用于马疫苗接种的佐剂清单:过去、现在和未来

接种疫苗是保护马免受病原体侵害的最广泛使用的策略之一。然而，现有的马疫苗往往有局限性，因为它们并不总是提供有效的长期保护，而且往往需要加强注射。此外，需要开展研究工作，开发针对新出现的马病原体的有效疫苗。在这篇综述中，我们提供了一份全球批准的马疫苗佐剂清单，并讨论了它们的组成和作用方式。在已上市的马疫苗中使用了多种佐剂，主要种类是铝盐、乳剂、聚合物、皂苷和iscom。我们还介绍了已经用于其他物种疫苗接种的兽医佐剂，目前正在马身上进行评估，以改善马的疫苗接种，并满足马行业对病原体的预期保护水平。最后，我们讨论了正在开发的新型佐剂，如脂质体、聚乳酸聚合物、菊粉、聚ε-己内酯纳米颗粒和共聚物。我们的目标是在对疫苗不信任的背景下，帮助马业专业人士了解已上市马疫苗的成分。此外，本综述为研究人员提供了一份佐剂清单，这些佐剂要么已批准，要么至少在马身上进行了评估，可以单独使用，也可以联合使用，以开发新疫苗。

在人类和动物中，疫苗大大降低了与传染病有关的发病率和死亡率。马也不例外，疫苗接种被广泛用于防止马病原体的传播。根据“同一个健康”倡议，对马种群进行适当的疫苗接种还旨在防止人畜共患病事件和马病原体向人类的潜在传播。马产业(运动、休闲和饲养)正在不断发展。近几十年来，将马匹从一个国家或大陆运到另一个国家或大陆的能力得到了促进[1]。这些运动往往是由涉及来自不同国家的马匹的国际事件推动的，有利于传染病的传播，并经常导致重大流行病。例如，2007年，法国发生了病毒性动脉炎的兽疫[2]马流感(EI)的爆发在2007年影响了澳大利亚，2019年影响了欧洲，也影响了亚洲和美洲[3.，4，5]。2021年，在西班牙瓦伦西亚举行的一场大型马术比赛中爆发了一场重大的鼻肺炎动物流行病。这些暴发的发生反映了对未接种或未有效接种疫苗的马匹的保护存在重大缺陷。加强疫苗接种政策和遵守马疫苗接种建议可以提高疫苗接种覆盖率和对马的保护。然而，疫苗接种方案因国而异，并不总是得到适当验证。为确保马疫苗接种的有效性和安全性，必须定期监测疫苗的效力和安全性，以调整疫苗接种的频率、剂量和成分[6]。一些组织，包括世界动物卫生组织和国际动物健康联合会Équestre，现在正在评估和改进疫苗接种方案，以减少动物流行病的风险。开发更有效或可预防非靶向病原体的新疫苗也应为更好地保护马群免受已知和(重新)出现的病原体的侵害提供杠杆作用。

目前，一大批马疫苗已获批准并已上市。这些疫苗依赖于传统技术，即灭活或减毒活病原体和亚单位疫苗[7]。后者由感染因子的纯化抗原部分组成，特别是蛋白质或肽，需要与佐剂结合以诱导针对该抗原的有效适应性免疫反应。事实上，与完整的病原体相比，纯化抗原不能向抗原提呈细胞(apc)(如树突状细胞(dc))传递有效的激活信号，而树突状细胞是免疫系统的核心角色，可以启动初始T细胞并定向适应性免疫反应。根据定义，佐剂是指旨在增强疫苗所诱导的免疫反应的强度、效力和持久性，以实现对所有形式传染病的持久保护的物质[8]。根据佐剂的来源、化学成分、作用方式和诱导的免疫反应类型，有不同的佐剂分类方法。这可能具有挑战性，因为佐剂通常由几个具有不同性质的分子组成，这些分子组装成具有多种功能的复合物。

在对疫苗不信任的背景下，重要的是帮助马行业的专业人员了解已上市马疫苗的成分和佐剂的作用。向研究人员提供一份在马身上经过验证的佐剂清单也很重要，这些佐剂可用于开发新疫苗。事实上，由于免疫系统固有的特异性，佐剂必须在目标物种中得到验证。换句话说，在小鼠或人类身上获得的结果不一定适用于马[8，9]。已经发表了许多关于佐剂用于人类和其他物种疫苗接种的评论，但据我们所知，没有针对马疫苗中发现的佐剂的专门评论。在这里，我们首先给出佐剂在疫苗中的作用的基本知识。然后，我们提供一份佐剂清单，这些佐剂用于已批准的马疫苗或正在研究中。我们根据它们的化学成分对这些佐剂进行分类。我们还描述了当信息可用时，它们如何刺激马的免疫系统，或者当数据缺失时，描述了其他物种的已知情况。这将为马行业的专业人士提供有关佐剂的可靠信息。这也应该指导研究，以改进目前马疫苗的性能，并有助于开发针对尚未存在疫苗的病原体的疫苗。

