基于培养独立研究的抗菌素和重金属使用对猪抗菌素耐药谱影响的见解

抗微生物药物耐药性是对人类、动物和环境健康的全球性威胁。在养猪生产中，抗菌剂和重金属(如氧化锌)通常用于治疗和预防疾病。然而，抗菌剂和重金属对猪抗药组组成的影响以及影响这种耐药性的因素尚不完全清楚。测定不同样品类型中抗菌素耐药基因存在的技术的进步，使人们能够更全面地了解抗性组及其影响其组成的因素。本文综述的目的是为了更好地了解抗菌素和重金属的使用对养猪场抗菌素耐药性的发展和传播的影响。此外，本综述的目的是确定可能影响猪抵抗组的其他因素。利用PubMed (NCBI)、Scopus (Elsevier)和Web of Science (Clarivate Analytics)数据库的系统方法，确定了使用高通量测序或定量PCR方法检查抗菌素耐药性与抗菌素和重金属使用之间联系的相关文献。总共有247条独特的记录被发现，28篇出版物被确定为符合纳入本综述的条件。基于这些，有明确的证据表明，抗菌素和重金属的使用与猪的抗菌素耐药性呈正相关。此外，还报道了赋予抗菌素耐药性的基因与可移动遗传元件、微生物组和病毒组的关联，这些基因进一步受到宿主、环境或治疗本身的影响。

抗微生物药物耐药性(AMR)是二十一世纪全球关注的重大问题之一[1]。由于认识到人类、动物和环境健康之间的相互联系，也被称为“同一个健康原则”，因此在牲畜生产等初级生产系统中普遍存在的抗微生物药物耐药性令人极为关切。[2]。在养猪生产中，抗菌剂和重金属主要用于预防和治疗与动物发病率和死亡率、生产性能下降(即动物生长)相关的疾病，这些疾病给养殖户造成了巨大的经济损失，并给动物带来了健康和福利问题。然而，抗菌素的使用(AMU)和重金属的使用(HMU)与抗菌素耐药性的发展和传播有关，并且已经制定了减少动物生产中抗菌素耐药性的全球目标，正如世界卫生组织(世卫组织)和世界动物卫生组织(世卫组织)分别于2015年和2016年启动的“抗菌素耐药性全球行动计划”和“世界动物卫生组织抗菌素耐药性和谨慎使用抗菌素战略”所概述的那样[3.，4]。此外，氧化锌和抗菌剂等重金属的使用也与环境污染有关，因为它们的生物利用度低，往往不能被完全吸收，因此可以在牲畜粪便中发现高浓度[5，6]，它经常被用作牧场和作物生产中的有机肥料，对环境和公众健康构成潜在风险。

根据世界卫生组织全球行动计划的要求，每个成员国都必须制定自己的行动计划，以应对和防止抗生素耐药性的传播和发展。在欧盟最新的立法变化中，根据《兽药产品条例(EU) 2019/6》和《药用饲料条例(EU) 2019/4》，自2022年1月起禁止在畜牧生产中预防性使用抗菌剂，并从2022年6月起禁止预防性使用药用水平的氧化锌。这些措施的目的不仅是减少抗菌素耐药性的发展和传播以及环境污染，而且还抑制在常规农场协议中使用抗菌素，并通过农场管理、生物安全、卫生、免疫预防和动物福利措施促进动物健康。[7]。

抗生素敏感性试验等评估抗菌素耐药性的传统方法依赖于细菌生长，并且主要局限于特定的可培养物种，这使得抗菌素耐药性只能在有限的光谱范围内检测到。然而，抗菌素和重金属耐药性并不局限于这些细菌，而可能与可能在抗生素耐药性传播中发挥作用的不可培养微生物有关[8]。AMR监测的新方法，如高通量下一代测序和定量PCR (qPCR)方法，提供了进一步的见解，并改善了对与抗菌素耐药基因(ARGs)相关的AMR的流行、发展和传播的理解。这些方法可用于分析特定的微生物，也可用于研究更复杂的微生物群落，如肠道微生物群。

正如Waseem等人所述，qPCR和宏基因组学这两种方法各有优缺点。[qh]9]。与宏基因组学方法相比，高通量qPCR方法的新发展，如预先设计的引物集，如“引物集2.0”，由384个引物阵列组成，针对ARGs和移动遗传元件(MGEs)，可能使分析抗性组的方法具有成本效益和用户友好性[10]。除此之外，与宏基因组学方法相比，qPCR方法可能具有更低的检测限，并且可以更深入地了解AMU和HMU与AMR的关联[9]。宏基因组学通常涉及复杂的分析管道和生物信息学工具，熟练的人员是必不可少的。虽然基于qpcr的方法需要对作为分析一部分的目标基因有良好的了解，但宏基因组学方法更加独立，除了通过选定的精心策划的数据库筛选ARG外，还可以识别可能导致AMR的未知序列[9]。

本综述的目的是总结研究结果，利用这种与养殖无关的方法，调查生猪生产中AMU、HMU和AMR之间的关系，以确定可能影响猪场AMR的因素和驱动因素。

2.1文献检索策略

采用系统的文献检索方法来确定科学文献，这些文献调查了在商业养猪场使用抗菌剂和重金属与猪的抗菌素耐药性之间的关系。此外，本综述仅包括使用培养独立方法的研究，如宏基因组学和定量PCR，尽管额外使用培养依赖方法并不是排除标准。

