼻咽癌和淋巴增生性疾病，都是在EBV的潜伏期发生的。干扰素-γ-诱导蛋白16 (IFI16)是一种公认的先天免疫传感器和病毒转录调节因子，参与对入侵DNA病毒的反应。在潜伏期期间，IFI16留在细胞核中，部分与EBV基因组结合;然而，其在EBV溶解周期或潜伏期中的作用尚不明确。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

我们使用针对IFI16的短干扰RNA和IFI16过表达来鉴定IFI16在维持EBV潜伏期i中的作用。我们还使用EBV阳性、潜伏感染的Akata或mutu1细胞系研究了诱导裂解周期如何影响IFI16。用TPA诱导Akata细胞，用TGF-β诱导MUTU-1细胞至96 h，用Western blotting和免疫荧光显微镜分析IFI16蛋白的变化。为了评估IFI16减少的机制，使用病毒DNA聚合酶抑制剂膦乙酸阻断EBV DNA复制和晚期裂解转录本。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

siRNA敲低IFI16 mRNA导致所有暂时性基因类的EBV溶解基因表达水平增强，以及EBV总基因组丰度的增加，而外源性IFI16的过表达逆转了这些影响。此外，与ebv阴性细胞株BJAB相比，TPA (Akata)或TGF-β (mut -1)诱导裂解循环96 h后，IFI16蛋白水平下降高达80%。在表达EBV溶膜糖蛋白的细胞中观察到IFI16的减少。IFI16蛋白水平的降低似乎不依赖于EBV的晚期裂解转录本，但提示涉及直接早期，早期，或两种基因类的组合。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

溶解周期诱导后IFI16蛋白水平的降低，以及IFI16 mRNA敲低后潜伏期的重新激活表明IFI16对EBV潜伏期的维持至关重要。更重要的是，这些结果确定IFI16是参与EBV生命周期的独特宿主因子蛋白，使其成为对抗EBV相关恶性肿瘤的潜在治疗靶点。gydF4y2Ba

爱泼斯坦-巴尔病毒是一种嗜淋巴疱疹病毒，一旦被感染，就会在宿主体内形成终生感染。EBV与几种癌症有关，如伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤和移植后淋巴增生性疾病。这种致癌潜力归因于eb病毒，因为它在不同类型的肿瘤中普遍存在，也因为它有能力在体外感染和转化人类B细胞，从而形成永生化的淋巴母细胞系[gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．像所有疱疹病毒一样，eb病毒有裂解期和潜伏期;然而，EBV在其他疱疹病毒中是独特的，因为它有三种潜伏期(Lat。I, II和III)，每一个都由一个严格调控的基因子集定义[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．在初次感染期间，EBV在口腔上皮和/或局部粘膜相关淋巴组织中复制[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，在产生传染性病毒粒子的过程中表达了超过80种蛋白质[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．这被称为裂解阶段或生产阶段。随之而来的基因表达时间级联可细分为即早(IE)、早(E)、晚(L)和潜伏(Lt)。最初，IE基因产物被表达，并作为E基因表达所需的转化蛋白[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．这些E基因有助于病毒DNA复制，包括编码EBV基因组持久性所需的病毒结构蛋白和Lt.基因的转录和翻译[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．在EBV复制的顶峰，病毒颗粒被包装并释放。原发性感染上皮细胞后，EBV进入B细胞，潜伏期建立，EBV基因组在宿主细胞中维持为染色体外片段。在任何给定时间，大约百万分之一的B细胞被eb病毒潜伏感染，并能周期性地重新激活，使病毒得以传播和存活[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

迄今为止发现的所有ebv相关癌症都是由该病毒的潜伏感染引起的。在大多数情况下，eb病毒感染是无症状的;而免疫抑制的个体可能发展为ebv相关的淋巴样或上皮源性癌。在潜伏期内，EBV可逃避宿主免疫系统，调节细胞凋亡，促进B细胞发育和存活[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．尽管有证据表明宿主CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCTL反应使潜伏感染的B细胞处于控制之下，即使是健康的个体也会经历eb病毒的重新激活和脱落[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．直到今天，控制EBV的溶出物到潜伏物或潜伏物到溶出物开关的重要宿主因素还没有被很好地理解。gydF4y2Ba

