o抗原长度决定因素的作用wzz的免疫原性沙门氏菌沙门氏菌感染的大肠杆菌O2 - o -多糖递送

减毒沙门氏菌鼠伤寒是一种很有前途的抗原递送系统，用于活疫苗如多糖。多糖的长度是调节糖缀合物诱导的免疫反应的一个众所周知的关键因素。然而，脂多糖(LPS) o -抗原(OAg)的长度与免疫原性之间的关系年代．鼠伤寒仍不清楚。在本研究中，我们评估了OAg长度的影响wzz_圣在沙门氏菌通过比较菌落、细胞膜通透性、抗菌活性和免疫原性年代．野生型鼠伤寒杆菌ATCC14028菌株对那些具有不同OAg长度的Δwzz_圣突变体和Δwzz_圣：：wzz_ECO2．对OAg长度分布的分析表明，除了很长的OAg外，2-7个重复单元(RUs)的短OAg长度均来自Δwzz_圣突变体，13-21 RUs的中间OAg长度从Δ获得wzz_圣：：wzz_ECO2从野生型中获得了超过20个RUs的长OAg长度。此外，我们发现OAg长度也有影响沙门氏菌定植，细胞渗透性和抗生素耐药性。小鼠免疫显示，OAg长度通过改变wzz_圣对血清杀菌能力、补体沉积和体液免疫反应有影响。年代．鼠伤寒突变株Δwzz_圣：：wzz_ECO2具有良好的免疫原性，是给药的最佳选择大肠杆菌O2 O-polysaccharides。此外，衰减应变ATCC14028 Δ自闭症谱系障碍Δc反应蛋白Δ自保”ΔrfbPΔwzz_圣：：wzz_ECO2交付大肠杆菌O2 OAg基因簇优于ATCC14028 Δ自闭症谱系障碍Δc反应蛋白Δ自保”ΔrfbP在鸡的IgG诱导、细胞因子表达和免疫保护方面。这项研究揭示了OAg长度在沙门氏菌这些特征可能在优化多糖疫苗的功效方面有潜在的应用。

抗菌素耐药性是一场巨大的全球卫生危机，也是当今最严重的公共卫生问题之一[1]。沙门氏菌在2020年COVID-19大流行期间，美国与后院家禽有关的疫情有所增加[2]。禽致病性大肠杆菌(APEC) O2，主要的肠外致病性血清群大肠杆菌由于耐多药，在家禽中引起严重的全身性传染病大肠杆菌能在鸡的呼吸菌群中生存，形成对正常细菌的竞争排斥[3.]。因此，家禽养殖场仍然需要对沙门氏菌病和大肠杆菌病进行免疫接种。

由于外膜的外叶主要由LPS组成，因此表面多糖是疫苗开发的有希望的目标[4]。LPS通常由三种成分组成:脂质A、核心低聚糖和o抗原。基于LPS OAg的许多生物学特性，LPS OAg片段已被确定为针对几种病原体的保护性免疫的重要靶点，包括:(a)它是大多数革兰氏阴性细菌外膜生理完整性和功能所必需的，其作为渗透性屏障并对结构完整性有重要贡献;(b)它是一种初级表面抗原，是宿主免疫系统最有效的刺激物之一，在细菌病原体-宿主相互作用中起关键作用;(c) OAg特异性抗体提供病原体保护，并有助于补体和杀菌肽抗性。在过去的几十年里，一些研究集中于改变LPS的结构，作为开发减毒活疫苗的一种技术[5]。

OAg长度是通过改变外膜抗原的免疫原性而影响免疫应答的一个众所周知的因素。因此，改变OAg长度已被用于克服t非依赖性免疫反应[6]。然而，OAg长度对多糖疫苗免疫原性的影响仍存在争议。在某些情况下，低分子质量OAg片段在小鼠体内诱导的抗体水平明显高于全长OAg。例如,志贺氏杆菌sonnei低分子质量OAg片段偶联物在小鼠体内产生的抗体水平明显高于全长OAg (29 RUs) [7]。含3rus的OAg合成序列弗氏志贺菌血清型2a结合破伤风类毒素(TT)增强小鼠免疫原性和保护作用。小鼠和家兔抗lps抗体滴度随OAg长度的增加而增加年代．沙门氏菌感染。与天然OAg的糖缀合物比较小的缀合物提供更好的保护[8]。此外，根据最近的一项研究，OAg长度不是膜抗原(GMMA)免疫反应广义模块的关键参数[9]。虽然OAg长度无疑会影响多糖(PS)疫苗的免疫原性，但减毒后的最佳长度沙门氏菌口服OAg的载体尚未确定。

