养殖大西洋鲑鱼的深入健康监测和临床营养:发现和减轻重度精神分裂症爆发的战略尝试gydF4y2Ba

鱼类卫生人员在与开放式网箱养殖的大西洋鲑鱼的心脏和骨骼肌炎症(HSMI)等病毒性疾病作斗争方面的工具有限。在这项研究中，我们旨在通过加强健康监测来预测重度精神分裂症，并应用临床营养来减轻病情。我们跟踪了一个商业队列(G1)大西洋鲑鱼，该鲑鱼在转移到HSMI通常发生暴发的地点的海笼时为PRV-1 naïve。该地点其他网箱(G2-G6)中的鱼来源与G1不同，在海上转移前均为PRV-1阳性。通过连续分析生产数据并依次(大约每4周)对G1和G2的10条鱼进行尸检、RT-qPCR(针对PRV-1和选定的免疫基因)、血液和组织学分析，我们确定了G1期PRV-1感染的时间，并预测了在任何临床症状出现之前HSMI的发生。来自G1和G2的PRV-1分离株的部分基因组序列相同，表明可能从受感染的笼子转移到G1。分离株被分成一个已知具有高毒力的基因组。在HSMI爆发期间，采用了商业健康饮食，鱼的死亡率低，食欲未受影响。总之，我们表明鱼类的健康和福利可以受益于深入的健康监测。我们还讨论了临床营养作为减轻重度精神分裂症的一种手段的潜在健康价值。gydF4y2Ba

开放式围栏养殖大西洋鲑鱼(gydF4y2Ba大西洋鲑gydF4y2Ba)暴露于各种细菌、病毒和寄生虫病原体[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。尽管针对细菌性疾病的有效疫苗在20世纪90年代得到实施[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，针对病毒性疾病的商业化疫苗不太成功，甚至缺乏疫苗，例如由鱼类正呼肠病毒1型(PRV-1)感染引起的心脏和肌肉骨骼炎症(HSMI)的情况[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。此外，用于实地工作兽医的诊断或治疗目的的临床工具有限，因此不断寻求新的治疗方法和改进的鱼类健康策略。gydF4y2Ba

在所有大规模养殖大西洋鲑鱼的国家，包括挪威、加拿大、苏格兰和智利，都发现了PRV-1。HSMI似乎在所有这些国家都很普遍，除了加拿大，那里只有有限数量的非临床HSMI病例被记录。在挪威，重度精神分裂症最早是在20世纪90年代末作为一种新兴疾病报道的。这种疾病首先在挪威中部被发现，很快在挪威沿海的农场被发现。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。怀疑是病毒引起的，2010年发现了一种病毒[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，但直到2017年才证实与PRV-1的因果关系[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。2014年，高致病性重度精神分裂症因其发病率高且病原体PRV-1广泛分布而被排除在国家鱼类卫生主管部门的法定通报疾病清单之外。gydF4y2Ba

尸检时观察到疾病的临床体征，怀疑HSMI的诊断，常被视为循环衰竭伴有腹水、心包炎和肝肿胀，当RT-qPCR检测到PRV-1(不同负荷)并伴有心脏心室和红色骨骼肌的组织病理学改变时，证实了HSMI的诊断[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。此外，常见的情况，如心肌病综合征(CMS)和胰腺疾病(PD)需要排除。重度精神分裂症爆发的累积死亡率从微不足道到20%不等[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。然而，感染率通常可达100%，但不同鱼群之间的感染时间可能有很大差异:有些在孵化场或早在孵化前或孵化前感染，而有些则在海水阶段感染[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。然而，并不是所有感染了PRV-1的鱼都会发展成HSMI。早期或晚期感染的结果尚不完全清楚，因为其他因素，如鱼的一般健康状况、环境条件和所涉及的PRV-1分离株的差异，都可能影响HSMI的发展。最近，在一项攻毒实验中，使用标准化剂量的病毒分离物证明了PRV-1分离物之间的毒力差异，在该实验中，各组之间的所有非病毒参数尽可能相似。分离株诱导HSMI心脏病变的能力不同，序列分析表明，这种特性与PRV-1的5个基因组片段(L1、L2、M2、S1、S4)有关[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。因此，可以根据这五个基因组序列的组合将病毒分离物分类为基因组。对挪威鲑鱼养殖场的PRV-1分离株的调查表明，存在属于高毒力和低毒力基因组的病毒[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。对患有重度重度精神分裂症的鱼类中PRV-1分离株的进一步研究将增加我们对这种高度流行疾病的发病机制的理解。gydF4y2Ba