文献使用PubMed (NCBI)、Scopus (Elsevier)和Web of Science (Clarivate Analytics)数据库进行鉴定。根据PIO(人口，干预，结果)标准制定关键问题。为了在一个PIO组中分隔搜索词，使用了布尔运算符“OR”(表1)1)，因此PIO组使用布尔运算符“AND”组合。为了进一步完善文献检索，在文献检索“附加术语”中加入了一个额外的组，以排除所有没有提供基于文化无关数据的文献(表1)1)。对于Scopus数据库，搜索仅限于标题、摘要和关键词，进一步限制文献结果。

只有从1月1日起用英文出版的记录^圣从2000年1月到10日^th，作为文献检索的一部分纳入结果。所有发现的记录被导入并通过EndNote X9参考管理软件(Clarivate Analytics;版本:X9.3.3)。文献检索结果分别从Web of Science、Pubmed和Scopus数据库中检索到118条、145条和180条(n = 443条总记录)。

2．2确定论文的纳入和排除标准

在文献细化之前，使用EndNote X9删除重复。总共删除了152个重复记录，留下291个记录，通过两个相关筛选步骤进一步筛选，以确定其是否适合纳入本综述。第一个筛选步骤是基于记录标题和摘要中的可用信息，而第二个筛选步骤是基于对第一个筛选步骤中未删除的记录的全文分析。

未被Endnote X9识别的重复项在第一步筛选中被删除(n= 44)。根据设定的纳入标准，所有检查抗菌剂和重金属使用如何影响猪抗性组的记录都被归类为合适。然而，在以下情况下，文献被排除:(1)没有关于抗菌剂和重金属使用以及猪抗性组的信息，(2)不关注猪，(3)关注抗菌剂替代品，(4)猪生产以外的环境，(5)用于促进生长的抗菌剂和重金属，以及(6)没有考虑抗菌剂和猪抗性组之间关联的文献。文献筛选后，剩下32条记录，其中3篇综述讨论了已经纳入文献选择的研究结果，1篇文献采用培养依赖法进行AMR量化。因此，还剩下28项记录。关于文献选择的进一步信息可以从PRISMA流程图中提取(图1)1)。

3.1文献综述及其研究方法

本文献综述共纳入28项研究。大多数研究都是在一个国家进行的(n= 24)，其中4项是国际水平的比较。后者包括将美国一家研究机构的随机试验与中国三个养猪场的抗菌素耐药性进行比较(n= 1)， 9个欧洲国家农场抗菌素耐药性比较(n= 2)以及中国、丹麦和法国猪场的AMR比较(n= 1)。大多数单一国家的研究是在美利坚合众国进行的(n= 8)，其次是欧洲(n = 6)、中国(n= 5)，加拿大(n= 3)，厄瓜多尔(n= 1)，泰国(n= 1)。没有发现基于中低收入或低收入国家的研究，因此不能排除本综述的地理和经济偏差。有关上述研究的地理分布详情见图2。

虽然28项评估研究的方法差异很大，但大多数研究(n= 19)报道AMU或HMU与AMR呈正相关(AMU-AMR: n = 18;HMU-AMR:n= 5)(附加文件1)。其余9项研究要么报告AMU和HMU之间没有关联，要么报告AMR (n= 6)或在没有AMU和HMU的情况下调查AMR，或仅在AMU下调查抗性组的发展(n = 3)。研究通过使用宏基因组学(n= 17)， 16S rRNA基因扩增子测序(n = 1)或定量PCR (n = 8)方法，或两种方法(n= 2)，可以从附加文件中额外提取1。在总共28项研究中，15项为观察性研究，13项为随机对照试验。

有趣的是，所有基于测序的研究都使用短读测序方法，如Illumina (n = 16)， 454 pyrosequencing (n = 3)，或两者(n = 1)来研究AMR。造成这种情况的潜在原因可能是长读段测序方法的成本较高，部分原因是其依赖于短读段测序来弥补长读段的低覆盖率和克服高错误率[11，12]。因此，这也与更复杂的分析步骤有关[11]。尽管这些挑战仍然存在，但长读测序方法可以防止重复和高度保守区域的错误组装，这将允许更深入和更准确地解析宏基因组[11]。此外，这些方法允许更准确地将功能特征(如抗性基因)分配到物种水平的特定分类群或MGEs，这通常局限于短读测序方法的相关分析。在使用qPCR方法的研究中也发现了局限性。虽然有10项研究使用了这种方法，但其中只有3项研究使用了预先设计的复杂引物集，例如由数百个抗性基因和MGEs引物组成的“引物集2.0”。其他7项研究使用了小引物集，这可能允许研究特定ARGs丰度的增加，但不能捕获宏基因组的复杂性。这七项研究中有两项额外使用了短读测序方法来潜在地解释这一局限性。猪生产中AMU和AMR之间的关联在之前的培养依赖性研究中已经描述过[13]。对重金属也进行了类似的观察。锌和铜补充剂的使用与AMR的增加及其持续存在有关，这是由于交叉抗性(对多种化合物产生抗性的抗性机制)和ARGs在MGEs上的共存，从而对不同的化合物产生抗性[13，14，15]。此外，正如对甲氧西林耐药所观察到的那样，这些机制可能促进抗菌素或重金属给药期间微生物群落的破坏，从而促进抗菌素耐药性病原体的生长金黄色葡萄球菌(16，17]。

在这篇综述中，文献被划分并总结为不同的部分(1)无AMU和HMU时的AMR，(2)与AMU相关的AMR(另见附加文件)2)和(3)与HMU相关的AMR(另见附加文件)3.)。此外，研究还根据使用的不同方法进一步划分，即宏基因组学、16S rRNA基因扩增子测序和qPCR。