多糖共聚合酶(PCP) Wzz家族在OAg延伸过程中起着重要的枢纽作用，调节重复单元聚合的程度(即OAg的大小)[10]。Wzz蛋白的模型长度范围很广，从4到100个RUs [11]。例如，有三个OAg长度沙门氏菌短(S-OAg， < 15 RUs)，长(L-OAg, 16 ~ 35 RUs)，超长(VL-OAg，约100 RUs)wzz_圣控制下模态长度模式和fepE控制高分子量(HMW) LPS模态长度(> 100 RUs) [12]。在大肠杆菌而OAg长度分为短(7-16 RUs)、中间(10-18 RUs)和长(16-25 RUs) [13]。在之前的研究中，我们发现野生型的OAg长度大肠杆菌O2和年代．鼠伤寒菌在SDS-PAGE银染色中的差异[14]。当O2 OAg在年代．鼠伤寒杆菌的OAg长度受年代．沙门氏菌感染Wzz_圣导致OAg长度与野生型不同大肠杆菌O2。虽然它参与了年代．鼠伤寒的发病机制、作用fepE在免疫反应中仍不清楚[15，16]。因此，我们想改变wzz_圣探讨OAg长度对两种抗原免疫原性的影响Salmonell载体和交付的OAg存在fepE．

本研究旨在探讨不同的OAg长度如何影响年代．鼠伤寒杆菌的免疫原性和宿主防御抗性，以及在异源多糖传递中的应用前景。

细菌菌株，质粒和生长条件

本研究使用的菌株和质粒列于表中1．菌株在Luria-Bertani肉汤或琼脂板(Sangon Biotech (Shanghai) Co.， Ltd)中在37°C下生长。二氨基苯甲酸(DAP)(50µg/mL) (Sigma-Aldrich)加入Δ自闭症谱系障碍突变株在没有质粒互补的情况下生长。在等位基因交换实验中，采用含有5%蔗糖的LB琼脂sacB基于基因的反选择[17]。选用氯霉素(25µg/mL)(上海三工生物科技有限公司)筛选突变株进行构建。

自杀病媒和突变株的产生

本研究使用的引物如表所示2．DNA操作如前所述进行[18]。的wzz，c反应蛋白，自保”，rfbP,自闭症谱系障碍基因被破坏年代．鼠伤寒与以sacb为基础的自杀质粒进行等位基因交换。如前所述，结合通过等位基因交换完成。对于插入突变，Δwzz_圣然后将突变株插入异源wzz基因大肠杆菌O2。的CDS序列wzz_ECO2被融合在了上游和下游年代．沙门氏菌感染wzz_圣使用引物对wzz_ECO2- f /wzz_ECO2-R，与一个相邻片段和质粒pRE112的同源序列设计。采用与缺失突变体相同的方法成功地选择了Δwzz_圣：：wzz_ECO2替换突变，包括菌落PCR，测序和银染色。

LPS分析

异源效应wzz利用SDS-PAGE和Western blotting对OAg长度进行鉴定。LPS样品的制备、分离和可视化方法与前面描述的相同[19]。将提取的LPS样品转移到PVDF膜上，用沙门氏菌O4或抗血清大肠杆菌O2(天津生物芯片公司，天津，中国)在1:1000稀释鉴定生物合成年代．沙门氏菌感染和大肠杆菌O2 OAg链。

补体抗性试验

ATCC14028、ST03、ST04的血清补体耐药随时间的变化而变化wzz如前所述[13，20.]。简单地说，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.0)和50 μL细菌悬浮液(10 μL)洗涤中对数相细菌两次⁴CFU/mL)与等量20%正常兔血清(NRS)(实验组)或热灭活兔血清(HIRS)(阴性对照组)混合，37℃孵育60 min, PBS孵育相同细菌作为空白对照。每个处理产生的菌落形成单位(CFU)通过连续稀释，在LB琼脂培养基上，在37°C孵育过夜，直到菌落可以计数。这些菌株已经测试了三次。通过比较实验组和阴性对照组存活的菌落数来计算存活率。野生型菌株与野生型菌株之间的统计差异wzz_圣用Graphpad Prism对突变株进行t检验。

MIC和抗生素敏感性测试

多粘菌素B和胆盐脱氧胆酸盐(DOC) (Sigma-Aldrich)对ATCC14028、ST03和ST04的最低抑制浓度(MIC)按先前描述的方法测定[21]。与96孔板一起，将DOC (0.39-50 mg/mL)和多粘菌素B(0.078-10µg/mL)进行2倍连续稀释。细菌在LB中生长至1OD₆₀₀0.8，收获，用PBS洗涤两次，用PBS稀释至1.0 × 10⁵CFU /毫升。然后，每孔加入100 μL稀释菌悬液，其中含有等量不同浓度的抗菌物质，37℃孵育过夜。阴性对照采用单一多粘菌素B/DOC组或细菌组。利用SYNERGY测定每种培养物的光密度^H1微孔板读取仪(BioTek Instrument, Winooski, VT, USA)。抑制阈值为0.1 atOD₆₀₀．实际滴度是通过将培养稀释液涂在LB板上，然后在37°C下孵育过夜来确定的。这个试验重复了三次。

采用抗生素盘(杭州微生物摄制有限公司)检测对磺胺甲恶唑(STX)、氨苄西林(Amp)、氯霉素(Cm)、诺氟沙星(NOR)、青霉素(P)、四环素(TE)的敏感性。

小鼠定植

6周龄BALB/c雌性小鼠购自中国浙江杭州医学院。有三组小鼠用于检测定植。每组6只小鼠口服20 μL(明胶缓冲生理盐水)BSG，体积为1 × 10⁹分别为ATCC14028、ST03、ST04的CFU。感染后第6天和第9天，每组取3只小鼠的Peyer贴片、脾脏和肝脏标本。为了确定活菌，将样品匀浆，稀释，并镀在XTL4, MacConkey和LB琼脂上。