干扰素-γ-诱导蛋白16 (IFI16)是一种多功能和普遍存在的宿主蛋白，最初发现在人淋巴样细胞中组成性表达[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．从那时起，IFI16被报道在抗病毒免疫中发挥关键作用。Kerur等首次发表IFI16在人真皮微血管内皮细胞原发性感染时作为核先天性DNA传感器检测核内KSHV基因组，导致炎症小体激活[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．这是第一份证明炎症小体激活可以发生在核内的报告，同时确定IFI16是关键的核病原体传感器。其他研究结果表明，IFI16构成性地感知KSHV和EBV的潜在基因组(潜伏期I, II和III)，以诱导炎性小体[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．具体来说，在dsDNA病毒检测后，IFI16与适配器蛋白ASC(含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白)和效应蛋白procaspase-1结合，激活IFI16/ASC/procaspase-1炎性小体[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．这种反应导致促炎细胞因子白细胞介素1β (IL-1)、IL-18和IL-33成熟并裂解到感染区域，最终帮助对抗感染。炎症小体活化发生在细胞质中，需要IFI16乙酰化并从受感染细胞的细胞核转移到细胞质[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

IFI16作为病毒限制因子也有重要作用。例如，Lo Cigno等人发现，通过转染腺病毒载体AdVIFI16, IFI16的过表达严重损害了NIKS和U2OS细胞中人乳头瘤病毒18的复制，同时降低了病毒转录[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．同一组的类似研究显示，sirna介导的敲除IFI16导致人巨细胞病毒(HCMV;a β-疱疹病毒)复制，在同一系统中过表达产生的病毒载量和HCMV DNA拷贝数降低[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．此外，据报道，在IFI16存在的情况下，HSV-1降低了病毒滴度/DNA复制和基因表达，部分原因是IFI16的染色质重塑能力[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

最近对KSHV生物学的研究扩大了我们对IFI16在抗病毒免疫中的作用的理解，因为它被证明对维持KSHV潜伏期至关重要。在潜伏kshv感染的b细胞淋巴瘤BC-3和BCBL-1细胞系中，用12- o -十四羧基-13-乙酸酯(TPA)诱导溶循环后，IFI16被靶向为蛋白酶体降解[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．这部分是由KSHV晚期裂解转录物介导的，IFI16的降解导致KSHV裂解蛋白水平的增加和整个病毒基因组丰度的增加[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．此外，Ansari等人通过荧光原位杂交发现IFI16在淋巴母细胞(潜伏期III)和Raji(潜伏期I)细胞核中与EBV基因组共定位[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．然而，尽管对溶解复制DNA病毒进行了广泛的研究，最近对潜伏KSHV感染的研究以及IFI16识别EBV基因组的观察，但缺乏对IFI16在EBV生物学中的作用的研究。gydF4y2Ba

IFI16是维持KSHV延迟所必需的[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba表明IFI16可能对EBV潜伏期也很重要。在这里，我们首次表明IFI16对于维持EBV阳性潜伏i感染的Akata和mutu1细胞系的潜伏期确实是必不可少的。在Akata细胞中通过sirna介导的转染敲低IFI16导致IFI16 mRNA和蛋白水平有效降低，EBV溶酶基因表达增加，EBV整体病毒载量增加。转化生长因子β (TGF-β;MUTU-1)和化学诱导剂TPA (Akata)有效地将IFI16蛋白水平降低了80%，与未诱导的对应物相比。IFI16蛋白的减少与可溶性EBV转录物水平的升高、基因组拷贝数的增加以及IFI16从细胞核到细胞质的重新分配有关。总的来说，这些研究证明了IFI16在潜伏到溶解转换过程中的重要作用，并为EBV如何与宿主相互作用提供了见解。gydF4y2Ba