临床营养对治疗伴侣动物的几种疾病至关重要[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。对于生产动物来说，这种饮食不太常见，但对于养殖鲑鱼来说，它们正受到越来越多的关注。对于影响循环系统的疾病，如HSMI，尤其如此。几项研究表明，重度精神分裂症的影响可以通过临床营养和功能性饲料来调节[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。然而，健康饮食对农民来说意味着额外的成本，而对现场工作的兽医来说，一个明显的挑战是知道何时使用这种饲料，以确保最佳的健康效果和成本。解决这个问题的系统方法可以通过在相关的生产环境中进行大规模测试来完成。gydF4y2Ba

在本研究中，将PRV-1阴性(G1)和PRV-1阳性(G2-G6)幼崽从淡水中转移到各自的海笼中，这些海笼在历史上曾多次发生HSMI。G1和G2的鱼在出海后的前12个月都受到密切监测。对生产参数的持续分析、基因表达和PRV-1感染状态的频繁调查、组织学检查和血液分析确定了重度精神分裂症的发病，并使临床营养应用能够潜在地抵消疾病的影响。我们讨论了多模式方法的相关性，与重度精神分裂症相关的临床营养的使用，以及处理养殖鲑鱼PRV-1感染的实际考虑。gydF4y2Ba

鱼类原料及抽样gydF4y2Ba

经RT-qPCR检测，平均体重155 g, PRV-1阴性的AquaGen SHIELD大西洋鲑鱼幼崽约20万条(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)，于2020年5月被转移到位于Ofotfjorden(挪威北部)Stabben的Ellingsen Seafood的海笼1 (G1)。经RT-qPCR检测，平均体重88 g、PRV-1阳性的AquaGen GAIN红色品系大西洋鲑鱼幼鱼约100万条(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)，于2020年5 / 6月转移到同一位置，分布在2-6 (G2-G6)海笼中(图1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.笼子排成一行，每个笼子之间的距离为45米。所有鱼在海上转移之前的适当时间都接种了Alpha Ject micro 6 (Zoetis的Pharmaq部分)疫苗(G1于2019年12月，G2于2020年2月)。该疫苗刺激保护性免疫反应，以对抗引起疖病、冷水弧菌病、典型弧菌病、冬季疮和引起感染性胰腺坏死的病毒的细菌。gydF4y2Ba

为了确保有代表性的鱼样本，在喂食期间将一张大网放入笼子(G1和G2)中，并迅速拉过水。这一程序确保了对参与饲养的鱼进行取样。只有在海笼中发现具有代表性的鱼才会被进一步调查，即由于伤口，受影响的鳃，低生长等而被视为异常值的个别鱼被排除在外。gydF4y2Ba

按照国家动物福利法规(Forskrift from drift av akvakulturanlegg§34)进行采样。生活(冒险)。在每次取样中，G1组的10条鱼和G2组的10条鱼被致死剂量的麻醉剂(Benzoak vet)安乐死。， ACD制药公司)。安乐死后，采集外周血(含肝素)。将鱼解剖，并在RNAlater中收集心脏样本，通过RT-qPCR进行下游病毒和免疫基因表达分析(分别由PatoGen analysis， Ålesund, Norway和Skretting ARC, Stavanger, Norway进行)。在2020年8月的最后8个样本中，心脏和侧线样本(包括皮肤、红肌肉和白肌肉)在10%磷酸盐缓冲福尔马林中收集，用于在挪威兽医学院NMBU进行组织学分析Ås。gydF4y2Ba