细胞膜渗透性

细菌在LB肉汤中培养过夜，不摇晃。将1 mL培养物稀释于19 mL新鲜LB肉汤中，在37℃下搅拌培养至600 nm处光密度达到1.8。室温离心取10 mL细胞，室温用50 mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗涤2次。稀释20倍后，将细胞重悬于0.5 mL相同的缓冲液中，测定光密度。细胞总数为0.4OD₆₀₀将单位加入相同的磷酸钾缓冲液(终体积，2ml)。在混合物中加入终浓度为6 μM的溴化乙锭后。室温下，用激发波长为545 nm、发射波长为600 nm的荧光光谱仪测量乙锭-核酸复合物的荧光[22]。每70秒读取一次数值，持续30分钟，重复测试三次。ATCC14028细胞悬浮于50mm磷酸钾缓冲液中，不含溴化乙啶作为空白对照。阳性对照为75%乙醇作用1 h的ATCC14028细胞。

小鼠免疫保护评价

确定的效果wzz突变株沙门氏菌免疫原性,wzz_圣⁺和wzz_圣突变株通过删除c反应蛋白和自保”基因来自基因组，如Δ自保”Δc反应蛋白突变菌株是一种很有前途的菌株沙门氏菌口服疫苗抗原载体[23]。用银染色和Western blotting分析各减毒菌株的LPS谱。

雌性ICR小鼠(4 - 6周龄)来自中国浙江杭州医学院。将ICR小鼠随机分为4组(每组10只)，每组口服约1 × 10的BSG 20 μL⁹仅为ST05、ST06、ST07和BSG的CFU。14天后用相同剂量进行第二次免疫。每组5只小鼠在加强免疫后7天进行眶后穿刺采血。每组灌胃5 × 10次⁷ATCC14028的CFU(~ 100倍的LD)₅₀)加强注射后14天。

如前所述，使用定量酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清抗体浓度[14]。年代．提取鼠伤寒杆菌LPS，按先前描述的浓度1µg/mL包被在微滴板上[24]。在4℃下孵育过夜，然后用含有5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室温下封闭2小时。然后，在lps包被的孔中，取100 μL 1:100稀释的血清，分三次涂于每个孔中。依次加入山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a和IgA (Abcam, Shanghai, China)p-硝基苯磷酸底物(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)。使用SYNERGY在405 nm处记录颜色显影^H1微孔板读取仪(BioTek Instrument, Winooski, VT, USA)。

血清杀菌活性(SBA)和补体沉积检测

小鼠血清样品在56°C下灭活30分钟，收集中期细菌进行10倍连续稀释。血清样品从1:25连续稀释至1:100。然后，10µL稀释后的细菌(10⁴CFU/mL)与50µL灭活血清、25µL兔补体(Cedarlane)和15µL PBS混合，在37℃下孵育1 h。阳性对照为细菌与兔补体与灭活兔抗血清的混合物沙门氏菌O4(天津生物芯片公司，中国天津)空白对照为PBS缓冲液中的细菌，阴性对照为细菌与补体的混合。然后将混合物连续稀释10倍，铺在LB琼脂板上。将活菌数与空白对照比较，计算细菌计数和存活率，采用Graphpad Prism进行t检验进行统计学分析。

用灭活血清检测补体沉积能力。1 mL中对数期细菌培养液洗涤后用PBS重悬。之后，将50µL细菌样品离心，并在100µL 10%补体灭活血清中重悬，37°C孵育30 min。然后将样品洗涤，重悬，并在含有30µL兔补体的PBS中于37°C孵育30分钟。再次PBS洗涤后，用100µL fitc偶联的山羊抗兔补体C3(1:20 00稀释，MP Biomedicals)在黑暗的冰上染色30分钟，在2%甲醛中重悬，并通过流式细胞术(BD FACSVerse™)进行分析。阴性对照为野生型年代．鼠伤寒与未接种补体灭活的小鼠血清孵育。

小鼠脾CD4细胞刺激及细胞因子检测⁺T细胞

单细胞脾脏的制备方法如前所述[25]。增强免疫7天后，用年代．Typhimurium LPS (50 ng/µL)， 37°C, 5% CO作用8 h₂在存在蛋白质转运抑制剂混合物的情况下(赛默飞世尔)。CD4细胞因子表达⁺T细胞检测采用大鼠抗小鼠CD3-Alexa Fluor 700、CD4-FITC、IFNγ-APC/Cy7和IL-4-Alexa Fluor 647 (eBioscience)。从同一只小鼠的抗原刺激值中减去未刺激样品中细胞因子阳性细胞的比例，计算抗原特异性细胞的百分比。

生物合成大肠杆菌O2 OAg被衰减沙门氏菌鸡的免疫保护

确定是否衰减沙门氏菌St09 (atcc14028 Δwzz_圣：：wzz_ECO2Δ自闭症谱系障碍Δc反应蛋白Δ自保”ΔrfbP)， OAg长度中等(13-21 RUs)，是较好的选择大肠杆菌O2交付比ST08 (ATCC14028 Δ自闭症谱系障碍Δc反应蛋白Δ自保”ΔrfbP)，具有较长的OAg长度(原生RUs)，大肠杆菌O2 OAg在衰减条件下进行生物合成年代．对ST08和ST09鼠伤寒杆菌进行免疫保护实验。