细胞gydF4y2Ba

ebv阳性，潜伏i感染细胞系Akata和mutu1以及ebv阴性细胞系BJAB(所有BL细胞系)在RPMI 1640 GlutaMAX (ThermoFisher, Waltham, MA)中培养，补充10% (vol/vol)胎牛血清(FBS;Atlanta Biologicals, GA)和1%青霉素-链霉素(ThermoFisher, Waltham, MA)。本研究中使用的所有细胞类型均采用Lonza Myco-Alert试剂盒(LT37-618;Lonza, Walkersville, MD)，按照制造商的说明，在这些研究中只使用支原体阴性细胞。gydF4y2Ba

抗体和试剂gydF4y2Ba

Western blotting和免疫荧光研究中使用了以下抗体:抗ifi16(小鼠)和抗bzlf1;斑马(老鼠)(Santa Cruz Biotechnology, Inc.， Santa Cruz, CA);EBV Ea-D p52/p50和anti-IFI16(兔)(Millipore, Billerica, MA);小鼠单克隆克隆D.1.17。G38(相对于gp350/220)在实验室生成[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．与辣根过氧化物酶、Alexa Fluor-488和Alexa Fluor-594相关的二级抗兔igg和抗小鼠igg抗体来自马里兰州盖瑟斯堡的KPL公司或俄勒冈州尤金的Molecular Probes。12- o -十四羧基磷酯-13-乙酸酯(TPA)和磷乙酸(PAA)购自Millipore-Sigma (Billerica, MA)。TGF-β购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。gydF4y2Ba

EBV裂解循环的诱导gydF4y2Ba

EBV裂解循环诱导见表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．利用EBV核抗原-1 (EBNA1)特异性引物实时DNA PCR定量EBV基因组丰度，并将样本归一化，相对于β-微管蛋白水平。gydF4y2Ba

sirna介导的B细胞中IFI16的下调和过表达gydF4y2Ba

商用SMARTpool针对IFI16的siRNA购自Dharmacon (M-020004-01-0010)。Akata细胞通过电穿孔转染sifi16或打乱的siRNA进行敲低研究，或用IFI16-FLAG (Addgene;35,064)或空的pcDNA3-FLAG载体用于过表达研究，使用Neon转染系统(Life Technologies)，根据制造商的说明和前面所述的微小修改(26)。简单地说，收集细胞，清洗细胞，在重悬缓冲液R(提供)中以1.0 × 10的密度重悬gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/毫升。将100 μL细胞悬液与100 pmol siRNA或3 μg IFI16 DNA混合，用3次1500 V脉冲电穿孔10 ms。电穿孔后，将细胞替换到完全培养基中，在37°C和5% CO中孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的气氛。对于过表达研究，转染4小时后加入30 ng/mL TPA以减少对细胞的应激，并再培养44小时。对于siRNA研究，转染48小时后通过Western blot和qRT-PCR证实IFI16敲低。gydF4y2Ba

Western blot (WB)分析gydF4y2Ba

通过在放射免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液(50 mM Tris [pH 8.0]， 150 mM氯化钠，1.0% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS)中溶解，再加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma)，在冰上溶解30分钟，制备总细胞裂解物。然后将裂解物在冰上超声，并在4°C下以13000 x g离心10分钟，然后使用BCA蛋白质测定试剂试剂盒(Pierce, Rockford, IL)进行蛋白质估计。等量的蛋白质在7-12%的SDS-PAGE凝胶上分离，转移到硝化纤维膜上，并按指示用一抗检测。用于检测，种类特异性辣根过氧化物酶或荧光共轭(Alexa fluor 488-绿色或594-红色;二抗在室温下在膜上孵育1小时，使用SuperSignal West Pico化学发光衬底(Thermo Fisher)或使用AlphaImager系统(Alpha Innotech Corporation, San Leonardo, CA)进行扫描。gydF4y2Ba