生产数据分析gydF4y2Ba

在G1和G2中每天监测生产数据，即食欲和死亡率。登记了食欲，而死亡数则由养鱼场工作人员每日登记计算。gydF4y2Ba

RT-qPCRgydF4y2Ba

RNA隔离gydF4y2Ba

使用RNeasy fiber Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)从心脏样品中分离总RNA。从RNAlater中取出心脏样本，用1mm DTT转移到Buffer RLT中。使用TissueLyserII (QIAGEN)和5mm不锈钢珠对心脏组织进行均质。组织裂解在25 Hz下进行5分钟。裂解后，样品在bbb10 - 12 000 rct离心5分钟，收集组织碎片。按照制造商的方案进行RNA分离。RNA用不含RNAse的水洗脱，保存于- 80℃。gydF4y2Ba

逆转录酶聚合酶链反应gydF4y2Ba

第一链cDNA的合成使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)，随机/oligoDT引物。共取2µg RNA作为RT-PCR反应模板。随后将心脏cDNA作为qPCR实验的模板。gydF4y2Ba

RT-qPCRgydF4y2Ba

在quantistudio 5 (Thermo Fisher scientific)软件中进行定量PCR，使用SYBR-Green进行检测。熔点分析证实了SYBR Green检测方法的特异性。RT-qPCR反应由10µL PowerUP SYBR Green Mix (Thermo Fisher Scientific)，正向和反向引物，1µL cDNA用无核酸酶水1:10稀释。优化了标准循环条件和引物浓度。根据平均内参基因归一化的两个技术重复计算平均表达量:gydF4y2Ba真核生物翻译起始因子3gydF4y2Ba(eIF3)和gydF4y2Bab-actingydF4y2Ba．目的基因mRNA的相对量以相对于内参基因的倍数变化表示(ΔCt = Ct)gydF4y2Ba_{感兴趣的基因gydF4y2Ba}- - - - - - CtgydF4y2Ba_{管家基因的平均值gydF4y2Ba})，并为每条鱼计算。为每个采样点计算10个人的中位数ΔCt，并用于图表。选择的基因是gydF4y2BaMx1-2gydF4y2Ba，gydF4y2BaGIG2gydF4y2Ba和gydF4y2BaViperingydF4y2BaCD8b和GZMa与T细胞免疫应答相关。gydF4y2BaMxgydF4y2Ba，gydF4y2BaGIG-2gydF4y2Ba和gydF4y2BaViperingydF4y2Ba由于其作为干扰素诱导的抗病毒基因(VRG -病毒应答基因)的功能而受到研究，特别是RNA病毒[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。由于已知CD8b和GZMa在PRV-1感染的适应性免疫应答中具有重要作用，因此对其进行了研究[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。参见附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba查看底漆细节。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

RT-qPCR检测PRV-1和免疫基因。在不同的时间点的平均值比较使用学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。连接字母报告表示时间点之间的差异。没有相同字母连接的级别有显著差异。图中已添加字母gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

组织学调查gydF4y2Ba

福尔马林固定的样品通过分级乙醇浴脱水，二甲苯清除，石蜡包埋。将收集的所有样品制成2 μm的切片，按照标准方案进行复水化，并用苏木精和伊红(HE)染色。gydF4y2Ba

评估切片的退变、坏死、炎症和再生情况。在心脏样本中，研究了心房、心室和球，在肌肉样本中，评估了红肌和白肌。在200X下检查这些切片，并使用0到3的等级对hsmi相关病变进行评分，其中0表示无变化，1表示轻度变化，2表示中度变化，3表示严重变化。轻度评分(1)仅观察到灶性改变，中度评分(2)以多灶性改变为特征，重度评分(3)以融合性和弥漫性改变为特征。gydF4y2Ba