3.2无AMU和HMU时的AMR

霍尔曼等人在加拿大进行的28项选定研究中的两项。[18和爱尔兰的Joyce等人[19在受控的研究设施中，使用散弹枪宏基因组学方法研究了终身未接受抗菌剂或重金属治疗的猪的粪便抗性组[18]，或since断奶[19]并报道了对四环素类、大环内酯类和氨基糖苷类具有耐药性的ARGs最为丰富。有趣的是，在大多数选定的研究中，无论提供何种治疗，都经常报告对这些抗菌药物类别的耐药性[20.]。

此外，两项研究都报道了抵抗组的组成受到微生物群组成的强烈影响，并以年龄依赖的方式影响，这表明核心ARGs可能是染色体编码的，也可能位于具有特定宿主范围的mge上。这将在后面与AMR的潜在驱动因素一起进一步讨论。Holman等。[18[报道]断奶后，几种对不同抗菌素类药物耐药的ARGs丰度下降，但对四环素和MLSB(大环内酯类、林肯胺类和链状gramin B)耐药的ARGs更稳定。对这些观察结果的一种可能解释是ARGs的宿主特异性，正如他们的研究所表明的那样。因此，宿主范围较广的ARGs，如编码四环素和MLSB抗性的ARGs，在猪抗性组中更稳定，尽管微生物组随着年龄或处理而变化，而宿主范围较窄的ARGs更受微生物组组成的影响，并以年龄依赖的方式产生影响。这在两个β-内酰胺酶编码基因，即bla_CfxA6和bla_ACI-1这些都与普氏菌，并与普氏菌根据Holman等人的报道[18，21]。Loayza-Villa等人也观察到了这些发现。[22]，使用基于qpcr的方法调查断奶后(替米考星[200 ppm]和粘菌素[40 ppm])停用抗菌素预防的情况;29-70日龄的Tiamulin [150 ppm]和氯霉素[450 ppm];70-139天龄时的氯四环素[450 ppm];此外，37-40日龄的甲氧苄啶-磺胺甲恶唑[25 mg/kg/PV]和45-47日龄的强力霉素[10 mg/kg/PV]。在他们的研究中，在断奶后抗微生物药物治疗和未治疗的猪之间没有观察到抵抗组的差异。此外，与Holman等人相似。[18]，他们报告在仔猪达到30日龄后，ARGs随着时间的推移而下降。然而，授予四环素耐药的ARGs和MGEs不受影响[22]。

而Loayza-Villa等人的研究[22]和Holman等人。[18[表明断奶后微生物组的变化会影响抗性组，也有可能过去经常使用廉价的抗菌剂，如四环素促进生长和预防感染，可能选择了特定的耐药细菌，这些细菌多年来一直存在于环境中并影响猪的抗性组，正如Wang等人所指出的那样。]23]。

Joyce等人认为[19]，猪微生物组及其抵抗组不仅受到AMU和HMU的影响，还受到猪不断暴露的外部AMR来源的影响。这些外部来源可包括例如农场工人、啮齿动物和节肢动物、空气、灰尘、土壤、地表水、饲料和饮用水[24]。外部AMR来源可能含有MGEs，这些MGEs在细菌之间传播频繁，因为在共同选择ARGs时，基因赋予了适应性优势，这使得它们可以被猪抵抗组获得[19]。除此之外，遗传、饮食、年龄和动物健康等其他因素也可能影响微生物组，从而影响抗性组[25，26]。

3.3猪中AMU与AMR流行的关系

3.3.1Metagenomics-based研究

在本节的第一部分，基于通过宏基因组学研究抵抗组的研究，讨论了AMU与AMR的关联。Munk等人在欧盟进行了两项关于养猪场相关抗菌素耐药性的最大观察性研究。[27]和Van Gompel等人。[28]是EFFORT(从农场到餐桌的微生物耐药性和传播生态学)项目的一部分，该项目通过使用宏基因组学分析9个不同欧洲国家(比利时、保加利亚、丹麦、法国、德国、意大利、荷兰、波兰和西班牙)181个猪场的粪便样本来调查猪的抗性组。与Joyce等人相似。[19]和Holman等人。[18， Munk等。[27]报道编码四环素和大环内酯类耐药的基因是最丰富的耐药决定因素。此外，Munk等人。[27]报告说，与其他欧盟国家相比，使用较多抗菌剂的国家(如西班牙)与抗生素耐药性流行率之间存在正相关关系。Li等人也做了这些观察。[29]，他调查了从一个中国农场(各种抗菌剂的高AMU)收集的粪便样本中的抵抗组，并进一步与一个法国农场(无AMU)和一个丹麦农场(仅在断奶时使用抗菌剂)进行比较。此外，Li等人。[29研究人员经常观察到ARGs与杀菌剂(brg)和金属抗性基因(mrg)共同出现，这些基因可能由细菌的成员携带肠杆菌科家庭(Enterobacteralesord。11月)。在他们的研究中也观察到多粘菌素耐药与其他ARGs共现[29]。然而，Munk等人没有进一步研究所使用的特定抗菌药物类别与AMR之间的关系。[27]但由Van Gompel等人继续研究[28]。在他们的研究中，Van Gompel等人[28]，研究了不同生产阶段的AMU- amr关系，并观察到这些关联仅在育肥猪中发现，而在AMU最高的生命早期阶段则没有发现。根据Van Gompel等人的研究结果[28]、大环内酯、氨霉素和四环素的给药与ARGs的丰度增加有关，而粘菌素和氨霉素的给药则没有这种影响。此外，他们的研究观察到大环内酯和林可霉素/大观霉素耐药的交叉耐药机制，以及β-内酰胺给药与氨霉素耐药之间的正相关，这表明β-内酰胺治疗的潜在共选择机制。此外，大环内酯类药物耐药性与内部生物安全措施(如使用消毒剂)有关，这再次强调了多种因素对猪抗性组的影响[28]。