“佐剂”的概念是在20世纪20年代由巴斯德研究所的兽医加斯顿·拉蒙(Gaston Ramon)提出的，他首先在注射部位有脓肿的马身上观察到更高滴度的特异性抗体[10]。后来，他证明了引起局部炎症的物质也能提高抗血清的产生。佐剂的概念诞生了，几年后，Glenny和合作者发现了铝盐的免疫刺激作用[11]。然而，佐剂的作用方式几十年来一直不为人知，Charles Janeway在1989年将其定性为“免疫学家肮脏的小秘密”[12]。这句话反映了对许多已知佐剂的作用机制缺乏了解。自[]以来取得了巨大的进步。13，14，15]。即使灰色地带仍然存在，我们现在对佐剂作用下的分子机制也有了更好的了解。有许多马用疫苗可对抗各种病毒和细菌[16]。现有的疫苗战略总体上是有效的，但疫情的发生有时突出了疫苗的局限性，并表明在这一领域进行研究和开发的重要性。疫苗的有效性取决于几个因素。其中，佐剂的选择是最重要的一项。佐剂是现代疫苗(如亚单位疫苗)的基本成分，所需要的特性因抗原和疫苗组成而异[17，18]。

疫苗首先由一种或多种抗原组成，即对寻求保护的病原体具有特异性的分子。为了有效，疫苗必须刺激免疫反应的适应性臂，促进抗原特异性T淋巴细胞的扩增和长期存活，包括CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助T细胞(或Th细胞)，以及分化为浆细胞后分泌抗原特异性抗体的B淋巴细胞。这些抗原特异性细胞可以在血液和淋巴器官中存活数月或数年，这是免疫记忆的基础。疫苗接种试图诱导的主要是这种适应性免疫过程[16]。抗原特异性免疫应答的诱导需要抗原和佐剂提供的免疫刺激信号。其功能是激活先天免疫反应，而先天免疫反应是触发适应性免疫反应的先决条件。先天免疫反应的刺激是由一组有限的保守分子模式介导的，这些模式在大量微生物(如细菌脂多糖(LPS))中共享，或者与细胞损伤(如细胞外环境中的游离DNA)有关。这些病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)被称为模式识别受体(PRRs)的细胞受体识别[15]。这包括但不限于toll样受体(TLRs)、rig样受体(rlr)和nod样受体(NLRs)。这解释了基于减毒活病原体的疫苗通常不需要添加佐剂，因为它们本身含有会激活先天免疫反应的PAMPs。

尽管所有细胞都参与先天免疫反应，但表达大量PRRs的免疫细胞(如中性粒细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞和dc)起着突出作用[15]。一旦被激活，所有这些细胞产生膜配体和促炎细胞因子和趋化因子，有助于诱导适应性免疫反应。在这些不同的人群中，dc发挥着特殊的作用，因为它们是唯一能够激活从未遇到匹配抗原的naïve T淋巴细胞的apc。此外，它们不仅能够在II类主要组织相容性复合体(MHC-II)分子上呈现来自内化抗原的肽，用于激活CD4+ Th细胞，还能够在I类主要组织相容性复合体(MHC-I)分子上呈现肽，这是激活CD8+细胞毒性T细胞所必需的。因此，它们是启动适应性免疫的关键。佐剂的主要作用是诱导dc的抗原呈递和功能成熟。为了实现这一目标，佐剂的性质在诱导的适应性反应类型中起着非常重要的作用[15]。根据佐剂引发的先天免疫反应，疫苗可以刺激th1导向的免疫反应，诱导细胞免疫和/或th2导向的反应，主要诱导体液反应。th2导向的免疫反应导致抗体的产生，调理细胞外病原体，阻止其进入细胞并有利于其消除。th1导向的免疫反应通过刺激细胞毒性细胞，特别是CD8+ T淋巴细胞，促进被感染细胞的消除。CD4+ T淋巴细胞的特定群体与免疫应答的Th1和Th2谱相关，并且可以通过分泌特定细胞因子如干扰素γ (IFN-γ)/白细胞介素(IL-) 12 (Th1)和IL-4/IL-5/IL-13 (Th2)来区分。

除了诱导先天免疫触发和定向适应性免疫应答外，佐剂还具有其他功能[17]。这包括抗原在注射部位的保护和稳定，以确保其持续更长的时间。佐剂还可以通过内吞作用受体增加apc对抗原的摄取，因此，促进抗原的呈递和运输到淋巴器官。注射部位的常驻dc在抗原的捕获和运输到引流淋巴结中起重要作用。例如，缺乏NLRP10(一种由dc表达的NLR蛋白)的小鼠，在铝佐剂免疫后，在诱导适应性免疫应答方面存在严重缺陷。在缺乏NLRP10的情况下，dc无法将抗原从注射部位转运到引流淋巴结，而在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，它们的其他功能得以维持[19]。最重要的是，佐剂可以减少每次疫苗剂量所需的抗原量以及获得和维持保护的注射频率[20.]。因此，佐剂通常同时发挥多种作用[15，17，20.]，而导致它们活动的主要机制有时也存在争议。根据对不同物种的观察，佐剂在马疫苗中可以发挥的作用如图所示1．自发现以来，佐剂化合物的研究取得了长足的进展。然而，只有少数分子被批准用于人类和兽药。事实上，疫苗通常是作为预防措施提供给健康人的。因此，对疫苗及其所含佐剂的安全性要求非常高。这使得开发新的佐剂物质极其昂贵，而疫苗必须相对便宜才能进入市场，特别是在兽医领域。在马疫苗接种领域，大多数使用的佐剂都是老分子，但新佐剂最近被批准，可能会改变现状。

五大类佐剂已被广泛研究用于马疫苗:铝盐、乳剂、聚合物、皂苷和免疫刺激复合物(ISCOMs)。在市售马疫苗和目标病原体中发现的不同佐剂列在附加文件中1．这些疫苗大多是肌肉注射或皮下注射，通常在颈部、臀部或胸部。特异性疫苗也可以通过粘膜下途径或鼻内给药，但这些市售疫苗不含佐剂，因此不在本综述中讨论^®链球菌，流感预防组织^®和顶峰^®I.N.)。