血液分析gydF4y2Ba

从尾血管抽取血液样本(gydF4y2Ba诉。caudalisgydF4y2Ba)，用真空容器装锂-肝素。血样在采集后(10min, 3000h)立即集中在养殖现场离心gydF4y2BaggydF4y2Ba(室温)和血浆转移到Eppendorf管中，在- 80°C冷冻，直到分析血浆酶肌酸激酶(CK)和天冬氨酸转氨酶(AST)的存在。已知CK在肌肉损伤后血浆中增加，并已被证明与HSMI鱼的组织病理学变化增加相关[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。已知在肌肉和/或肝脏损伤后血浆中AST增加[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。参数分析使用Konelab 30i (Thermo Fisher Scientific)。gydF4y2Ba

PRV-1测序及序列分析gydF4y2Ba

选择2份样本进行PRV-1测序，每组/笼各1份。从G2(在海洋转移前PRV阳性)中选择一条Ct值为16.9的鱼。从组1中选取1只HSMI确诊鱼，Ct为25.7，组织学心脏评分3分，红肌评分3分。针对与毒力相关的5个PRV-1片段L1、L2、M2、S1和S4进行了部分基因组测序。测序由PatoGen AS (Ålesund，挪威)进行，如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。使用AlignX (Vector NTI Advance 11.0)进行多个序列比对，使用Mega X v.10.17进行系统发育分析，如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

卫生监测gydF4y2Ba

每次取样后，在1周内获得生产资料、尸检、RT-qPCR、血液分析和组织学检查的结果。用不同的方法评估了从一次抽样到下一次抽样的总体趋势(增加、减少或稳定值)。研究结果在项目组中讨论了重度精神障碍的发展以及何时开始喂养gydF4y2BaAquragydF4y2Ba^tmgydF4y2Ba-由Skretting AS(挪威斯塔万格)拥有并商业化的临床营养饮食。gydF4y2Ba

营养gydF4y2Ba

G1-G6期在海水期饲喂标准生长饲料。当G1期怀疑HSMI发病时，饮食改为gydF4y2BaAquragydF4y2Ba．gydF4y2BaAquragydF4y2BaG1期饲喂10周。10月11日。12月)，按照生产商的指引。简而言之,gydF4y2BaAquragydF4y2Ba不同于标准的养殖饲料的几个标准:低脂含量，高蛋白质含量和较高的海洋含量。EPA + DHA的最低水平为饲料总脂肪的14%。此外,gydF4y2BaAquragydF4y2Ba含有多种维生素、矿物质和其他功能性成分。gydF4y2Ba

PRV-1检测(RT-qPCR)gydF4y2Ba

经海转前，G1期鱼PRV-1阴性(Ct≥37)。同时，指定为G2的代表性鱼被证实PRV-1阳性(中位Ct值19.65)。经海上转运后，G2的PRV-1 Ct值中位数分别上升至25.7(6月)和30.75(7月)。在其余样品中，Ct值一直很高(bbb33)或未在G2中检测到。值得注意的是，在样品IX中G2未检测到PRV-1。gydF4y2Ba

G1期至第4次取样(8月)均为PRV-1阴性。在第三次抽样中，抽取的鱼类(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)在G1期均为PRV-1阴性，而在IV期均为PRV-1阳性。样本V(9月)中位Ct值最低为20.95。从第V个采样开始，中位Ct值稳步上升至第IX个采样，在整个观测期内保持在bbb30(图1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

PRV-1测序鉴定出高毒力分离物gydF4y2Ba

从G1组和G2组获得的PRV-1核苷酸序列相同，表明G2组的病毒已传播到G1组。对5个基因组片段(L1、L2、M2、S1、S4)的系统发育分析表明，本研究分离物的核苷酸序列与先前鉴定的分离物NOR2019 NRL-1742 m (GenBank登录号MW831760-MW831764)相同[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。该分离物聚集在“high -2”基因群中，根据参考分离物NOR2018-SF的定义，该基因群具有高毒力[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