1日龄萧山鸡购自杭州萧山东海养殖有限公司。散养7天后，将鸡随机分为4组。各组在7日龄进行初免疫，再加1 × 10次免疫⁸14日龄时CFU/100µL灌胃。第二次免疫10 d后，每组5只鸡采集血清。其余鸡用1 × 10攻毒⁹连续2周每天记录APEC O2毒株注射CFU及病死率。免疫反应以与先前描述的相同方式测量[26]。从颈静脉中收集免疫血清，按1:100至1:80的比例稀释。用羊抗鸡IgY (Abcam, Shanghai, China)检测lps特异性抗体。ELISA效价是指OD值最高的血清稀释度₄₀₅值超过阴性对照的2.1倍。此外，在饲养期间，每周称重1次。

鸡脾脏经典细胞因子mRNA水平的变化

选择IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ四个基因进行qPCR分析，以确定与免疫应答相关的mRNA水平。在APEC O2刺激后7天取脾。用FastPure细胞/组织总RNA分离试剂盒(Vazyme)提取后，将总RNA溶解于Tris-EDTA (pH 7.5)缓冲液中。使用SYNERGY测定RNA的浓度^H1微孔板阅读器(BioTek仪器)。利用Hiscript III逆转录酶(Vazyme)从1µg总RNA中生成cDNA。使用Hiscript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR (Vazyme)检测IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ以及管家β-actin的mRNA转录本。靶基因转录本归一化为内务基因β-肌动蛋白。相对表达式采用2的比较法计算^−ΔΔCt，其中ΔCt = Ct(靶基因)-Ct(管家基因)，ΔΔCt = ΔCt(测试样本)- ΔCt(参考样本)。

鸡肝脏和脾脏的组织病理学和免疫组织化学染色

在APEC O2野生型菌株DE17攻毒7 d后，随机选取各组存活鸡进行组织病理学和免疫组化染色。收集肝脏和脾脏，在4%的福尔马林缓冲液中固定24-48 h，然后用苏木精和伊红(HE)染色。bsg免疫组的组织样本作为阴性对照。

对福尔马林固定和石蜡包埋的4 μm组织切片进行免疫组化处理。肝、脾组织切片进行免疫染色，观察其表达和分布大肠杆菌O2抗原。一抗为兔多克隆抗大肠杆菌O2(天津生物芯片公司，天津，中国)(1:100稀释)，二抗为酶标山羊抗兔(Servicebio)(1:200稀释)。然后用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)观察免疫反应性。用苏木精反染细胞核，用徕卡显微系统在200倍和400倍倍率下拍照。使用image -pro plus 6.0进行图像分析。

统计分析

使用GraphPad Prism 5软件(Graph software, San Diego, CA, USA)对数据进行分析，并以均数±SD表示。两组间比较采用双样本t检验，多组比较采用方差分析。P< 0.05认为有统计学意义。

突变株的构建与鉴定

为了获得年代．具有不同OAg长度的鼠伤寒杆菌wzz_圣首先通过同源重组从ATCC14028中删除，得到Δwzz_圣突变株即ST03，则wzz_ECO2被引物扩增wzz_ECO2-F/R，克隆并插入pRE112自杀质粒。经过共轭转移后，含有异源的生物体wzz_ECO2筛选并测序。如果插入的序列与wzz从大肠杆菌O2，基因替代突变体Δwzz_圣：：wzz_ECO2成功建造并命名为ST04。银染SDS-PAGE(图1A)和Western blotting(图1B)进一步检测每个菌株的LPS谱。根据OAg长度分类方法对LPS的OAg长度进行分类沙门氏菌和大肠杆菌［13]。ST03 (lane 1)显示一个2-7 RUs的LPS阶梯，属于OAg长度较短的组(< 15 RUs)。ST04(车道2)，显示13-21个RUs的LPS阶梯，被分配到中间OAg长度组(15-20个RUs)。野生型ATCC14028 (lane 3)的LPS阶梯相似，有16-35个RUs，被分配到长OAg组(20-35个RUs)。

上述ST03、ST04和ATCC14028株通过删除进一步减毒c反应蛋白和自保”从基因组中，产生ATCC14028Δwzz_圣Δ自保”Δc反应蛋白， atcc14028 Δwzz_圣：：wzz_ECO2Δ自保”Δc反应蛋白，以及ATCC14028Δ自保”Δc反应蛋白．经PCR检测和Sanger测序，将弱毒株分别命名为ST06、ST07和ST05。通过银染色进一步证实了减毒菌株的LPS谱(图2)1C)和Western blotting(图1D)。剖面显示，衰减后细菌OAg长度不受影响(图2)1A和C)。结果表明，OAg长度与c反应蛋白和自保”衰减。

交付大肠杆菌O2 OAg多糖，基于平衡致死宿主载体系统自闭症谱系障碍进一步构建了编码二氨基戊酸(DAP)的异源质粒pSL2162，确保了其在无抗生素压力的细菌宿主中的稳定性。的rfbP基因编码udp -磷酸半乳糖磷酸转移酶，该酶负责将半乳糖转移到Undpp，rfbP缺失导致OAg蛋白缺失沙门氏菌有限合伙人。因此,自闭症谱系障碍和rfbP进一步从ST05和ST07菌株中删除基因，得到ST08 (ATCC14028Δ)自保”Δc反应蛋白Δ自闭症谱系障碍ΔrfbP)和ST09 (ATCC14028 Δwzz_圣：：wzz_ECO2Δ自保”Δc反应蛋白Δ自闭症谱系障碍ΔrfbP）.