免疫荧光显微镜(IFA)gydF4y2Ba

Akata、BJAB和mutu1细胞用冰冷的丙酮固定和渗透，清洗，并用Image-iT FX信号增强剂(Invitrogen)在室温下封闭20分钟。然后将细胞与指定的一抗在37℃下孵育1小时，清洗，并在37℃下用Alexa Fluor-488或Alexa Fluor-594 (Thermo Fisher)孵育30分钟。接下来，用SlowFade Gold抗褪色试剂和DAPI (Invitrogen)冲洗和孵育载玻片。使用Nikon Eclipse 80i荧光显微镜成像，并用Metamorph成像软件进行分析。gydF4y2Ba

RNA纯化，逆转录，实时PCRgydF4y2Ba

按照制造商的说明，使用RNeasy minikit (Qiagen, Valencia, CA)进行细胞总RNA分离。采用RNase-free DNase试剂盒(Qiagen)进行柱上dna酶消化。在使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)进行RNA估计后，根据制造商说明使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher)使用1 μg RNA进行反转录。在ABI Prism 7500检测系统上使用SYBR绿色化学(应用生物系统公司)，通过实时定量反转录PCR (qRT-PCR)检测基因表达。最终mRNA基因水平归一化至β微管蛋白水平，并计算为delta-delta阈值循环(ΔΔgydF4y2BaCgydF4y2Ba_TgydF4y2Ba)．本研究使用的引物列于表中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据以至少三个独立实验结果的均数±标准差(SD)表示(gydF4y2BangydF4y2Ba≥3)，用双尾Student 's计算有统计学意义gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。值被认为是重要的，如果gydF4y2BaPgydF4y2Ba值<0.05。使用ImageJ 1.50软件进行免疫印迹密度定量。gydF4y2Ba

Akata细胞中IFI16的敲低导致EBV溶循环基因表达的激活gydF4y2Ba

为了确定IFI16对EBV生物学的影响，我们使用siRNA (siIFI16)下调了潜伏感染的Akata B细胞中IFI16的基因表达。siIFI16或其对照(siC;siccontrol)电穿孔，孵育48小时，然后分析蛋白质，DNA和RNA。转染后48小时，蛋白水平降低了约82%，IFI16 mRNA降低了80%(图2)。gydF4y2Ba1a和bgydF4y2Ba)．有趣的是，在我们观察到IFI16蛋白和mRNA水平降低的同时，通过实时DNA PCR观察到EBV DNA总水平增加(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)，表明IFI16的缺失导致EBV的裂解循环激活。gydF4y2Ba

在EBV裂解周期诱导过程中，基因的表达是暂时性的。siIFI16转染48 h后，立即早期(IE)、早期(E)、晚期(L)和潜伏(Lt) 4种时间类型均被诱导。具体来说，IE基因和转录激活因子BZLF1比siccontrol基因增加了约5.5倍(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba，蓝色条)。作为ssdna结合蛋白的E基因BALF2和编码包膜糖蛋白的L基因BZLF2也分别增加了4.5倍和3倍(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba，红色和灰色条)。IFI16的敲除也导致了Lt基因EBV核抗原-1 (EBNA1;无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba(紫色条)，该基因在细胞分裂过程中对将EBV DNA与宿主细胞的姐妹染色单体系在一起至关重要，也是所有形式潜伏期中唯一存在的病毒转录本。总的来说，这些结果表明sirna介导的敲除IFI16诱导了潜在EBV基因组的裂解再激活，通过检测裂解基因表达水平的增加和EBV基因组的总丰度来衡量。gydF4y2Ba