Mencía-Ares等人的另一项研究[30.得出了类似的结论。在他们的研究中，收集了467个来自集中粪便，农场环境和泥浆的样本，以比较集约(n= 19)和广泛的(n在西班牙养猪场使用宏基因组学方法。粗放型养猪场，即传统的伊比利亚猪户外养殖，在研究中被描述为更具可持续性和生态友好性，与集约化养猪场相比，抗菌剂的使用受到限制，动物密度更低[30.]。根据他们的结果，他们观察到四环素、氨基糖苷、MLSP(大环内酯、利可沙胺、链状gramin、胸膜嘧啶)的使用与ARGs对这些药物产生耐药性之间的相关性。此外，他们的研究报告称，集约化农场的ARG丰富度高于粗放型农场，这也适用于具有四环素抗性的ARG的多样性类杆菌（tetQ)，或者是门的成员Bacillotacorrig。菲儿。11月(原:厚壁菌门)，包括家人链球菌科（tetL和tetM)。相比之下，在粗放型农场中，具有β-内酰胺抗性的ARGs的多样性高于集约型农场[30.]。对MLSP和恶唑烷酮的抗性基因主要与芽胞杆菌科，链球菌科（optrA),Peptostreptococcaceae（病死率(c))的家庭。此外，他们的研究报告120个细菌家族与94%的指定ARGs相关。另外还观察到共选择和交叉抗性。例如，给药苯酚、四环素或MLP(大环内酯、利可沙胺、链霉素)与对恶唑烷酮和其他抗菌素类药物的耐药性呈正相关。然而，β-内酰胺给药与β-内酰胺耐药之间未见正相关[30.]。尽管作者没有对这一观察结果提供解释，但他们观察到MGEs上β-内酰胺类ARGs的丰度低于其他抗菌类ARGs。因此，需要进一步的研究来解释不同类别的AMU对通过MGEs传播的AMR的影响及其对宏基因组研究中观察到的总AMR的贡献。

Suriyaphol等人的一项基于宏基因组学的研究也发现了特定ARGs与特定分类群之间的关联。[31]，他研究了断奶对猪抵抗组和微生物组的影响。他们的研究报告说，观察到的最高丰度春节(40)，春节(W),mefA，分别授予四环素和大环内酯类耐药，与普氏菌断奶后8天的丰度。此外，在断奶后3天，这些仔猪主要存在氨基糖苷抗性，这可能与大肠杆菌。然而，重要的是要提到，在Suriyaphol等人的研究中。[31用不同的抗菌剂对仔猪和母猪进行预防处理，分别在饲料中或肌内注射。然而，在他们的研究中没有发现AMU和AMR之间的联系。

类似于Mencía-Ares等人的研究[30.]， Chekabab等人的两项研究[32报道AMU的移除导致AMR患病率降低。例如，他们观察到，在没有AMU的情况下饲养的猪，其粪便样本中编码氨基糖苷类、大环内酯类、酚类和四环素类耐药的基因总体上有所减少。相比之下，Chekabab等。[33观察到具有多药耐药性的ARGs丰度下降，这似乎与抗叶酸盐和β-内酰胺的使用减少有关。然而，在无amu组中观察到对氨基糖苷的耐药性增加。有趣的是，两项研究都报告了病原体丰度的差异;而第一项研究发现致病性较高Bacillotacorrig。菲儿。11月(原:厚壁菌门)，后一项研究报告了非amu农场的总体病原体流行率下降[32，33]。

有趣的是，随机宏基因组学研究中测试最多的抗菌素之一(n= 8)为各种形式的四环素，如土霉素(n= 1)或ASP250(氯四环素[100 mg/kg]、磺胺乙嗪[100 mg/kg]和青霉素[50 mg/kg]的混合物):n= 3;土霉素混合:n= 1)。考虑到四环素是全球范围内养猪生产中最常用的抗菌剂之一，人们特别关注四环素对猪抗性组的影响也就不足为奇了[34]。研究四环素单独或与其他抗菌剂联合作用的宏基因组学研究经常观察到抵抗组的变化。例如，Munk等人的另一项研究。[35比较了丹麦低和高AMU的农场，观察到四环素的使用导致了丰富度的增加春节(44)。此外，他们报告大环内酯类药物的使用与嗯(B)和嗯(G)丰富。氨基糖苷的使用增加了氨基糖苷抗性基因的丰度apmA、ant (6)“我和str (B)以及四环素耐药基因春节(44)，这表明可能的共同选择春节(44)接受氨基糖苷治疗。相比之下，Ghanbari等人[36研究人员观察到，在7天的土霉素治疗后，ARG总体丰度增加，主要包括对四环素、β-内酰胺类和多药耐药的基因。此外，在停药14天后，土霉素对抵抗组的影响仍然明显。Mu等人也有类似的发现。[37]，他们在研究中使用16S rRNA基因扩增子测序方法和PICRUSt分析来研究抗菌治疗对仔猪早期生命的影响。仔猪从7日龄开始饲喂土霉素钙、kitasamycin(大环内酯类抗生素)和喹啉(quindoxin抗生素)的混合饲料。治疗与增加的丰度密切相关emrK和emrY增加四环素耐药性的多药耐药基因[37]。在两项考察ASP250对猪抗性组影响的独立研究中，观察到ARGs增加，使其对β-内酰胺、磺胺类药物和氨基糖苷类药物产生抗性[38，39]。此外，loft等人[38研究人员报道，在3周的ASP250治疗后，抵抗组发生了戏剧性的变化，ARG的多样性和丰度增加。在两项研究中均未观察到四环素耐药性与含有金四环素的ASP250治疗之间的关联。