3.1矿物盐

铝盐是最早使用的佐剂之一，在疫苗制备中仍然非常普遍，特别是在人用疫苗中。在疫苗接种史上，它们已被证明具有良好的功效，可以大规模使用，但这种佐剂有局限性(见下文)，铝的毒性现在引起了人们对安全问题的关注[14]。铝盐最初用于含有破伤风和白喉类毒素的疫苗，后来被添加到其他疫苗制剂(百日咳、脑膜炎球菌等)中。疫苗中有两种形式的铝盐:氢氧化铝和磷酸铝。这两种佐剂虽然相似，但具有不同的物理和化学性质，铝佐剂的选择会对疫苗的效果产生影响[17]。氢氧化铝，又称氢氧化铝，是疫苗中最常用的铝盐。它在注射部位缓慢溶解[21]。磷酸铝或氢磷酸铝在注射后在间质组织中溶解得更快。为了起辅助作用，疫苗抗原必须吸附在铝盐上。可以调节不同的物理化学参数以实现所需的吸附:粒径分布，位阻和表面电荷，以适应与抗原的大小和表面电荷相匹配[22，23]。抗原吸附可以在铝盐聚集体表面或内部实现。吸附参数非常重要，因为佐剂的吸附能力越大，疫苗及其反应就越有效。

免疫学家长期以来一直认为铝盐的佐剂特性与注射部位抗原的逐渐释放有关[24]。这一理论此后一直是争议的主题，研究发现，在接种疫苗后几小时切除注射部位并不会干扰铝盐的佐剂作用[24，25]。这表明抗原复合物转运到触发适应性免疫反应的引流淋巴结是一个快速的过程[25]。由于储库理论受到挑战，研究表明铝盐诱导与单核细胞、巨噬细胞和dc的募集和激活相关的局部炎症，这些细胞负责抗原捕获、加工和t细胞呈递[25，26，27]。这些apc中的铝颗粒的内吞作用或吞噬作用允许抗原进入含有水解酶的内溶酶体囊泡网络。内化抗原，首先传递到早期核内体，然后进入晚期核内体，最后进入溶酶体。这些内吞区室的酸度增加，有助于内吞物质的降解[27因为它能激活水解蛋白酶，将蛋白质抗原切割成小肽。吞噬体先与核内体融合，再与溶酶体融合，形成含有水解酶的吞噬溶酶体，并通过液泡质子泵进行酸化[27]。因此，抗原要被MHC-II分子呈递，必须在13到18个氨基酸残基长的肽中加工，主要在核内体中，而不能被完全降解。有人怀疑，通过刺激活性氧(ROS)的产生和抑制吞噬体的酸化和成熟，铝盐可以调节内化物质的降解，从而有利于抗原呈递[27]。内化后，吞噬细胞，尤其是dc确保抗原运输到引流淋巴结[19]。应该指出的是，由于其物理化学性质，铝不能被降解。正是这种特性导致铝聚集体在注射部位和引流淋巴结中持续存在[28]。这就提出了铝盐潜在的长期毒性问题。

铝盐的炎症特性及其激活apc的能力的机制是复杂和有争议的[24]。2008年，nod样受体家族Pyrin结构域3 (NLRP3)炎性体被认为在铝盐的炎症特性中起关键作用[29，30.，31]。激活后，NLRP3的多聚化允许含有CARD (ASC)的凋亡相关斑点样蛋白的募集，进而募集和激活Caspase-1 [29]。该蛋白酶将IL-1β和IL-18的前肽切割成分泌的成熟的促炎细胞因子。此外，NLRP3炎性小体可以通过激活Gasdermin D诱导裂解性促炎细胞死亡，称为焦亡[32]。铝盐如何激活NLRP3仍然是一个有争议的问题。据报道，铝盐可以破坏巨噬细胞中吞噬溶酶体的膜，从而将其内容物释放到细胞质中，特别是参与炎性体激活的组织蛋白酶B [33]。它们也会诱发K⁺流出,^２＋释放和线粒体产生ROS，这些都是NLRP3激活所必需的[34，35，36]。然而，这些事件在铝盐炎症特性中的顺序和具体贡献仍然存在争议。此外，NLRP3炎性体在铝盐辅助作用中的实际作用受到了几个研究小组的质疑[37，38]。尽管关于NLRP3和Caspase-1在铝盐诱导IL-1β和IL-18中的作用已经达成共识，但这种机制似乎对诱导适应性抗原特异性免疫反应并不重要[38]。除了NLRP3激活外，原子力显微镜还显示铝盐可以结合DCs的细胞膜。这会导致脂质分选和受体聚集，从而激活这些apc [39]。一个更简单的理论是，考虑到注射部位的局部浓度非常高(在60mm范围内;［23])。这可能导致胞质因子的泄漏和细胞外释放DAMPs，包括热休克蛋白70 (HSP-70)和HMGB1，以及细胞内DNA [40，41，42，43]。这些因子分别激活TLR2/4和tlr2 / 9，刺激先天免疫。然而，一些研究排除了这些受体在铝盐佐剂特性中的作用[42，43，44]。坏死细胞死亡也释放三磷酸腺苷(ATP)，与嘌呤素受体P2RX7结合[45]。这推导出K⁺外排并激活NLRP3炎性体[34]。然而，尽管其与炎性细胞因子的分泌有关，但细胞外ATP似乎并未在铝盐的辅助作用中发挥关键作用[46]。最后，细胞外区嘌呤核苷酸的降解导致尿酸在注射部位积聚[47]。结晶尿酸激活炎性体，这与体内铝盐的辅助作用有关[47]。所有这些因素可能共同激活apc并引发适应性免疫反应。最近的一项研究表明，NLRP3炎性体在马模型中具有功能，并可被马单核细胞中的铝晶体和其他具有良好特征的诱导剂激活。然而，结果表明，钾外排途径在马细胞中对NLRP3激活的重要性可能低于其他物种[48]。