然后大肠杆菌将pSL2162携带的O2 OAg电转化到ST08和ST09中，得到重组菌株O2-ST08和O2-ST09。不同OAg长度(9和10车道)的O2-ST08和O2-ST09也通过银染色和Western blotting检测LPS谱(图2)1E, F)。根据结果，异源表达的长度大肠杆菌O2 OAg长度由Wzz决定。O2-ST09有13-21个RUs, O2-ST08有16-35个RUs，用来评价OAg长度对保护效果的影响大肠杆菌鸡体内的氧气。

OAg长度对年代．鼠伤寒杆菌在小鼠体内的定植、细胞膜通透性、抗生素耐药性和补体耐药性

LPS是促进小鼠感染的重要毒力因子。因此，我们评估了OAg长度对BALB/c小鼠细菌定植能力的影响，发现感染后6至9天细菌总负荷增加(dpi)。在肠细胞中定植(图2)2A)，在6 dpi时无统计学差异，而ST04组的定殖量低于WT菌株ATCC14028 (P< 0.05)且在9 dpi时高于ST03 (P< 0.01)。与9 dpi时相比，ST03组减弱了一个数量级以上。由此可见，细菌在肠道内的定殖能力由高到低依次为ATCC14028、ST04和ST03。在脾脏中也观察到同样的趋势(图2)2B)和肝脏(图2C)定植，除了9 dpi的数据显示ST04超过ATCC14028，因为WT组中有两只小鼠由于高细菌负荷(LD)而死亡₅₀= 5 × 10⁵CFU)。总体而言，结果表明OAg长度影响细菌在小鼠体内的定植能力。

脂多糖，外膜的主要成分，也起到渗透性屏障的作用。探讨OAg长度对年代．用溴化乙锭作为鼠伤寒菌外膜双分子层通透性的荧光探针。膜透性试验表明，不含溴化乙啶的ATCC14028空白对照的荧光值最低，PC对照(乙醇处理菌株)的荧光值最高，说明试验结果是有效的。3株检测菌株的荧光值从高到低依次为ATCC14028、ST04和ST03。ATCC14028的荧光值是ST03的2倍以上(图2)2D)，表明OAg长度确实影响细胞膜通透性[27]。

由于细胞渗透性影响抗生素耐药性，我们还测量了抗生素对SXT、Amp、Cm、NOR、P和TE的敏感性(图2)2E). SXT试验菌株直径由高到低依次为ST03、ST04和ATCC14028。ST04比ATCC14028 (P< 0.05)。在Amp、Cm、NOR、P和TE的灵敏度检测中也出现了同样的趋势。虽然检测到的三种菌株都符合抗生素敏感性和耐药性的鉴定标准，但数据表明，OAg长度修饰会影响细菌的抗生素耐药性。

此外，还测定了阴离子表面活性剂DOC和阳离子抗菌肽多粘菌素B的MIC。我们发现野生型ATCC14028对多粘菌素B的MIC值为1.25µg/mL，而ST03和ST04的MIC值为0.625µg/mL，它们对多粘菌素B的敏感性高于野生型ATCC14028wzz_圣对于多粘菌素b的敏感性，ST04的MIC值为50 mg/mL，高于ATCC14028和ST03的MIC值25µg/mL(表1)3.）.

脂多糖OAg链的长度被认为决定补体耐药性[12]。因此，补体的敏感性wzz将突变体与WT进行比较。发现ATCC14028对补体介导的杀伤具有高度抗性(孵育1小时后存活率为100%)。ST03的杀伤敏感性比WT低约两倍，而ST04在两者之间表现出一种补体抗性3.）.

以上结果表明，LPS OAg长度影响细菌定植、细胞通透性、抗生素耐药性和补体耐药性年代．沙门氏菌感染。

OAg长度对小鼠体液免疫应答的影响

免疫保护作用沙门氏菌首先在小鼠模型中对改良的传递载体进行了评价。采集小鼠血清样本后，年代．在lps包被板上采用ELISA法检测鼠伤寒杆菌lps特异性IgG和IgA抗体。与BSG对照组相比，各菌株的生成量均显著增加年代．鼠伤寒杆菌lps特异性IgG(图3.A)，与ST07 (ATCC14028Δwzz_圣：：wzz_ECO2Δc反应蛋白Δ自保”)，明显高于ST06 (ATCC14028Δ)wzz_圣Δc反应蛋白Δ自保”)，与ST05相比略有增加(ATCC14028Δc反应蛋白Δ自保”)接种组。IgA中也观察到类似的趋势(图2)3.B)， IgG1(图3.C)和IgG2a(图3.D)水平检测。与此同时，所有免疫组均能显著提高小鼠的IgG2a特异性水平年代．与IgG1相比，在各组中观察到鼠伤寒杆菌LPS，表明主要是th1型反应。