Wang等人描述了磺胺类药物的使用与磺胺类药物耐药性之间的关系。[23]。在他们的研究中，比较了中国四个工业化养猪场的猪的粪便抗性组。虽然没有提供猪场AMU的详细报告，但在广泛使用磺胺类药物的三个集约单位中，在猪的粪便抵抗组中观察到对磺胺甲恶唑-甲氧苄啶的更高耐药性，而在唯一使用环丙沙星的另一个单位中，猪的ARGs丰度增加，导致对环丙沙星产生耐药性(qnrB，qnrS1，qnrS2)。然而，猪单位之间的差异不能仅仅用AMU来解释，这表明猪单位的AMR不仅与AMU有关，还受到内部生物安全协议、AMU记录和环境中AMR细菌持续存在等因素的影响[23]。其他相关因素可能包括:(1)ARGs和MRGs在MGEs上的共定位，允许AMU下多个耐药基因的共选择;(2)交叉耐药机制;(3)共调控机制，这将进一步允许AMR模式的共选择[j]。15]。有趣的是，Wang等人。[23在四个猪单位中观察到与AMU相关的多药耐药基因的高丰度，这可能允许共选择。然而，他们的研究没有调查MGEs或ARGs和MRGs的共同发生，这可能解释了研究中的观察结果。

另外，Zeineldin等人的一项基于宏基因组学的研究[40[研究了围产期给予新生猪单剂量抗菌注射图拉霉素(一种抑菌大环内酯)对猪抵抗组的影响。有趣的是，在仔猪治疗后20天内，没有观察到图拉霉素对猪抵抗组的影响。

3.3.2Quantitative-PCR-based研究

在使用qPCR的研究中也报道了AMU和AMR之间的关联。例如，Yue等人。[41采用液相色谱-三重四极杆质谱法(LC-MS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和原子荧光光谱法对来自62个猪场的107份猪粪便样品中的抗菌药物和重金属浓度进行了定量分析，并进一步描述了抗菌药物和重金属污染与AMR的相关性。根据他们的结果，使用四环素类、氟喹诺酮类和大环内酯类药物对猪的抵抗组没有影响。然而，磺胺类药物与磺胺类药物的抗性基因正相关，也与大环内酯类药物的抗性基因正相关ermX抗性基因，提示共定位ermX具有ARGs的MGEs对磺胺耐药性的研究。的门Pseudomonadotacorrig。菲儿。11月(原:变形菌门)，Bacillotacorrig。菲儿。11月(原:厚壁菌门),Actinomycetotacorrig。菲儿。11月(原:放线菌)被确定为这些arg和MGEs的潜在携带者，这与先前的研究一致，如Mencía-Ares等人的研究。[30.，41]。同样，Muurinen等人也描述了由于这些ARGs在MGEs上的共存而导致的多种ARGs治疗的变化。[42]。在他们的研究中，仔猪分别接受卡多克斯、氧化锌或硫酸铜(治疗水平)或蘑菇粉治疗33天，与未接受治疗的仔猪组相比，作者报告说，对照组和治疗组的ARGs和MGEs丰度几乎相同。然而，观察到不同处理之间存在一些差异。用卡瓦多克斯治疗的动物显示出增加的增值税(E)(对链状gramin A产生抗性)，但是减少了tetM，tetW，春节(32)，嗯(B),ermT。同样，波洛克等人的一项研究[43]，该研究采用宏基因组学方法，有三个采样点，并通过qPCR对5个靶向ARGs进行了定量分析(tetB，tetQ，ermA，ermB,dfrA1)，并在猪的整个生产周期中施用不同的抗菌剂、酸化水和锌，未发现氯四环素治疗与所研究的ARGs产生四环素抗性的丰度之间存在任何正相关。相反，他们观察到tetB但没有变化的丰度tetQ，与使用氯四环素有关。此外，在他们的研究中，泰洛菌素在整个生产周期内对这5种ARGs没有影响。作者认为，未能检测到AMU对AMR的影响可能是由于研究农场先前的高AMU导致ARG池已经饱和，这再次强调了农场外部AMR来源的重要性。

的变化ermB和tetWZeineldin等人研究了单剂量抗菌注射对新生猪的影响，并观察到ARG丰富度随着年龄的增长而增加，这与治疗无关[44]。与他们之前的研究相反[40，丰富的增加ermB和tetW观察到单剂量图拉霉素和普鲁卡因青霉素G对围产期过敏反应的反应，提示这些ARGs可能同时位于MGEs上[44]。单次给药头孢替福晶体游离酸和盐酸头孢替福不影响7种ARGs的水平(ermB，tetW，tetO，tetC，sul1，sul2,和bla_CTX-M)，在他们的研究中进行了分析。有趣的是，Zeineldin等人[44进一步证实了这些ARGs在新生仔猪中的存在。此外，他们的研究还观察到，图拉霉素处理的仔猪在15至20日龄期间死亡率增加，并且抗生素处理仔猪的病原体丰度增加。总之，迄今为止的研究表明，围产期抗菌素预防对猪微生物组和抵抗组的影响没有遵循明确的模式，并且可能产生适得其反的效果，正如这两项研究所证明的那样[40，44]。