人们早就认识到铝盐是很好的体液反应诱导剂[49]。事实上，这种佐剂促进naïve CD4的分化⁺T细胞转化为具有Th2特征的效应淋巴细胞，支持抗体的产生和记忆B淋巴细胞的分化。在小鼠中，这诱导了G1 (IgG1)和E (IgE)同种型免疫球蛋白的产生，但对IgG2a亚类无效[50]。这在第一代用明矾佐剂的传统EI灭活疫苗中被证明是一个问题[51]。因此，铝盐主要用于旨在诱导高水平抗体的疫苗，这是对细胞外病原体或毒素的有效反应(附加文件)1)。相反，它们不能有效地刺激细胞毒性T细胞反应，而这种反应通常是控制细胞内病原体所必需的[26，49]。因此，铝基佐剂补充了葡萄糖吡喃酰基脂质A (GLA;又名单磷酰脂质A或MPL)已被开发出来(葛兰素史克公司的佐剂AS04)，以便使免疫反应偏向于Th1谱。与人类疫苗不同，铝盐不是马疫苗中最常用的佐剂。它们占马疫苗中佐剂的不到10%。这些佐剂主要存在于马破伤风疫苗中[52]， ei [7]、狂犬病[53]和扼杀，特别是单价疫苗(附加文件)1)。

3.2乳剂

乳化液是两个通常不相混的相相互分散，并通过添加表面活性剂(如Span 85)来稳定的过程^®或80岁之间^®．表面活性剂的亲脂性或亲水性取决于乳液的类型，即分散的液滴是水基还是脂基[54]。乳状液主要有三种类型:油包水(W/O)、油包水(O/W)和油包水(W/O/W)。W/O佐剂允许抗原在注射部位逐渐持续释放，即所谓的库效应，而O/W乳剂不会形成库，而是迅速激活apc [55，56]。乳剂佐剂常用于兽用疫苗。在W/O乳剂中，抗原在水溶液中的液滴中被包裹在亲脂相中[54]。这类佐剂中研究最多的是完全和不完全的弗氏佐剂。这些乳剂含有石蜡油，并使用甘露醇单油酸酯作为乳化剂。他们补充(完全)或不(不完全)与干燥的分枝杆菌，以刺激先天免疫。由于其高毒性和注射部位引起的疼痛反应，完全弗氏佐剂很快被放弃(除了在高度管制的实验环境中)，但不完全弗氏佐剂的使用时间较长。它诱导与适度CTL反应相关的强抗体反应。然而，由于会引起严重的炎症反应，使其无法在人类和宠物身上进一步使用[13，14，17]。此外，这第一代乳剂佐剂是基于不可代谢的矿物油，而矿物油是已知的致癌物质[49]。多年来，研究人员继续对W/O乳剂进行研究，新一代乳剂是基于纯化矿物油，但也有植物油或动物油，如角鲨烯[57]。这些可代谢的物质更安全，只会引起中度的局部炎症。一些以蒙地尼为基础的不完全SEPPIC佐剂(ISA)就是一个很好的例子。来自ISA家族的W/O佐剂，如ISA 61，用于兽医疫苗，如口蹄疫(牛、猪)、禽流感、新城疫(家禽)或一些养殖鱼类疫苗。它们通过增加免疫的强度和持续时间来提高疫苗的效力[15]通过诱导局部炎症导致apc的募集和激活[17]。油基佐剂主要刺激抗体反应，但一些W/O型乳剂也能激活细胞毒性T淋巴细胞[58]。ISA家族的另一种W/O佐剂ISA 50已被用于马的实验性疫苗接种，但成功率不高[59]。这些W/O佐剂尚未用于已上市的马疫苗。