IFI16的过表达限制了裂解循环的诱导gydF4y2Ba

为了进一步验证IFI16参与EBV潜伏期的维持，我们在Akata细胞中过表达IFI16，然后使用phorbol酯TPA进行裂解循环诱导。TPA通过NF-κB和AP-1转录因子家族激活EBV溶解循环，这些转录因子家族响应蛋白激酶C和丝裂原激活蛋白激酶途径而被激活[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．通过实时DNA PCR检测，与单独用TPA处理并表达内源性IFI16的Akata细胞相比，IFI16过表达处理的EBV丰度减少了约3倍(图2)。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．此外，过表达IFI16的Akata细胞与单独转染IFI16的细胞相比，用TPA培养导致EBV复制甚至更少。这可能是过多的IFI16在病毒基因组上积累并阻止转录启动的直接结果，正如IFI16在HSV-1中所报道的那样[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．当我们观察EBV暂时性基因表达时，在TPA诱导的Akata细胞中观察到5.5 - 30倍的增加(图2)。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba；条纹酒吧)。相反，当IFI16过表达并被TPA诱导时，这种效应被逆转(图2)。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba；斑点条)，导致所有时间类基因的诱导不足5倍，这表明IFI16确实负调控EBV裂解复制和基因表达。有趣的是，IFI16 mRNA的总表达量与EBV基因组的总表达量和基因表达量呈负相关，最高水平的IFI16 mRNA的EBV基因组和病毒转录物的表达量最低(图2)。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba与无花果。gydF4y2Ba1e和ggydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

tpa介导的EBV溶解周期从潜伏期激活导致IFI16蛋白水平降低gydF4y2Ba

我们观察到ifi16kd导致了裂解周期的激活，而IFI16过表达则消除了这一效应，这表明IFI16对裂解周期的诱导具有抑制作用。为了进一步研究这一点，我们使用TPA处理96小时化学诱导裂解循环，并评估其对IFI16表达的影响。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在Akata细胞诱导96 h后(第5通道)，TPA处理导致IFI16蛋白减少约70%。Ea-D p52/50 (EBV)是BMRF1的早期抗原蛋白和基因产物，在TPA处理下检测到约72 hpi，验证了裂解循环的激活(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba为了确认裂解循环的激活，进行了实时DNA PCR，与非诱导对照相比，在96 h内，其稳定增加(图4)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．尽管在诱导96 h后IFI16蛋白水平显著下降，但IFI16 mRNA却出现了稳定的增加(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)，这可能是由于IFI16在对EBV生产性感染产生的活性氧作出反应时被激活的结果[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．正如预期的那样，在EBV阴性细胞株BJAB中未检测到IFI16的裂解周期诱导或下降(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba无论TPA暴露与否，或在没有TPA的Akata细胞中(图1-10)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba6-10号)。gydF4y2Ba

除了DNA复制，我们还通过实时qRT-PCR分析了不同EBV基因的表达(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．据报道，BZLF1 (ZEBRA)的IE基因产物早在4 hpi时就被WB检测到，本研究在24 hpi时通过qRT-PCR检测到(图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba，蓝条)[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．编码ssDNA结合蛋白的基因BALF2，在48 hpi诱导下，晚期基因BcRF1上调48 hpi，并在96 h达到峰值(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba，红色和灰色条)。此外，在Lt基因EBNA1中也观察到类似的趋势(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba紫色条)。随着溶解周期的激活，潜伏期III基因在EBV晚期复制的B淋巴母细胞和上皮细胞中均有报道，证实了本文观察到的结果[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

先前的研究报道，IFI16在所有ebv阳性潜伏感染细胞中易位到细胞质，这是IFI16基因组识别的结果[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．为了确定在溶解循环激活后Akata细胞中是否也存在IFI16丰度的重新分配和/或变化，我们进行了免疫荧光分析(IFA)。用TPA处理Akata或BJAB细胞96小时，并对IFI16和EBV包膜糖蛋白gp350/220进行染色，该糖蛋白被用作裂解活性的标记物。如图所示。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba，诱导的Akata细胞在细胞质和细胞核中均表达EBV gp350/220，尽管主要表达在核周。有趣的是，在表达EBV gp350/220的同一细胞中，观察到IFI16水平的降低，这证实了图中所示的Western blot结果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．类似于在未诱导的Akata细胞中观察到的IFI16(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba(上图)BJAB在整个细胞核中大量表达IFI16，与TPA暴露无关(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba，顶部和底部面板)。这些结果证实，经历EBV裂解再激活的细胞显示IFI16水平降低。gydF4y2Ba