同时检测血清杀菌活性，评价体液免疫反应。结果表明，随着血清浓度的稀释，存活菌的百分比增加。用1:25稀释的血清孵育后，ST07组的存活率最低，甚至低于阳性对照(兔血清)沙门氏菌O4) (P< 0.05)。与1:50稀释的血清孵育时，st07免疫组的存活细菌数量显著低于ST05、ST06和BSG组(P< 0.05)。与1:100稀释的血清孵育时，ST07组的存活率与ST06组相当(P> 0.05)(图3.E).结果表明，ST07组诱导的抗体具有强大的细菌杀伤能力。

如果细菌的杀伤是抗体依赖的，抗原和抗体复合物会沉积补体。用流式细胞术检测补体沉积效率。当与ST07免疫小鼠血清孵育时(ATCC14028Δc反应蛋白Δ自保”Δwzz_圣：：wzz_ECO2)(蓝线)，C3在表面的沉积年代．鼠伤寒杆菌含量高于ST06 (ATCC14028Δ)c反应蛋白Δ自保”Δwzz_圣)(紫色线)免疫组，甚至超过阳性对照ST05组(ATCC14028Δ)c反应蛋白Δ自保”)(绿黄线)(图3.F).结果表明，细菌OAg长度与抗体水平、细菌杀灭功能活性以及血清补体沉积效果有关。

对小鼠的保护作用

为了观察是否保护性免疫是由于OAg长度依赖的血清活性，我们用5 × 10刺激小鼠⁷Cfu(~ 100岁₅₀)年代．鼠伤寒加强剂后2周。所有免疫组均提供100%的保护，显著高于bsg处理组(P< 0.05)。这可能是由于外膜免疫原而非修饰的LPS在引发免疫保护方面发挥了功能性作用年代．沙门氏菌感染。先前一项类似的研究表明，与LPS合成有关的基因缺失引起的外膜囊泡(OMV)也能诱导良好的抗年代．鼠伤寒是一种合理的解释28]。

lps特异性CD4⁺小鼠的t细胞免疫反应

免疫后还检测了这些菌株的t细胞免疫反应。选择IFN-γ来反映Th1免疫应答，而IL-4是一种指示Th2免疫应答的细胞因子。流式细胞术检测lps特异性CD4⁺OAg长度变异菌株体外刺激脾细胞后产生的t细胞反应年代．培养的有限合伙人。结果表明，ST07 (Δc反应蛋白Δ自保”Δwzz_圣：：wzz_ECO2)诱导了与ST05相似的IFN-γ水平(Δc反应蛋白Δ自保”)及ST06 (Δc反应蛋白Δ自保”Δwzz_圣)(图4A)， IL-4水平高于ST06和ST05，但差异无统计学意义(图2)4B). IL-4细胞因子水平高于IFN-γ，表明th2型细胞因子在应答中起主导作用年代．鼠伤寒杆菌感染宿主免疫系统。

重组O2-的免疫保护作用评价沙门氏菌在鸡身上

来确定是否Δwzz_圣：：wzz_ECO2突变体在传递异源异体时有优越的免疫潜力大肠杆菌将质粒pSL2162携带的APEC O2 o -多糖基因簇转化为ST09 (ATCC14028 Δ)wzz_圣：：wzz_ECO2Δc反应蛋白Δ自保”ΔrfbPΔ自闭症谱系障碍)，产生重组菌株O2-ST09。在鸡身上评价其保护效果，并与O2-ST08 (ATCC14028Δ)进行比较自闭症谱系障碍Δc反应蛋白Δ自保”ΔrfbP）.由于体液免疫是评价APEC疫苗保护作用的重要指标，我们在二次免疫7天后用ELISA检测血清中APEC O2 LPS特异性IgY。o_2 - st09免疫组血清IgG抗体水平为1:400，略高于o_2 -ST08免疫组，显著高于BSG和ST08对照组(图2)5A)。结果表明，用含有13-21 RU的O2- st09菌株免疫后，可引起针对O2 LPS的特异性免疫应答(图2)5一个)。

用APEC O2野生型菌株DE17攻毒后，每天记录15 d的死亡率。O2-ST09、O2-ST08和ST08免疫鸡的成活率分别为80.00%、53.33%和26.67%(图2)5B)。此外，O2-ST09免疫组与O2-ST08免疫组和对照组的增重保持平均水平(表2)4）.

研究结果表明大肠杆菌合成O2 OAg年代．含有13-21 RU的鼠伤寒杆菌可以帮助触发更好的免疫保护大肠杆菌氧气提供了更好的预防方法大肠杆菌O2感染。

鸡细胞因子mRNA水平的变化

qPCR检测数据显示，O2-ST09免疫组IL-4、IL-2和IL-10 mRNA水平高于O2-ST08免疫组和BSG对照组(P< 0.01)。两组间IFN-γ激发无显著差异(图2)5C). IL-2和IL-4的升高提示CD4的活化⁺促进T细胞和Th2细胞的分化。IL-10分泌增强可能与促进Th2分化有关。

鸡肝、脾组织病理学分析及免疫组化染色

比较野生型菌株DE17攻毒后免疫组(BSG、ST08、O2-ST08和O2-ST09)鸡的组织病理学病变。BSG对照组出现肝充血、炎症细胞浸润、脾充血、免疫细胞紊乱，见图6．接种ST08疫苗的鸡表现出退化和充血的迹象。O2-ST08组肝脏组织紊乱，充血。O2-ST09组大鼠肝细胞轻度变性、充血。接种O2-ST09、O2-ST08和ST08组小鼠脾脏未见明显临床疾病症状。此外，BSG和ST08对照组临床表现为典型的心包炎和脾脏肿大，而O2-ST08和O2-ST09免疫组，特别是O2-ST09免疫组，临床病变相对较小(另附文件)1）.