Agga等人也描述了导致四环素耐药性的ARGs的变化。[45]。在他们的研究中，5周龄的仔猪在饲料中连续使用氯四环素、铜或两者的组合。根据他们的研究，tetA用治疗浓度的铜或氯四环素联合治疗或不联合治疗三周后，观察到猪体内的丰度。此外,tetA正相关bla_CMY-2表明在暴露于四环素时，具有β-内酰胺抗性的ARGs与具有四环素抗性的ARGs存在共同选择[45]。其他四环素联合治疗如ASP250也被报道与ARGs增加相关，从而导致β-内酰胺耐药。例如，Johnson等人的一项研究[46该研究使用聚类分析和基于qpcr的方法来描述美国一家研究机构与中国农场的猪的抗性组，观察到猪的抗性组增加bla_TEM，sul1,和aph ib(3”)这是对ASP250治疗的反应，该治疗是在美国研究机构进行的。与之前提到的研究类似，他们得出结论，这三个基因的共定位可能导致它们的丰度增加，以响应ASP250大肠杆菌作为他们的载体，这就解释了aph ib(3”)在没有选择压力的情况下[46]。

Xia等人在中国5个养猪单位进行的研究。[47的调查mcr-1通过在中国禁用粘菌素前后采集环境和粪便样本，观察到粘菌素的使用与细菌感染呈正相关mcr-1丰富。因此,mcr-1禁用粘菌素后患病率下降。此外,mcr-1与属强相关埃希氏杆菌属研究中的两个农场。持久性的mcr-1在一些农场禁用粘菌素后，可能是由于与其他ARGs的共选择或环境影响，这可以解释为什么Van Gompel等人没有观察到粘菌素给药与粘菌素抗性基因的相关性。[28]。此外，考虑到粘菌素耐药性在亚洲比欧洲普遍得多，正如Dadashi等人的综述所报道的那样。[48]，粘菌素耐药性与粘菌素使用的关联在欧洲研究中可能不太明显。

3.4猪中HMU与AMR流行的关系

3.4.1Metagenomics-based研究

与AMU和AMR之间的关联相比，迄今为止关于HMU和AMR的研究发表得少得多。本综述中仅发现两项研究使用宏基因组学方法研究重金属对猪抵抗组的影响。

其中一项研究是由Pieper等人进行的[49]，他研究了膳食和治疗中不同化学形式的锌浓度对猪抵抗组的影响。根据他们的发现，治疗性氧化锌浓度与aph ib(3”)它赋予对氨基糖苷类的抵抗力。此外，锌处理与增加bla_抢劫，帕特(A)，lnu (C),arnA分别对β-内酰胺类、卵磷脂、MLSP和多粘菌素产生抗性。此外，饲料中氧化锌和锌裂解物的浓度与cfxA2和erm (G)。这些发现提示ARGs与锌处理的共同选择。

波洛克等人的第二项研究[43]报道酸化水与锌(饲料中2500 PPM;(未指明是哪种形式)增加了ARGs的丰度，从而产生交叉抗性。这可能代表了另一种机制，可以解释与锌使用相关的抵抗组的观察变化。然而，考虑到它们的力量，需要更多基于宏基因组学的研究来进一步调查猪场HMU和AMR的关联。

3.4.2Quantitative-PCR-based研究

Muurinen等人报道了氧化锌和硫酸铜与AMR的关系。[42作为基于qpcr的研究的一部分。虽然未处理的仔猪和接受氧化锌或硫酸铜(治疗水平)治疗33天的仔猪的抵抗组组成相似，但接受氧化锌或硫酸铜治疗的仔猪的抵抗组组成增加tetM和增值税(E)。相比之下，Agga等人报道了四环素耐药基因与硫酸铜处理之间的关系。[45]，他们报告说，饲料中硫酸铜浓度高[125 mg/kg饲料]与tetP和tetB但是随着tetA和pcoD(赋予铜抗性)丰度，尽管尚不清楚为什么硫酸铜处理对四环素抗性基因的影响不同，并导致pcoD。

Zhao等人的研究[50通过对中国两个低amu猪场和一个高amu猪场的粪便样本进行分析，利用ICP-MS对给药饲料中的重金属浓度进行了量化，研究了它们对猪抗性组的影响。他们的研究观察到铜和砷的使用与ARG多样性的相关性，表明它们作为共选择剂的作用。对这些观测结果的一种潜在解释可能是ARGs与MRGs或MGEs的共存位置，例如在MGEs中看到的沙门氏菌基因组岛4 (SGI-4)。这种整合的共轭元素在养猪生产中已经被描述过，并且经常被报道沙门氏菌血清血清型4，[5]，12:i:-，常携带多药耐药模块，如r型ASSuT，编码氨苄西林、链霉素、磺胺类药物和四环素耐药[j]。51，52]。此外，血清型4,bbbb12:i:-是世界范围内沙门氏菌病最常见的病因之一，猪是被建议的主要媒介之一[53，54，55]。这再次强调了ARGs与MRGs相互关联对人类健康构成的风险，以及在养猪生产中AMR传播的潜在驱动因素。