免疫基因表达分析gydF4y2Ba

G1期，早期抗病毒反应基因表达ΔCt值:gydF4y2Bamx, gig2gydF4y2Ba和gydF4y2BaviperingydF4y2Ba在采样V(9月)和采样VI(10月)表达增加。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA)，即通过RT-qPCR观察到，早期抗病毒应答基因的表达紧随PRV-1 RNA的负载(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

在G2中，的表达式的ΔCt值gydF4y2Bamx, gig2gydF4y2Ba和gydF4y2BaviperingydF4y2Ba在采样I (May)与G1在采样V的水平相同，即在峰值表达。因此，G2的早期抗病毒反应基因在样品I(5月)和II(6月)中被评估为高水平，随后这些基因被下调。gydF4y2BaGig2gydF4y2Ba和gydF4y2BaViperingydF4y2Ba在采样VII中表达量也有所增加(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

G1期细胞毒性t细胞反应分析显示gydF4y2Bacd8bgydF4y2Ba和gydF4y2BagzmagydF4y2Ba在采样VI(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB)，即相对于早期抗病毒应答基因表达的增加，延迟了一个采样周期(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA).在整个研究过程中，G1期的表达水平仍高于I-V样品。在G2中，在采样II中表达量最高，相对于早期抗病毒应答基因再次延迟了一个采样周期，并且在整个研究过程中表达模式呈下降趋势。gydF4y2Ba

组织学分析gydF4y2Ba

G1组的鱼HSMI心脏评分从采样IV(8月)到采样VII(11月)增加(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.G1期红肌评分呈相同趋势。心脏和红肌的得分在采样7时达到峰值。在其余的观察期间，两个器官均低于轻度影响(评分0.5-0.9)。gydF4y2Ba

G2组的鱼在IV次取样时心脏评分升高(轻度到中度)。其余样本的心脏评分较低(<0.2)。在G2时，鱼的红肌变化较小(<0.3)。除了偶有单个肌细胞变性和肌内膜中偶有黑素巨噬细胞外，两组的白肌在所有样本中均无变化。gydF4y2Ba

血液参数gydF4y2Ba

G1组鱼AST水平从采样V(9月)上升至采样VII(11月)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.在所有样本中也测量了CK，然而，在研究期间没有升高的水平(数据未显示)。gydF4y2Ba

食欲、死亡率和临床营养gydF4y2Ba

G1术后5周食欲正常，死亡率小幅升高(累计死亡率3.77%)。同期G2组鱼食欲下降，死亡率升高(累计死亡率7.41%)。6 - 10月，G1和G2的食欲和死亡率均达到正常生产值，并保持稳定。10月，G1地区的死亡率有所上升，但这仅限于一个非常有限的时期(图3)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.10月G1开始临床营养，PRV-1分析、基因表达分析、血液参数及组织学综合结果提示HSMI发病。10月至12月HSMI爆发期间，即G1期临床营养喂养期间，G1和G2的食欲差异可以忽略不计(数据未显示)。gydF4y2Ba

这项研究的范围是预测养殖鲑鱼的重度精神分裂症，并应用临床营养来抵消疾病的影响。根据对鱼类健康状况的广泛和频繁的分析，组织了一项跨学科的鱼类健康战略，每天监测生产参数，每月分析人口健康。这包括尸检、PRV-1检测和免疫基因表达状态、组织学分析以及与骨骼肌和心脏疾病相关的某些血液参数分析。我们能够预测新出现的重度精神分裂症爆发的开始，这使我们能够通过临床营养实施应对措施，试图减轻疾病的严重程度。gydF4y2Ba