利用TGF-β诱导I潜伏期感染的mutual -1细胞导致IFI16蛋白的降低gydF4y2Ba

根据所研究的细胞，EBV的溶解循环可以被各种刺激有意诱导，包括抗免疫球蛋白交联，化学剂如丁酸钠和TPA, CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}即TGF-β。此外，一些化学诱导剂如丁酸钠和TPA可诱导细胞死亡[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．因此，我们利用另一BL细胞系mut -1 (Lat。I)用TGF-β诱导，不仅可以证实在Akata细胞中观察到的结果，而且还可以最大限度地减少可能发生在细胞上的任何应激性死亡。在这些研究中，utu -1细胞与TGF-β孵育96 h，以观察裂解诱导对IFI16表达的影响。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， IFI16蛋白减少了50%，减少了72 hpi, 96 hpi继续减少了80%。通过ZEBRA (BZLF1蛋白产物)的存在，以及通过实时DNA PCR测量的EBV基因组DNA的总丰度，都证实了裂解周期的激活(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba中间面板& 4C)。gydF4y2Ba

为了评估TGF-β对EBV裂解基因表达的影响，实时RT-PCR使用从未处理或TGF-β刺激后不同时间点的mutual -1细胞中收集的RNA。IE BZLF1在96 h内稳定增加，96 h达到5.5倍的峰值，E基因BALF2也随着TGF-β的增加而增加，在72 hpi达到峰值，96 h开始下降(图2)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba蓝色和红色条)。与BZLF1相似，晚期和潜伏基因BcRF1和EBNA1分别以5倍和14倍的增长达到96 hpi的峰值。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba，灰色和紫色条)。gydF4y2Ba

为了评估EBV的溶解再激活是否会导致mutual -1细胞中IFI16的变化，我们还进行了IFA。收获含有TGF-β、mut -1和BJAB细胞96 hpi，并在表达gp350/220的细胞中分析IFI16。如图所示。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba，经TGF-β处理的utu -1细胞gp350/220强烈染色，证实裂解循环激活。在gp350/220染色的同一细胞中，我们没有观察到IFI16(图3)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)，这与WB观察到TGF-β处理后IFI16蛋白减少80%相吻合(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在我们未诱导的mut -1细胞或独立于TGF-β暴露的BJAB细胞中，未观察到IFI16的减少或重定位(图5)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba上面板;无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，顶部和底部面板)。这些结果提供了额外的证据，证明在IFI16水平中观察到的变化是特定于经历EBV裂解激活的细胞的。gydF4y2Ba

为了深入了解IFI16蛋白如何减少的机制，我们用EBV晚期裂解转录抑制剂PAA处理Akata和mutual -1细胞系。PAA是一种无毒的病毒DNA聚合酶抑制剂，可特异性地阻止eb病毒基因组的成功复制，不影响IE或E基因的合成[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．如图WB所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在Akata细胞中，单独存在TPA时IFI16水平降低了40%，同时存在PAA和TPA时IFI16水平降低了50%。通过实时DNA PCR分析EBV的相对基因组丰度，以验证PAA的有效性，并确保EBV在tpa处理的样本中复制(图2)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．同时，TGF-β单独或TGF-β联合PAA处理utu -1细胞(图。gydF4y2Ba6c & dgydF4y2Ba)．与Akata细胞相比，MUTU-1的PAA处理无法将IFI16蛋白水平恢复到其未诱导对应物的水平(图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)，这不是EBV复制的结果，因为单独PAA处理没有观察到EBV基因组丰度的增加(图。gydF4y2Ba6c & dgydF4y2Ba)．此外，单独PAA存在的mutual -1细胞导致IFI16蛋白水平的额外降低，特别是与单独PAA处理的Akata细胞相比(图2)。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba这可能是由于Akata和mut -1细胞系之间的细微差异，或PAA对IE和E基因具有非特异性抑制，甚至可能是由于这些实验中使用的PAA浓度高于Akata实验中使用的浓度(300 μg/mL vs. 100 μg/mL)导致mut -1细胞中的细胞聚合酶。此外，Inman等人报道，发生溶出复制的EBV阳性细胞免受凋亡介导的细胞死亡的影响，而PAA处理阻断了这种保护，这表明这些研究中观察到的IFI16下降是PAA存在下溶出细胞发生凋亡的结果[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．总的来说，用PAA治疗没有导致IFI16蛋白水平的升高。这表明减少是由于EBV IE或E基因产物(蛋白质，miRNA或lincRNA)直接或间接的;然而，哪些EBV基因产物介导IFI16还需要进一步研究，超出了当前稿件的范围。gydF4y2Ba