3.5猪中抗菌素耐药性决定因素的已知驱动因素和机制

尽管大多数使用宏基因组学或qpcr方法的研究报告了AMU与HMU和AMR之间的关联，但观察结果是高度可变的。重金属或抗菌素处理对抵抗组变化的异质性的一种解释是微生物组组成对抵抗组的可能影响[37]。如前所述，Mencía-Ares等。[30.94%的指定ARG读数与120个不同的家庭有关。此外，本综述中包括的一些研究报告了ARGs与特定分类群之间的相关性[29，30.，41]。赵等。[50]报道，微生物组以及AMU和HMU解释了观察到的ARG模式差异的71.6%，这表明微生物组与抵抗组之间可能存在关联。Johnson等。[46]，对ARGs、MGEs进行共现网络分析，并在属水平上进行分类分析，结果相似。影响微生物组与抵抗组关系的一个重要因素是猪在治疗期间的年龄和抵抗组评估。正如Agga等人所讨论的。[45]，猪的年龄与观察到的微生物组组成和丰度相关tetA和tetB。这也可以解释为什么一些研究，如波洛克等人的研究。[43没有报道AMU对微生物组的影响，或者微生物组和抵抗组之间的联系。

有趣的是，Muurinen等人[42研究人员只在对照组中观察到微生物组和抵抗组之间的联系，而在治疗组中则没有。基于他们的研究结果，他们认为，ARGs在MGEs上的共同出现，加上治疗导致的AMR流动性增加，可能会使微生物组和抵抗组之间的关联脱钩。同样，Yue等人。[41观察到ARGs通过水平基因转移(HGT)传播增加，主要由intl1和ISCR1,和垂直基因转移(VGT)。相反，Zhao等。[50报道HGT对抵抗组几乎没有影响。Mencía-Ares，等。[30.[观察到集约化农场的MGEs丰度增加，但与粗放型农场相比，HGT事件没有差异，这与Muurinen等人提出的微生物组-抵抗组脱钩假说相反。]42]。综上所述，正如Munk等人所观察到的那样，抵抗组可能或多或少地由微生物组、HGT和VGT形成，以响应抗菌剂和重金属处理。27]和Pieper等人。[49]。然而，考虑哪些arg存在并共存于转移的MGEs上也是很重要的。因此，在重金属和抗菌剂存在和不存在的情况下，共选择可能在微生物组和抵抗组稳定性方面发挥重要作用。这是Johnson等人提出的。[46]，他观察到一些ARGs在堆肥过程中具有更高的稳定性。更稳定的抗菌剂，如磺胺或重金属可能在堆肥过程中持续存在，从而选择对其产生抗性的ARGs。因此，ARGs在MGEs上的共同定位可能允许ARGs对进一步的抗菌剂和重金属的持久性[46]。此外，arg的同址也可能是Muurinen等人[42在抗菌剂、重金属和替代治疗方面没有观察到重大差异。这突出了养猪场的抗微生物药物耐药性持续存在的问题，并可能表明从常见的农场做法中撤出抗菌剂和重金属可能不会导致抗微生物药物耐药性减少，因为使用消毒剂等其他做法可能会支持抗微生物药物耐药性的进一步持续存在[28]。

病毒组构成了另一个在文献中很少描述的因素，但可能影响抵抗体，或者更准确地说，影响噬菌体。例如，溶原性噬菌体通常会感染细菌，将它们的遗传物质整合到细菌的染色体中，然后进入休眠状态，直到宿主细菌受到压力。作为对宿主压力的反应，噬菌体切换到裂解周期，并迫使宿主繁殖和组装新的噬菌体，这包括从宿主染色体上切除原噬菌体进行包装。然后，宿主被裂解杀死[56]。在切除原噬菌体的过程中，细菌DNA如ARGs可被意外地纳入噬菌体衣壳，并通过转导转移到其他细菌中，从而促进AMR的传播[56]。本综述中包括的两项研究调查了转导对AMR传播的重要性，噬菌体相关抵抗组，以及卡多克斯和ASP250治疗对两者的影响。两项研究都观察到，大多数噬菌体被鉴定为病毒组的一部分，与该门有关Bacillotacorrig。菲儿。11月(原:厚壁菌门) [57，58]。尽管这两项研究都报道了针对病毒群的单个和多个ARG，但未观察到治疗后ARG扩散的增加。Johnson等。[58]报道了微生物质粒和噬菌体抗性组的重叠，这表明抗菌素耐药性可能通过转导传播。此外，Allen等人。[57观察到对ASP250治疗有更高的噬菌体丰度，但对卡多克斯没有反应。他们的研究表明，噬菌体和微生物组之间的关系可以通过杀死胜利者的假设来描述，该假设允许噬菌体-宿主的多样性和丰度在抗菌治疗下保持。目前关于噬菌体和病毒体及其在抗菌素耐药性中的作用的知识仍处于发展阶段，但现有证据表明，病毒体可能是我们了解抵抗体的重要环节。

在过去十年中，通过高通量方法(如qPCR和宏基因组学方法)对畜牧生产中抗菌素耐药性的调查有所增加。其原因是近年来成本的下降和下一代测序和qPCR方法的进一步发展，这使得样本量增加，并且可以对来自不同环境，人类和动物的各种样品进行更深入的分析[9，59]。DNA提取、测序、宏基因组数据的生物信息学分析和管理数据库等工具的发展也迅速发展，这进一步促进了这种高通量方法的使用[60]。