将PRV-1阴性鱼群(G1)和阳性鱼群(G2)分配到单独的海网箱中，并在海上的头12个月进行跟踪。结果显示，进入咸水后4个月G1期，PRV-1的检出率为100%。G1期病毒RNA载量的逐渐增加，被视为PRV-1 Ct值的降低趋势，以及血酶AST水平的升高和早期抗病毒免疫基因表达的增加，被认为预示着即将爆发的重度精神分裂症。重要的是，此时无法在尸检中观察到疾病的临床症状，并且与生产相关的参数如食欲和死亡率正常。随后进行为期10周的临床营养治疗。在临床营养喂养期约1周后，HSMI的爆发得到证实。对PRV-1菌株进行测序，确定该分离物为高毒力分离物，已知比低毒力分离物引起更严重的组织病理学改变[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。G2和G1中PRV-1分离株的序列特性提示病毒可能从G2传播到G1。尽管分离物被归类为高致病性，但G1期死亡率仍然很低，这可能是由于临床营养的缓解作用。gydF4y2Ba

在整个研究过程中，组织了对鱼类健康的监测，以便采取主动的临床方法。这种监测与普通的健康监测不同，不仅在于每月取样和多次实验室分析，而且在于鱼类健康监测小组的结构。专家组包括现场鱼类卫生人员、饲料供应商公司的兽医和诊断实验室的兽医。所有结果在每次取样后1周内得到并合并，然后由鱼类健康小组进行分析和讨论。这确保了对当前鱼类健康状况的广泛了解，并为HSMI的发展和何时应用临床营养提供了全面的决策基础。选取有代表性的鱼类进行抽样，目的是反映人口的总体健康状况，而不是最近患病的鱼类。这与主要关注死鱼的常见鱼类卫生做法形成对比，后者符合鱼类卫生条例(水产养殖设施操作条例第13条)。条例规定，应该对行为异常的濒临死亡或最近死亡的鱼进行有代表性的解剖。基于我们的研究结果，我们认为强调不同群体的跨学科鱼类健康策略可以预测HSMI的发生，从而有利于生产和鱼类福利。gydF4y2Ba

G1组密切监测PRV-1感染和重度精神分裂症的发生情况。将G2- g6组鱼视为养殖场PRV-1的宿主，G2和G1在取样和方法上相同。与G1相比，G2在海上转移后死亡率直接增加，但在整个研究期间没有表现出疾病的临床症状。G2患者死亡率的增加可能是由于重度精神分裂症的早期爆发，尽管这还不能得到证实。这一时期(采样I-IV)的PRV-1 Ct值和基因表达结果，以及采样IV(8月)心脏组织学评分的增加，可以很好地与早期重度精神分裂症的诊断相一致。PRV-1分离物具有高毒力的遗传特征，这进一步支持了这一假设。相反，HSMI通常不会在海上转移后立即诊断出来，并且可能由于其他常见的与smolt相关的问题而被忽视。Løvoll等报道，在选定的淡水队列中，PRV-1感染率约为36% [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。同样，Patogen analysis报告的患病率为44-49%(未发表的数据)。事实上，在2021年的《挪威鱼类健康报告》中[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]， PRV-1感染被确定为在某些与HSMI斗争的小猪崽生产场所日益严重的问题。因此，HSMI不应被忽视，因为它是造成幼崽死亡的一个原因。gydF4y2Ba

根据我们对10条鱼的采样，G1期PRV-1的检出率在4周内(从采样事件III到IV)从0到100%。在实地监测或怀疑传染病时，通常的做法是抽取10条鱼的样本;然而，如果增加样本量，可以发现PRV-1感染流行率的细微差别。在类似的现场试验中，Bjørgen等。[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba发现PRV-1感染naïve鱼的过程持续了25周。在这里，取样量为每月约60条鱼。重要的是，在他们的研究中没有对PRV-1分离物进行测序。在本研究中，鉴定出一种高毒力的分离物。本研究中分离物的核苷酸序列与先前测序的分离物(NOR2019 NRL-1742 m)的核苷酸序列相同，该分离物起源于2019年，来自与本研究中相同的地理区域[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。G2和G1中发现了相同的分离株，这与感染在养殖场内的水平传播一致。这就提出了有关当前做法和鱼类健康战略的一些重要问题。早期的PRV-1感染可能会导致同样早期的重度精神分裂症爆发，正如本研究中G2的情况一样。然而，PRV-1 naïve鱼很可能在较晚的阶段发生高重度精神分裂症，因此鱼的体型也更大，与更大的经济损失相关。因此，在海洋转移时控制不同鱼类种群的PRV-1状态似乎对策略性鱼类健康工作至关重要，并可帮助鱼类健康从业人员处理重度重度精神分裂症和其他与PRV-1相关的疾病[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。其他因素，如水流、养鱼场密度和野生鱼类种群的健康状况等，可能对PRV-1的传播也很重要，但控制起来要困难得多。gydF4y2Ba