在水包油乳剂中，最具代表性的是由Novartis、GSK、Sanofi Pasteur和SEPPIC分别开发的MF59、AS03、AF03和ISA 35 [49]。这些乳剂是油(如角鲨烯或α-生育酚)在水中的微滴，由Tween 80等表面活性剂稳定。抗原的释放比W/O乳剂更快。油滴将允许抗原被运送到淋巴结，在那里抗原沉积将由apc呈递[54]。这些佐剂已用于针对季节性和大流行性病毒的人流感疫苗中。MF59诱导th2偏向谱的细胞介导反应[60]。研究人员用合成的TLR4激动剂补充乳剂佐剂，以使免疫反应偏向Th1谱。抗原释放后，局部轻度炎症反应导致TNF-α和IL-1β细胞因子分泌，单核细胞向dc分化，单核细胞和中性粒细胞等多种免疫细胞募集[54，57]。实验显示，注射MF59后几分钟内ATP释放显著增加。当与MF59共注射时，apyrase消除细胞外ATP，适应性免疫反应减弱。这些结果证明ATP的细胞外释放是MF59佐剂活性的关键步骤[46]。如前所述，ATP可以激活嘌呤能受体P2RX7，从而导致K⁺外排和NLRP3激活。然而，MF59的辅助作用并不依赖于NLRP3和Caspase-1，而是需要所有tlr (TLR3除外)和IL-1R共有的MyD88接头以及参与不同类型炎性小体的ASC接头[61，62]。AS03的佐剂作用被Morel等人证实，并与先天免疫系统的刺激有关[63]。结果表明，AS03可瞬间激活注射肌和引流淋巴结内的NF-κB。作者还观察到注射后6至48小时内肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的增加。此外，AS03显示出其诱导dc和单核细胞迁移的能力[63，64]。然而，其辅助作用的信号事件尚未被描述。MF59, AS03和AF03不用于马。马疫苗中发现的一种O/W佐剂是MetaStim^®是一种以角鲨烷为基础的乳液，包括Pluronic poloxamer和Tween 80作为表面活性剂，由硕腾公司商业化。在针对马流感病毒(EIV)和西尼罗河病毒(WNV)(分别为Fluva Innovator和West-Nile Innovator)的疫苗中发现了这种病毒。一项研究表明，MetaStim^®刺激IFNγ和IL-12表达的Th1免疫反应特征比铝盐更有效[65]。O/W佐剂ISA 35存在于针对EIV和马疱疹病毒(EHV)的马疫苗中，并在针对非洲马病的疫苗接种试验中显示出阳性抗体反应[66]。

水/油/水乳状液已经被研究过，但生产仍然比较困难，而且这些乳状液通常不稳定。只有少数这种类型的佐剂特别用于牛和禽疫苗[54]。ISA 206是一种W/O/W佐剂，已在实验性马疫苗接种中进行了相对成功的测试，其效果优于ISA 35，但据报道有副作用[67]。

Montanide™IMS是一系列佐剂，含有不同尺寸的微乳液混合物(10-500 nm;含或不含免疫刺激化合物)。在针对马病原体的疫苗配方中测试的佐剂是IMS 3012、2211和1313。这些佐剂主要用于抗流感疫苗的研究红球菌属等．IMS 3012是一种水基微乳液[68]。两项研究表明，IMS 3012作为疫苗接种佐剂时，局部反应轻微或无反应红球菌属等或生产一种多价蛇抗蛇毒血清[67，69，70]。研究表明，接种疫苗的马红球菌属等经IMS 3012辅助后，其调理能力有所增加[68]和成年马中表明Th1反应的IgGa和IgGb的增加，以及表明Th2反应的IgGT的增加[68，69，70]。IMS能显著提高外周血淋巴细胞中IFNγ、IL-2和IL-10 mRNA的表达[69]。在同一项研究中，比较了三种佐剂(IMS 3012, IMS 2211和ISA 35)的效果，结果表明，IgGa和IgGb的产量最高红球菌属等用IMS 3012获得。此外，研究表明，接种疫苗对红球菌属等与IMS 3012和抗红球菌属等孕母马驹的高免疫血浆保护马驹在污染环境中免受感染[j]71]。相比之下，IMS 3012在针对非洲马病的疫苗接种试验中获得了较差的结果[66]。最近研究了IMS 1313作为马的自体疫苗沙门氏菌血清导致母马流产。用IMS 1313佐剂的疫苗在马身上使用沙门氏菌血清作为意大利堕胎危机的应急工具母马在第二次免疫后产生了很高的体液反应[72]。最后，研究使用IMS 3012和1313佐剂的疫苗红球菌属等和沙门氏菌血清分别表明，接种疫苗能够为新生马驹提供被动免疫[68，72]。为了证实这些结果，需要进一步研究母体抗体干扰和被动保护对马驹的影响[6]。此外，进一步研究这些佐剂的作用机制也将有所帮助。

3.3聚合物

碳水化合物是用于稳定纳米乳液的亲水丙烯酸聚合物。自20世纪70年代以来，它们一直用于兽医疫苗，特别是用于抗EIV疫苗[73，74]， ehv [75，76，77]和西尼罗河病毒。它们现在在大量商业化的马疫苗中被发现1)。尽管卡波姆佐剂在兽药中广泛使用，而且在许多兽药疫苗中都含有卡波姆佐剂，但对这种佐剂的研究却少得惊人。其作用方式尚未阐明，但已知卡波姆能够刺激先天免疫反应并改善抗原递送。研究表明，卡波姆佐剂可增强接种过疫苗的马的抗体产生[73，74]。一项研究还证实了卡波默基佐剂对小鼠流感疫苗适应性免疫反应的影响[78]。t细胞反应分析显示Th1和Th2细胞因子水平升高[78]。已证实卡波姆佐剂增强了对亚基和灭活疫苗的免疫反应，但也增强了对减毒活疫苗的免疫反应[79]。卡波姆活性伴随着促炎细胞因子的高分泌和白细胞的早期募集。一项研究表明，一种基于碳水化合物的佐剂可以刺激CD8⁺T细胞通过交叉递呈机制，即从内化抗原中获得的肽在MHC-I分子上的递呈[80]。令人惊讶的是，代谢分析显示，碳水化合物刺激的dc并没有表现出典型的以诱导有氧糖酵解为特征的活化dc的代谢，而是表现出基础糖酵解活性，并伴有较低的线粒体呼吸。尽管本研究中使用的基于卡波默的佐剂激活了IL-1β和IL-18的产生，但一项使用Caspase-1、NLRP3和ASC缺乏的dc的实验显示，dc的交叉呈递能力并未受损，这表明所使用的卡波默激活炎性体并不需要增强交叉呈递[80]。相反，结果表明，通过增加脂质过氧化和ROS的产生，这种基于碳水化合物的佐剂促进抗原从核内体逃逸到细胞质，使抗原被蛋白酶体降解成多肽，用于装载MHC-I。碳水化合物也被证明影响吞噬作用。对卡波波的研究表明，卡波波的颗粒主要存在于吞噬细胞群中。吞噬后，卡波醇在溶酶体中发生构象变化，触发ROS的产生，从而引发炎症机制[81]。IFNγ的早期诱导在卡波姆的佐剂作用和细胞免疫应答的诱导中是重要的。此外，体外和体内分析表明，卡波姆佐剂不直接作用于tlr或其他PRRs，如NOD1、NOD2或rig - 1 [81]。由于其组成，carbomer已被研究与其它乳剂型佐剂如MF59(前面描述过)联合使用。观察到强烈但互补的免疫反应。一项研究分析了卡波姆(Carbopol 971P)和乳剂(MF59)的组合对动物体内HIV-1包膜糖蛋白(gp140)的体液反应的功效[82]。在第2次注射后2周和第4次注射后15周的兔血清中进行的elisa检测显示，与单独接种MF59或Carbopol 971P的兔血清相比，Carbopol 971P/MF59联合免疫的兔血清抗体效价和亲和力更高。虽然这种组合的作用机制尚未被研究，但作者推测MF59增强抗原呈递和APC募集的能力与Carbopol 971P激活B细胞的能力相结合，从而诱导有效的疫苗接种[82]。