对抗外来入侵病原体的抗病毒免疫对于确保受感染宿主的生存至关重要。然而，一些病毒，如疱疹病毒，永远不会被清除，而是在受感染个体的整个生命中在溶解和潜伏状态之间交替。在裂解感染期间，产生子代病毒，并被免疫系统识别，导致无数的细胞反应对抗病毒。gydF4y2Ba

为了克服宿主检测，EBV进化出了一套复杂的EBV特有的潜伏期。正是在这些潜伏期期间，ebv相关的恶性肿瘤如BL、鼻咽癌和淋巴增生性疾病(以及其他疾病)出现。不幸的是，治疗这类疾病的唯一方法包括化疗和免疫疗法，即使有效，也会产生严重的毒副作用，使患者永久畸形[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．因此，识别参与EBV感染的宿主蛋白对于开发对抗病毒诱导疾病的新策略至关重要。gydF4y2Ba

除了在dsDNA感染期间作为炎症小体的组成部分外，据报道IFI16在HSV-1、HCMV、HPV和KSHV感染期间具有不同的基因调节和染色质重塑功能[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．IFI16在与HSV-1中所有暂时性基因类的启动子结合的能力中扮演负调控因子的角色，同时抑制转录因子的结合，如Oct1、TBP和RNA Pol II [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．此外，IFI16在HPV中限制病毒DNA复制的部分原因是其表观遗传修饰病毒启动子的能力[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．Gariano等人研究表明，IFI16在人胚胎肺成纤维细胞中的过表达导致病毒产量和总DNA丰度降低，这是由于IFI16能够与HCMV启动子UL54结合，最终阻断sp -1样结合位点，并阻止早期和晚期病毒基因表达[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．此外，使用siRNA沉默IFI16逆转了这些影响，增强了病毒复制，这与我们在EBV实验中观察到的结果相似[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在本研究中，sirna介导的Akata细胞中IFI16的KD导致EBV的溶性再激活，通过病毒基因组和所有暂时性基因表达的增加来测量(图2)。gydF4y2Ba1c & dgydF4y2Ba)．相反，过表达IFI16逆转了这些影响，导致EBV复制和基因表达与单独使用TPA处理的样本相比下降(图。gydF4y2Ba1f & ggydF4y2Ba)．这些结果表明，IFI16参与了溶解周期抑制，因此，可能直接导致疾病进展，因为所有ebv相关恶性肿瘤都发生在潜伏期。gydF4y2Ba

在TPA诱导的Akata细胞和TGF-β诱导的mutual -1细胞中都观察到裂解基因的激活，Akata细胞显示出统计学上更高的诱导水平(图2)。gydF4y2Ba2c和dgydF4y2Ba与无花果。gydF4y2Ba4c和dgydF4y2Ba)．在我们的IFA研究中观察到的病毒基因组丰度、裂解基因表达和IFI16定位的差异(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)可能是由于i)细胞系的起源(日本BL vs.肯尼亚BL)， ii)诱导剂的有效性(TPA vs. TGF-β)， iii)细胞随时间对各自诱导剂的反应能力(大量传代后细胞可能失去反应的敏感性)，或iv)细胞中病毒的自发损失[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