基于样本V中PRV-1 RNA载量增加、抗病毒免疫基因表达增加和血浆AST水平升高，怀疑G1期HSMI即将爆发(9月)。在此基础上进行临床营养治疗10周。重要的是，死亡率和食欲被评估为正常，此时检测到轻微的组织病理学变化。随着死亡率的增加，组织病理学评分证实了重度精神分裂症的诊断。这与感染试验中HSMI的发展是一致的，在感染试验中，病毒载量高峰大约发生在组织病理学改变前4-6周[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。我们发现与RNA病毒抗病毒免疫反应相关的基因，包括gydF4y2BaMxgydF4y2Ba，gydF4y2BaGig2gydF4y2Ba和gydF4y2BaViperingydF4y2Ba，在感染早期表达上调，随后表达增加gydF4y2BaCD8αgydF4y2Ba和gydF4y2BaGZMagydF4y2Ba在后期阶段。这与先前关于PRV-1感染的先天和适应性免疫反应动力学的研究一致[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。细胞毒性T细胞被认为参与病毒清除，并增加表达gydF4y2BaCD8αgydF4y2Ba和gydF4y2BaGZMagydF4y2Ba与感染后期PRV-1 RNA水平下降有关[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。除了细胞免疫外，临床营养也可能调节了免疫反应。G1期的重度精神分裂症暴发持续时间相对较短，死亡率的增加仅限于有限的时期。此外，组织学评分显示，轻度至中度的变化最为普遍，变化逐渐变得不那么严重。在先前的一项HSMI感染试验中，已经报道了EPA水平增加对HSMI相关变化的积极影响[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，同样，增加EPA和DHA在生长性能、福利、健壮性和整体质量方面的积极影响[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。G2中的鱼也可能在取样1后从标准养殖饲料转向临床营养，但这仍然是推测性的。虽然幼崽和幼崽的饲料中EPA/DHA的含量通常高于生长饲料，但这些水平仍然低于我们研究中使用的临床营养饲料中EPA/DHA占总脂肪的14%的最低水平。由于这是一项实地研究，没有在相同条件下饲喂标准种植者饮食的HSMI对照组，因此，临床营养的所有影响都需要谨慎解释。gydF4y2Ba

每次采样时评估PRV-1 RNA和免疫基因表达、组织学评分和血酶水平的变化趋势。所有这些参数都有助于提供有关感染的信息，但它们因在不同时间点提供关键信息而有所不同。重要的是，了解PRV-1的进展，特别是在G1期出现病毒感染高峰的时间，对于预测重度精神分裂症的发生和何时应用临床营养至关重要。事实上，预测重度自残的时间性质和临床营养的应用可以仅仅基于监测人群中的PRV-1水平;然而，抗病毒基因活性增加和AST水平增加的额外信息加强了我们的怀疑。此外，PRV-1的测序证实了人群中存在高毒力毒株，具有更严重HSMI表现的风险增加。组织学结果和适应性免疫基因的研究只需要在后期确认重度精神分裂症。总之，监测所有参数对于全面了解疾病的进程是必要的。gydF4y2Ba