EI疫苗是第一批用卡波默佐剂研究的疫苗之一。在Mumford等人1994年的研究中，比较了两种EI疫苗，一种用铝盐佐剂，另一种用卡波姆佐剂，发现卡波姆佐剂的抗体刺激更高，保护时间更长[73]。总的来说，卡波姆似乎是有效的佐剂，特别是在兽医领域，但这种佐剂的作用机制仍有待阐明。Havlogen^®是caropol 934P与聚烯丙基蔗糖和乳化剂交联的制剂，如1975年美国专利No. 3919,411所述[83]。一些马疫苗使用一种叫做碳免疫的佐剂^®．这种专有佐剂是一种基于羧基聚合物的物质，但我们没有得到额外的信息(个人通信)。

另一种佐剂聚合物是基于高度稳定的聚丙烯酸钠微粒凝胶[84]。商业化的一种特殊等级的PET GEL A已经测试了令人鼓舞的疫苗接种结果红球菌属等小马驹和成年马的非洲马病[66，70]。该佐剂还与疫苗级Poly(I:C) (vacciggrade™;Invivogen)用于对母马进行实验性避孕接种[85，86]。

3.4皂苷

皂苷是一种复杂的三萜类化合物混合物，从南美的一种树的树皮中提取。它是一种免疫刺激剂，也存在于疫苗佐剂中。皂苷具有乳化特性，可用作表面活性剂，但由于其炎症特性和毒性作用，不是稳定乳剂的主要成分。活性佐剂化合物是一种粗植物提取物，叫做Quil A [14]。奎尔A在不同疾病的兽医疫苗中的佐剂能力已被证实:猫白血病疫苗、口蹄疫疫苗、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗[54]。这是所有皂苷中研究最多的一种，但尽管它具有强大的佐剂特性，但由于其溶血活性和诱导部位反应，粗品奎尔A毒性太大而不能使用[87]。为了避免毒性，对Quil A进行了分馏，研究最多的是QS-21 [88]。近年来，研究主要集中在皂苷作为佐剂和毒性较低的形式现在广泛用于兽用疫苗[55]。奎尔a衍生皂苷，例如QS-21与MPL和脂质体(佐剂AS01, GSK)联合使用[89]或用乳剂(AS02) [49]，或与胆固醇和磷脂结合形成免疫刺激复合物(ISCOMs)具有降低毒性和佐剂特性(ISCOM系统将在下一章详细描述)。这些佐剂通过细胞因子刺激诱导强烈的Th1和Th2免疫反应。它也激活CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞和改善APCs的抗原呈递[90]。据推测，皂苷能够与胆固醇相互作用，在细胞膜上形成孔，特别是在树突状细胞中，从而释放细胞细胞质中的抗原。这允许抗原肽在mhc - 1分子上的装载和ctl的启动[90]。

Warda等人的研究表明，含有皂苷佐剂的EI疫苗在接种后可维持保护性抗体滴度长达8个月[91]。赫尔曼及其同事的一项研究表明，一种专有佐剂:G3(奎尔A和胆固醇的组合)对马外周血单个核细胞的影响。G3佐剂似乎通过诱导促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10)刺激th1导向的免疫反应。在主要依赖于细胞介导免疫的情况下，针对病原体的疫苗寻求这种概况[92]。在针对非洲马病的疫苗接种试验中，G3取得了令人鼓舞的结果[66]。尽管皂苷被广泛使用，但人们对其如何刺激免疫系统仍知之甚少。NLRP3炎性体的诱导已被充分记录，但其机制仍有待阐明[32]。

3.5免疫刺激复合物(ISCOMs)