用兔抗-进行免疫组化大肠杆菌O2抗体确认免疫是否能给予保护大肠杆菌O2的挑战．黄褐色区域代表未被免疫诱导抗体中和的攻毒菌株。各组肝细胞褐黄区无明显差异(图2)7）.BSG、ST08和O2-ST08免疫组脾脏呈棕黄色;O2-ST09免疫组脾细胞未见明显反应区(图2)7）.

脂多糖是细胞包膜的常见成分，约占革兰氏阴性细菌外膜的70% [29]。OAg的长度变化最大，从3到4个糖的单个重复单位到超过100个糖单位，导致有效的细胞外屏障[30.]。先前的一项研究表明，OAg长度影响OAg结合疫苗引起的免疫反应的大小和质量[31]。因为不同的wzz基因产生不同的OAg大小wzz可用于操纵多糖长度，改变菌株的免疫原性[32]。

在本研究中，我们评估了OAg长度对年代。鼠伤寒的免疫原性wzz基因大肠杆菌。所有这些细菌都依赖于Wzx/Wzy途径来合成LPS。在接下来的实验中，我们通过改变OAg长度决定因子来使用单变量因子wzz不考虑fepE-编码VL OAg链长(HMW多糖)，产生一系列突变菌株Δwzz_圣,Δwzz_圣：：wzz_ECO2．免疫反应检测显示突变体年代．鼠伤寒杆菌ST07 (Δc反应蛋白Δ自保”Δwzz_圣：：wzz_ECO2)刺激小鼠的IgG水平略高于其他测试菌株，表明ST07引发了强烈的体液免疫反应年代．培养的有限合伙人。重组菌株O2-ST09 (Δ自闭症谱系障碍Δc反应蛋白Δ自保”ΔrfbPΔwzz_圣：：wzz_ECO2与O2-ST08相比，OAg长度中等的O2-ST08诱导了更显著的功能性IgG抗体，并激发了更强大的免疫保护作用(Δ)自闭症谱系障碍Δc反应蛋白Δ自保”ΔrfbPΔwzz_圣)长OAg长度。早期研究发现端联载体的中型寡糖具有较高的免疫原性效力流感嗜血杆菌b类及脑膜炎奈瑟氏菌glycoconjugates [33]。此外，与长链Vi-CRM197偶联物相比，短链vi -多糖诱导脾脏中vi特异性B细胞的增殖时间更长[34]。我们的结果与这些发现一致，表明沙门氏菌具有中等OAg长度的递送载体在引发多糖特异性免疫应答方面具有优势。然而，已经报道了相互矛盾的结果，例如大尺寸的OAg糖缀合物(HMW-TT)比小尺寸的OAg糖缀合物(LMW-TT)引发的IgG滴度要低得多，而小分子质量的OAg片段在小鼠中引发的抗体水平明显高于全长OAg [35]。目前正在考虑两种假设，其中一种解释是各种疫苗形式。以前的研究志贺氏杆菌，土拉杆菌内,或年代．鼠伤寒通常是指蛋白结合多糖疫苗，从中提取LPS并将其结合到载体蛋白，如TT，而多糖链长度受糖结合疫苗生产过程中使用的各种因素和条件的影响[33]。相比之下，本文报道的多糖是在活体中生物合成的年代．而提取方法对LPS的长度、亲和力和亲和力均无影响。另一种可能是链长定义不一致;如果VL OAg长度负责HMW, L OAg长度负责LMW，则本文的结果是在保留HMW的情况下修改LMW，而不是直接将HMW和LMW进行比较。因此，我们假设分类方法是影响得出结论的另一个因素。

抗lps抗体应答主要是Th2免疫应答。没错，活衰减沙门氏菌具有有效地将抗原呈递到树突状细胞的优势，并因其触发强大的体液免疫反应的能力而受到青睐。因此，抗原特异性CD4⁺T细胞免疫反应也被检测到。正如预期的那样，ST07在小鼠和CD4中诱导了与ST05相似的IFN-γ和IL-4水平⁺T细胞免疫反应年代．突变后鼠伤寒杆菌LPS含量未降低wzz_圣：：wzz_ECO2．此外，与O2-ST08相比，O2-ST09免疫组甚至在鸡体内引发了更高的IL-2、IL-10和IL-4 mRNA水平，这三种蛋白分别是激活T细胞增殖、调节Treg细胞和促进Th2细胞的必需物质。这表明中间OAg长度在诱导最佳的th2偏向性免疫应答中起作用，并与免疫原性直接相关年代．鼠伤寒菌，尤其对所传递的多糖。