G1和G2密切监测12个月，每组仅在一次确诊(G1)或被认为发生(G2) HSMI。据我们所知，目前还没有研究表明重度精神分裂症是否会在人群中多次发生。这在鱼类保健人员中也有争论。感染PRV-1的鱼会产生特定的免疫反应[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，然而，特异性反应的持续时间是未知的，而且这种反应不足以清除感染[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。这可以通过持续的病毒转录来解释，但病毒翻译被阻止，这在感染试验中得到了证明[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。基于我们的RT-qPCR结果，类似的机制可能适用于PRV-1的自然感染。gydF4y2Ba

总之，我们的研究结果表明，积极主动的健康监测，结合现场数据和基于实验室的方法，如血液、基因和组织学分析，可以在即将爆发的重度精神分裂症爆发之前保持领先地位，并在适当的时候采取措施抵消疾病的影响。我们认为，水产养殖中以人群为基础的健康监测应该是前瞻性的，这一点在我们处理重度精神分裂症的成功方法中得到了强调。gydF4y2Ba

超出论文结果的数据可向通讯作者索取。gydF4y2Ba

Clementine Linde(兽医学院解剖学单元)，Sølvi Espeland (Skretting ARC实验室)和Lisbet Myre (Skretting ARC实验室)在实验室方面提供了帮助。感谢Line Andersen (Skretting AS)对图1的图形设计。Stabben的员工和Ellingsen Seafood的CEO Line Ellingsen对他们的支持表示感谢。gydF4y2Ba

作者及单位gydF4y2Ba

1. 挪威斯塔万格的Skretting ASgydF4y2Ba

   Johan Rennemo, Kjetil Berge和b.ø rge PedersengydF4y2Ba

2. 挪威罗弗敦Ellingsen SeaFood ASgydF4y2Ba

   Steinar Myrvold， Øyvind Kileng和Dan Sindre AksberggydF4y2Ba

3. Skretting水产养殖创新(AI)，斯塔万格，挪威gydF4y2Ba

   彼得·利西克，戴尔芬·克拉普和查尔斯·麦格克gydF4y2Ba

4. 挪威生命科学大学兽医学院病毒学研究室，1433，Ås，挪威gydF4y2Ba

   Espen Rimstad & Øystein WesselgydF4y2Ba

5. 挪威生命科学大学兽医学院解剖单元，1433，Ås，挪威gydF4y2Ba

   Erling Olaf Koppang & havard BjørgengydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

JR:学习概念化、计划和组织。领导鱼类健康小组材料取样，血液分析和结果可视化。写了手稿。SM:物料抽样，负责登记日常生产参数，批改稿件。KB:血液分析，参与鱼类健康小组并对手稿进行评论。ØK:参与鱼类健康小组讨论，并对稿件进行评论。BP:参与鱼类健康小组，并对稿件进行评论。DSA:负责登记日常生产参数，并对稿件进行批注。PL: RT-qPCR分析并评论稿件。 DC: RT-qPCR analysis and commented on the manuscript. CM: RT-qPCR analysis and commented on the manuscript. ER: PRV-1 sequence analysis and commented on the manuscript. ØW: PRV-1 sequence analysis and commented on the manuscript. EOK: histological analysis and commented on the manuscript. HB: Supervised the study. Participated in the fish health panel. Visualization of data. Histological analysis and wrote the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba哈佛BjørgengydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

鱼类的所有处理程序均符合欧盟立法指南(2010/63/EU)以及挪威立法。根据国家动物研究立法，这项研究被认为是一项不受管制的程序，因为这些鱼没有受到任何疼痛或痛苦。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

Johan Rennemo先生、Kjetil Berge博士、b.ø rge Pedersen先生(Skretting AS的员工)和Piotr Lisik博士、Delphine Crappe博士、Charles McGurk博士(Skretting水产养殖创新AS的员工)披露了对产品的兴趣(gydF4y2BaAquragydF4y2Ba^tmgydF4y2Ba)，由Skretting AS拥有并商业化。gydF4y2Ba

通讯:stacphane BiacchesigydF4y2Ba

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伟德体育在线b施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

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