皂苷的特性是iscom发展的根源。这种佐剂最早出现于1984年，在小鼠模型中使用含有副流感病毒3、麻疹病毒和狂犬病毒膜蛋白的基于Quil的ISCOMs疫苗接种研究[93]。像奎尔A这样的皂苷具有与膜脂相互作用的能力。在胆固醇、磷脂酰胆碱和奎尔A以适当比例存在的情况下，ISCOMs特有的“开笼”结构将形成，允许两型抗原的结合。ISCOM可分为两种类型:经典ISCOM和ISCOM- matrix，分别是抗原在ISCOM组装过程中被包含或添加到预成型的ISCOM中[7，93，94]。在这两种系统中，抗原肽以相同的效率装载在MHC-I和MHC-II分子上[95]。iscom在很长一段时间内诱导高抗体产生。它还诱导Th1和Th2反应，以及强有力的CTL反应和促炎细胞因子的合成[7，94]。最后，它们改善了apc的抗原呈递[94，95]。

iscom在牛羊病毒性腹泻模型中有效诱导产生中和抗体[96]。2008年，Paillot等人对接种了ISCOMs佐剂EI疫苗的小马进行了一项研究，结果显示可诱导th1型免疫反应，特异性抗体水平升高，产生IFN的特异性T淋巴细胞百分比增加[97]。在病毒攻击后，接种疫苗的马观察到临床症状的严重程度和病毒脱落的减少[97，98，99，One hundred.]。在马中，iscom主要存在于单价EI和链球菌等疫苗和破伤风-破伤风联合疫苗(附加文件)1)。EI ISCOM疫苗与破伤风类毒素联合使用已证明在长期(15个月)内具有保护作用[101]。Cullinane的一项研究比较了三种含eiv疫苗在小马身上引起的免疫反应:一种含ISCOMs的灭活全病毒疫苗;氢氧化铝全病毒灭活疫苗的研制多价疫苗也含有EHV1-4和呼肠孤病毒1型和3型。在初级和第一次加强接种后的小马试验中，氢氧化铝单价疫苗提供的抗EIV血凝素抗体滴度高于iscom疫苗或多价疫苗[102]。另一项研究比较了三种EI疫苗:全病毒疫苗、含ISCOM基质的亚单位疫苗和重组金丝雀痘疫苗。全病毒疫苗的抗体应答效果最好。相比之下，iscom基疫苗对IL-4诱导的增强效果最好[103]。所有三种疫苗都类似地刺激IFN-γ表达[103]。与重组疫苗相比，ISCOM佐剂灭活全病毒疫苗的急性期反应(血清淀粉样蛋白A)、纤维蛋白原和白细胞反应也明显更高[104]。此外，有研究表明，iscom佐剂的EI疫苗可以与Carbopol®佐剂的EHV同时接种，而不会干扰抗体应答[77]。ISCOM佐剂已在EHV1疫苗中进行了研究。检测到高水平的中和抗体。虽然它不能预防攻击后的感染，但与未接种疫苗的对照组相比，临床症状、鼻排泄和细胞相关病毒血症有所减少[105]。iscom还在一种疫苗中进行了测试链球菌等含有链球菌等抗原与ISCOM-Matrix佐剂，AbISCO。虽然没有直接解决佐剂作用，但研究表明，通过减少临床症状和细菌脱落来评估，疫苗对小马的勒死提供了一定程度的保护[106]。在这项研究中，两种abisco佐剂疫苗被联合使用:一种含有AbiSCO-200的肌肉注射疫苗^®一种含有AbISCO-300®佐剂的鼻内疫苗。最后，一项安全性研究测试了一种基于iscom的EI疫苗配方。这项研究是在两个被认为易感的马群中进行的:小马驹和怀孕的母马。作者未观察到明显的局部和全身反应，观察到的少数局部反应被认为是轻微的[98]。

iscom用于抗EI的商业疫苗，链球菌等和有毒物质造成梭状芽胞杆菌(附加文件1)。我们之前提到的一项研究表明，与氢氧化铝佐剂相比，基于iscom的EI疫苗诱导的抗体滴度较低[102]，但在保护方面是否存在显著差异还有待进一步研究。对ISCOMs作为其他马病原体疫苗接种的佐剂进行未来的研究也将是有趣的。此外，需要对这些疫苗进行进一步的比较研究，以测试不同抗原的免疫反应，并在6个月至1年的较长时间内进行比较。疫苗接种试验通常在初次或第一次和第二次加强疫苗接种后进行。有必要在远离初次接种和每年加强后对加强剂量的疫苗进行比较，以确认这些佐剂的益处。最后，研究应侧重于iscom与其他佐剂的组合，如针对EIV和ev的Equip FT疫苗有毒物质造成梭状芽胞杆菌因为这种组合还没有被广泛探索。

佐剂对提高抗原的免疫原性和提高疫苗的效力具有重要作用。随着对佐剂作用机制的理解的进步，疫苗得到了改进，包括诱导适应于寻求保护的病原体类型的免疫反应。马疫苗中有几种佐剂，目前正在对马研究新的佐剂。在正在研究的佐剂中，脂质体似乎对马的疫苗接种很感兴趣。脂质体的许多参数为它们作为佐剂的使用提供了广泛的可能性。大小、脂质组成、表面电荷和结构都是影响脂质体佐剂性能的参数[107]。它们的佐剂作用很大程度上与在注射部位形成沉积物有关，从而促进抗原通过apc运输。事实上，脂质体可以将抗原递送到apc，在MHC-I和MHC-II分子上呈递，也可以吸引吞噬细胞到注射部位，然后吞噬细胞迁移到淋巴结，最终与T细胞相互作用。脂质体已被证明可诱导Th1和Th2反应[107]。这种双重能力是防治新出现疾病的必要条件，而且越来越受欢迎。由于脂质体-核酸复合物在小鼠模型中显示出良好的结果，因此正在研究用于开发马西部马脑炎病毒疫苗的脂质体-核酸复合物。接受脂质体佐剂疫苗的小鼠产生保护性抗体，并在病毒攻击中存活下来[108]。另一种正在马身上进行研究的佐剂是基于聚乳酸(PLA)或聚乳酸-羟基乙酸酯(PLGA)的聚合物颗粒[109，110，111]。这些可注射的可生物降解聚合物颗粒代表了一种控制疫苗抗原释放的有趣方法。在勒死疫苗小鼠模型中，pla已被证明具有刺激体液和细胞反应的能力。小鼠接种含有勒死病原体抗原的基于pla的疫苗后，脾细胞分泌的抗原特异性IgG、IL-2和IFNγ增加[109，110]。委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的致命攻击在用plga包封VEE疫苗免疫的小鼠中被证明具有保护性反应[111]。