迄今为止，IFI16降解仅报道发生在HSV-1新生感染中[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]和kshv感染细胞的裂解活化[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．最近有报道称，在KSHV潜伏感染的B淋巴瘤细胞系BCBL-1和BC3中，IFI16通过蛋白酶体介导的途径多泛素化和降解[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．这种降解至少部分是通过晚期裂解转录物发生的，PAA处理使IFI16蛋白水平恢复到非诱导对照的水平[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．对我们的EBV模型使用类似的方法，我们没有观察到IFI16蛋白的任何显著增加，尽管用MG132阻断蛋白降解(数据未包括在内)或用PAA阻断EBV晚期裂解转录本的转录(图2)。gydF4y2Ba6模拟gydF4y2Ba)．相反，我们的结果表明IFI16蛋白的变化可能是由于IE或E基因，或者可能是两者的结合。此外，在TPA诱导后0 ~ 96 h, IFI16 mRNA丰度稳定增加(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)尽管观察到蛋白质水平下降，但这表明这种减少是通过翻译后事件发生的。尽管如此，很明显，KSHV和EBV在应对外来入侵病原体时使用了不同的机制。gydF4y2Ba

在这些研究中，我们发现IFI16蛋白水平在EBV溶解循环的再激活过程中降低。EBV与90%的地方性BL病例(淋巴增生性疾病)有关，并与胃癌有关，胃癌是世界上第五大癌症发病原因[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．IFI16先前已被证明是建立KSHV潜伏期所必需的，并作为HSV-1病毒基因表达的负调控因子。我们的研究首次表明IFI16是EBV潜伏期维持的必要条件，并提示IFI16在翻译后被靶向降解，其机制目前尚不清楚。gydF4y2Ba

本文的研究结果为EBV利用IFI16维持其潜伏状态提供了证据。我们发现，IFI16蛋白水平在溶解周期重新激活后下降，这意味着IFI16在维持潜伏期和作为溶解周期诱导的负调节因子方面发挥了重要作用。重要的是，IFI16在EBV潜伏期调节中的鉴定将为治疗EBV相关恶性肿瘤和控制它们的细胞诱导免疫控制机制提供未来的见解。gydF4y2Ba

ASC:gydF4y2Ba

含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白gydF4y2Ba

提单:gydF4y2Ba

伯基特淋巴瘤gydF4y2Ba

艾凡:gydF4y2Ba

早期gydF4y2Ba

EBNA1:gydF4y2Ba

EBV核抗原1gydF4y2Ba

EBV:gydF4y2Ba

巴尔病毒gydF4y2Ba

:血巨细胞病毒gydF4y2Ba

人类巨细胞病毒gydF4y2Ba

现病史:gydF4y2Ba

H柱诱导gydF4y2Ba

人乳头状瘤病毒:gydF4y2Ba

人乳头状瘤病毒gydF4y2Ba

即:gydF4y2Ba

即早期gydF4y2Ba

IFA:gydF4y2Ba

免疫荧光分析gydF4y2Ba

IFI16:gydF4y2Ba

干扰素-γ诱导16gydF4y2Ba

KSHV:gydF4y2Ba

卡波西肉瘤相关疱疹病毒gydF4y2Ba

李:gydF4y2Ba

晚些时候gydF4y2Ba

纬度:gydF4y2Ba

延迟gydF4y2Ba

Lt:gydF4y2Ba

潜在的gydF4y2Ba

PAA:gydF4y2Ba

Phosphonoaceitic酸gydF4y2Ba

siC:gydF4y2Ba

如果控制gydF4y2Ba

核:gydF4y2Ba

短干扰素RNAgydF4y2Ba

TGF -β:gydF4y2Ba

转化生长因子-βgydF4y2Ba

TPA:gydF4y2Ba

12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetategydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究得到了rfms - h.m.的支持。布莱癌症研究基金6100-2289-1,111,103。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或本手稿的准备中没有任何作用。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

GP、BK、AR、MAA和LC参与了实验和分析。GP起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 美国伊利诺伊州北芝加哥罗莎琳富兰克林医学与科学大学芝加哥医学院微生物与免疫学系H.M. Bligh癌症研究实验室gydF4y2Ba

   Gina Pisano, Arunava Roy, Mairaj Ahmed Ansari, Binod Kumar, Leela Chikoti和Bala ChandrangydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba吉娜·皮萨诺gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

我们已获得所有参与者的书面同意，以发表他们的数据。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

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开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

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