先前的研究表明，LPS被选为抗菌蛋白破坏细菌OM并执行抗菌作用的门户，因为它的保守结构和对外膜蛋白行为和表现的影响，因为大多数抗生素目前都是针对细胞内过程的，必须能够穿透细菌的细胞包膜[36]。此外，改变这些分子对细菌对各种抗生素的敏感性和耐药性有重大影响[37]。例如，多粘菌素B和DOC对LPS化学型敏感[38，39]。此外，脂多糖突变导致喹诺酮类药物(如诺氟沙星)和β -内酰胺类药物(如氨苄西林、青霉素)耐药性[40]。因此，我们假设，如果OAg长度缩短，抗生素受体将暴露，允许多粘菌素B的最低抑制剂量降低年代．鼠伤寒和增加对NOR、氨苄西林和青霉素的敏感性。此外，OAg长度的改变可以通过影响细胞膜蛋白对细胞膜稳定性和粘菌素分泌的响应来改变OM景观，从而影响细菌对DOC和四环素的耐药性[j]。41]。

细胞膜渗透性是最著名的抗生素活性机制之一[42]。脂多糖覆盖了细胞表面的很大一部分，形成了一个渗透性屏障，阻止抗生素和胆盐等有害化学物质进入。43]。我们发现，减少OAg分子的长度会降低细胞膜的通透性。这种渗透性的变化可能有所帮助沙门氏菌适应特定的环境条件，这可以解释为什么细菌对多粘菌素B和DOC敏感。目前尚不清楚OAg长度究竟是如何降低膜通透性的。肠杆菌共同抗原(ECA)是一种与OAg相关的表面抗原，在膜维持中起作用[44]。改变OAg的长度是否会影响ECA，进而影响外膜的通透性屏障(OM)，还有待观察。

除了化学战，噬菌体感染和免疫系统都依赖细胞膜作为抵御细菌的第一道防线[45]。因此，我们确定了不同OAg长度的菌株对补体介导的杀伤和补体抗性沉积的影响。我们的数据表明，与长链或短链的菌株相比，中等OAg长度的突变菌株产生了更多参与补体介导的杀菌活性和补体沉积的抗体。部分原因是长链菌株产生阻断抗体，破坏补体介导的细菌杀伤，而短链菌株产生较少的表位和阻断抗体。研究结果支持了早先的一项发现年代．OAg侧链较短的鼠伤寒菌株更易受血清的影响[21，46]。此外，抗长OAg抗体可抑制血清杀伤[47]。甚至之前的研究也表明大肠杆菌中、长OAg链的O157菌株比短OAg链的O157菌株对血清补体的抗性更强。13]。我们怀疑这种现象是由于LPS OAg由可变数量的重复单元组成，在单个细胞中含有超过100个RUs，提供了一个强大的屏障来限制抗体进入细菌表面。改变OAg的长度会改变LPS OAg的化学和物理结构以及蛋白表面抗原内特异性抗原表位的呈现[48]。Δ的保护性wzz_圣：：wzz_ECO2表明OAg重复序列的类型也发挥了作用，证实了OAg侧链的长度调节了细菌对血清补体系统的耐药性[49]。需要更多的研究来了解lps特异性抗体如何与细菌表面相互作用。

综上所述，我们提供的证据表明，LPS OAg长度调节因子wzz显著的影响年代．沙门氏菌感染。此外，重组菌株O2-ST09来源于Δwzz_圣：：wzz_ECO2对鸡有一定的保护作用。这些发现扩大了我们对OAg决定因子Wzz对其影响的认识沙门氏菌多糖传递了出去。

本研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

作者感谢Han Xiangan博士和Xinxin Zhao博士提供了本研究中使用的菌株DE17、ATCC14028和质粒pRE112。

国家自然科学基金(31902280、31972648、31872620、32172849)、宁波市自然科学基金(202003N4179)和浙江省农林科技大学人才计划项目(2019FR041、2019FR035)资助。

作者指出

1. 韩跃、罗平和曾欢对这项工作也有同样的贡献

作者及单位

1. 浙江省绿色生态健康畜牧业应用技术重点实验室，浙江省动物健康诊断与先进技术工程研究中心，浙江省兽医与健康管理国际科技合作基地，中澳动物、健康大数据分析联合实验室，浙江农林大学动物科技学院，乌素街666号，杭州，311300

   韩跃，罗平，曾欢，王璞，徐佳丽，陈新丹，陈玉姬，曹启宇，翟瑞东，夏静，邓思敏，程长勇，宋厚辉

2. 四川农业大学动物医学院预防兽医研究所，成都611130

   韩悦，程春春

3. 河南省现代中医兽医研究所，郑州450002

   Pengju陈

4. 山东鑫德汇生物科技有限公司，云城县，274700

   Pengju陈

贡献

HS、CC、YH、AC负责实验构思和设计;YH、PL、PW、XC、YC、QC、JX、RZ、JX、SD进行实验;YH, PL, PC分析数据;YH、CC撰写稿件;HS和HZ对其进行了实质性修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Changyong程或Houhui歌．

伦理批准并同意参与

动物护理和使用方案按照中华人民共和国国务院批准的《实验动物管理条例》执行。本方案经浙江农林大学机构动物保护与利用委员会批准(许可证号:ZJAFU/IACUC_2011-10-25-02)。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

代理编辑:蒂娜·达尔加德

出版商的注意

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