在马疫苗接种领域，新佐剂的开发应促进针对新出现的马疾病的疫苗的开发。一项研究比较了3种与非洲马病病毒(AHSV) rVP2蛋白偶联的佐剂:皂苷、磷酸铝和ISA 50 (W/O) [59]。与明矾和ISA 50免疫相比，皂苷佐剂抗原对AHSV致命毒株的实验感染具有良好的保护作用，仅诱导部分免疫。59]。本研究证实，对特定抗原选择佐剂是疫苗免疫原性的决定因素。一种以菊粉为基础的佐剂，名为ADVAX™(一种源自植物的天然多糖)制备灭活日本脑炎病毒(JEV)的疫苗，已在体内进行了研究，使小鼠和马体内的中和抗体增加，并完全保护小鼠免受实验性JEV感染[112]。在一项针对怀孕母马和小马驹的临床前研究中，这种疫苗制剂引起了强烈的中和抗体反应[113]。需要进一步的研究来优化乙脑疫苗的制备，并确认疫苗在更大的马群体中的免疫原性和由此产生的保护作用。基于聚ε-己内酯包封的纳米颗粒佐剂体系的应用链球菌等在鼻内接种的小鼠中，抗原能够诱导强烈的体液(增加IgG)、粘膜和Th1免疫反应[114]。这种佐剂有望控制绞杀，在目标物种中进行测试将是很有趣的。最后，聚酸酐纳米颗粒和五嵌段共聚物水凝胶正在被开发作为抗EIV的佐剂。它们被证明可以保持重组EIV血凝素三聚体的结构，并提供抗原的持续释放[115]。

图中概述了马疫苗中可用的或正在研究的佐剂类别2．有趣的是，这强调了这样一个事实，即对于几种马疾病，只有一小部分可用的佐剂进行了疫苗接种测试。此外，在大多数情况下，尚未测试佐剂组合(或“多路”)以形成更精细的佐剂复合物。

本综述建立了马疫苗中已上市或正在研究的不同佐剂的清单。结果表明:(i)市场上的马疫苗中使用了相对较多的佐剂，(ii)正在马模型中研究几种创新佐剂以及佐剂/抗原组合，(iii)疫苗佐剂在马身上的作用方式尚未充分表征，在理解其保护潜力方面留下了一些灰色地带。此外，虽然疫苗在预防严重疾病方面的好处是不可否认的，但它们的长期安全性是争议的主题。随着新疫苗和佐剂的开发，持续监测副作用以确保疫苗在批准后的安全性是很重要的。包括佐剂在内的疫苗目前面临的挑战是在确保最佳安全性的同时提供针对新出现疾病的保护。为了实现这一目标，马健康研究必须不断提高其性能，促进该领域副作用的记录，并增加对佐剂在马模型中的作用机制的研究，因为从其他模型获得的信息并不总是可转位的。马领域动物流行病的经常发生是支持不断改进疫苗和佐剂的理由，以便加强动物保护，并能够开发针对新出现的马疾病的新疫苗。

本研究由Fonds epperon OVERLORD N12-2017，诺曼底郡议会(17E01598/17EP04324)， IFCE (Institut francalais du Cheval et de l 'Equitation)拨款号2022- 015 (VACADEq项目)资助。CENTAURE欧洲项目由欧盟诺曼底郡议会在2014-2020年ERDF-ESF运营计划框架内共同资助。

作者指出

1. stacimane Pronost和Pierre-Olivier Vidalain对这项工作也做出了同样的贡献

作者及单位

1. LABÉO, 14280，法国圣contest

   弗洛拉·卡内和斯特文森·普罗诺斯

2. 诺曼底大学BIOTARGEN, UNICAEN, 14280, Saint-Contest，法国

   弗洛拉·卡内和斯特文森·普罗诺斯

3. 里昂大学国际传染病研究中心，法国里昂1111;里昂第一大学，法国里昂国家科学研究院，法国里昂5308;里昂国立科学研究院，法国里昂Tony Garnier大道21号，法国里昂69007

   劳伦·佩兰-科孔，文森特·洛托和皮埃尔-奥利维尔·维达兰

4. 英国切姆斯福德郡里特尔勋爵路里特尔大学马与兽医物理治疗学院

   罗曼Paillot

贡献

所有作者都讨论了这些主题。FC, SP和POV撰写论文。FC和POV对佐剂的研究进行了广泛的文献综述。LPC, VL和RP对稿件的修改有贡献。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Stephane Pronost或Pierre-Olivier Vidalain．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

主编:Marie Galloux

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