然而，尽管在短时间内取得了这些巨大的发展，这些高通量方法仍然面临许多限制，例如在DNA提取过程中物种的损失或样品的污染[61]。此外，通过qPCR或宏基因组学报道的ARG的存在并不意味着该基因一定表达[30.，62]。在比较本综述中所有研究时观察到的另一个限制是，在报告AMU和HMU、动物年龄、治疗、样本量或样本分析(包括宏基因组学管道和数据库)方面都没有金标准。因此，尽管大多数研究报告了AMU和HMU与AMR的关联，但尚不清楚不同的实验设置(包括观察性研究与随机研究)是否会影响所做的观察结果。正如赫斯特等人在一篇综述中所讨论的那样。[63]，动物试验的随机化可以减少检测偏差和研究结果的夸大。随机试验允许将干预与因果关系联系起来，但因此可以排除其他因素，如环境、内部农场协议程序和罕见的不良反应[64]。除此之外，随机试验可能面临伦理问题，如治疗剂的选择和治疗时间，以及安慰剂或对照组的选择，考虑到安慰剂或对照组可能被拒绝最佳治疗[65]。相反，观察性动物试验可以解释农场环境中的其他因素。然而，因果关系不能从这些研究中推断出来;只能探讨治疗和结果之间的联系，因此有偏倚的风险[64]。

另一个尚未解决的挑战是将ARGs和MRGs准确归属于特定的分类群。许多研究(n= 7)试图通过计算相关性来解决这个问题。Mencía-Ares，等。[30.另一方面，他们使用了一种不同的方法，即在分类上分配contigs，同时分析arg的相同contigs。虽然相关分析方法可以帮助确定潜在的ARGs载体类群，但其分辨率随着分类水平的降低而下降，并且容易导致计算量的增加[66]。因此，必须仔细解释这些结果。然而，这种方法的另一个优点是qPCR和16S rRNA基因扩增子测序可以很容易地结合，Xia等人进行了研究。[qh]47]，并且由于潜在的低丰度遗传元素检测，可能允许更准确地确定分类群、MGEs和ARGs之间的相关性[9，67]。当使用宏基因组学方法时，可以省略这些元素。然而，这两种方法都受限于目前可用的知识。因此，虽然qPCR方法仅限于特定的靶点，但宏基因组学的结果是有限的，并且可能根据所使用的数据库而变化。宏基因组学的新方法，如染色体外组态的分配[68]、HGT事件的识别[69]，以及元基因组组装基因组的构建[70似乎有希望对抗菌素耐药性的传播和发展进行更深入、更准确的分析。然而，这些方法仍处于早期阶段。

有必要对未来的抵抗组研究进行标准化，以便产生准确、精确和可比较的结果。此外，研究应进一步调查AMR与微生物组、病毒组和MGEs之间的潜在关联，以更深入地了解AMR在初级生产部门的发展和传播。

由于可能对动物、人类和环境健康产生影响，动物生产中的抗菌素耐药性受到全世界的高度关注。在养猪场，抗菌剂和重金属通常用于治疗或预防疾病。然而，针对抗菌素耐药性传播和发展的国家和国际行动计划，如在欧洲看到的，基于抗菌素耐药性和HMU与抗菌素耐药性之间可能存在的关联，禁止和/或限制在养猪场使用抗菌素和重金属。在本系统的文献综述中，明确的证据表明AMR与AMU和HMU呈正相关。此外，本文献综述强调了非培养方法在抗菌素耐药性研究中的有用性。虽然抗菌素或重金属治疗并不总是导致抗菌素耐药性的发展，但28项研究中的大多数都观察到与治疗相关的抗菌素耐药性的增加。观察到结果异质性的原因包括AMR的复杂性，在某些情况下可能与微生物组、病毒组或MGEs更相关(图2)3.)。

影响抗菌素耐药性的这三组因素之间的相互作用可能导致对抗菌素和抗菌素的不同观察结果。此外，这些因素还受到宿主遗传和年龄、环境微生物组(这又受到清洁和生物安全的影响)、饲料、水以及所使用的抗菌化合物或重金属的种类等方面的进一步影响。由于这种复杂性，将农场或养猪生产设施相互比较，以找到对抗抗菌素耐药性的共同解决方案，是极具挑战性的。因此，每个农场或养猪生产设施都需要自己的一套措施，通过减少AMU和HMU来解决AMR的传播和发展，同时保持动物的健康和福利。未来的研究应包括对生产周期中不同要素的微生物组、宿主病毒组和MGEs的分析，并尝试将观察结果与环境和宿主衍生因素结合起来，以更深入地了解AMR关键因素之间的相互作用。此外，通过宏基因组学等方法进行分析的标准化方案可能有助于在未来实现更好的研究可比性。

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。

本研究由Teagasc Walsh奖学金计划(参考2018027)资助。西班牙教育部根据“比阿特丽斯·加林多”方案(BEAGAL-18-106)授予阿格尔·阿格罗博士学位。

作者及单位

1. 爱尔兰都柏林，Ashtown, Teagasc食品研究中心，食品安全处

   丹尼尔·埃克拉斯和凯瑟琳·m·伯吉斯

2. 都柏林大学兽医学院，爱尔兰都柏林

   Daniel Ekhlas, Finola C. Leonard和Edgar G. Manzanilla

3. 西班牙León大学兽医学院动物卫生系，León

   赫克托耳却

4. 爱尔兰，科克郡，费尔莫伊，Teagasc Moorepark，养猪部

   埃德加·g·曼萨尼拉

贡献

DE进行文献检索，总结发现，撰写稿件。所有作者都对文献检索的研究问题和检索术语的定义做出了贡献，并对手稿的修改和编辑做出了贡献。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到凯瑟琳·m·伯吉斯。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

执行编辑:马塞洛·戈特沙尔克

出版商的注意

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