静脉曲张蛋白影响气道上皮炎症和中性粒细胞募集猪链球菌血清2型感染

猪链球菌血清2型(SS2)经常在猪上呼吸道定殖，可引起猪链球菌病，临床表现为肺炎、脑膜炎和败血症。在此之前，我们已经证明了vimentin(一种中间丝蛋白)参与了SS2穿透气管上皮屏障的过程。侵袭性疾病的发生与ss2诱导的局部过度炎症密切相关;然而，波形蛋白在气道上皮炎症中的作用尚不清楚。本研究表明，在鼻内感染SS2后，vimentin缺陷小鼠表现出肺损伤减轻，促炎细胞因子白介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和IL-8同源物角化细胞衍生趋化因子(KC)的产生减少，肺部中性粒细胞大幅减少。我们还发现，没有vimentin的猪气管上皮细胞(STEC)的转录水平降低il - 6，肿瘤坏死因子-α,引发。SS2感染引起产志在大肠杆菌中vimentin重组，药理学破坏vimentin细丝阻止了这些促炎细胞因子的转录。此外，缺乏vimentin并不能增加与vimentin相互作用的核苷酸寡聚结构域蛋白2 (NOD2)的转录和NF-κB蛋白p65的磷酸化。本研究揭示了vimentin如何促进气道过度炎症，从而加剧气道损伤和ss2诱导的全身感染。

猪链球菌（猪链球菌)是一种革兰氏阳性细菌，是一种主要的猪病原体，可引起败血症、脑膜炎和肺炎，对全球养猪业造成严重的经济损失[1，2]。猪链球菌也是一种新兴的人畜共患病病原体[1]。与病猪有密切接触或食用受污染的生猪肉产品的人会患上链球菌中毒性休克样综合症[3.]。在东南亚国家，如泰国和越南，猪链球菌已成为导致人类脑膜炎的主要原因[3.，4]。基于细菌表面荚膜多糖抗原，猪链球菌分为29种血清型[5，6]。在这些已确定的血清型中，猪链球菌血清型2 (SS2)在临床感染的猪和人病例中分离率很高，被认为是毒性最大的血清型之一[7]。SS2通常在猪的上呼吸道无症状地定植，可通过气道上皮引起全身性炎症[3.]。

气道上皮是先天免疫的重要前哨和效应体[8]。发现入侵的病原体或多种刺激导致气道上皮释放促炎和趋化细胞因子，促进白细胞入侵[9，10]。气道上皮细胞信号级联的激活导致细胞因子和趋化因子如IL-6、CXCL5、CXCL8 (IL-8)和CXCL10的产生[11，12，13]。这些细胞因子和趋化因子促进树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞聚集到感染部位，以消除入侵的病原体[14]。适当的炎症反应有利于维持体内平衡，而过度的炎症会加重气道损伤，促进全身感染[15，16]。虽然已经研究了SS2引起的全身性炎症，但气道上皮协调SS2引起的气道炎症的分子机制尚不清楚。

我们最近发现，III型中间丝蛋白(IF)家族蛋白vimentin是SS2穿透小鼠气道上皮所必需的[17]。细菌通过气道上皮的渗透是由于上皮屏障的通透性增加，过度的炎症反应是影响屏障通透性的重要因素之一[18，19]。作为一种细胞骨架蛋白，vimentin参与维持细胞形态、细胞的机械完整性和细胞分化[20.]。大量研究表明，波形蛋白还可以作为信号分子的支架。先前的研究表明，vimentin与磷酸化的ERK结合以阻止去磷酸化[21]。结肠上皮细胞细胞膜上波形蛋白LRR结构域与核苷酸寡聚结构域蛋白2 (NOD2)相互作用，调控其活性及下游NF-κB信号传导[j]。22]。然而，波形蛋白在ss2诱导的气道上皮炎症中的作用尚未得到很好的表征。

我们的研究发现，与野生型小鼠相比，ss2感染的vimentin敲除小鼠的肺损伤和中性粒细胞减少，并且vimentin敲除猪气管上皮细胞(VIM KO STEC)和感染的vimentin缺失小鼠肺部的促炎细胞因子水平显著降低。此外，适当的波形蛋白定位对促炎细胞因子和趋化因子的产生至关重要。最后，vimentin通过增加NF-κB的转录来调节NF-κB的活化NOD2调节细胞因子和趋化因子的产生，从而促进SS2引起的气道损伤和全身性感染。

细菌菌株和细胞系

的猪链球菌血清2型(SS2)毒力菌株ZY05719是在2005年中国四川省的一次链球菌病暴发期间从死猪中分离出来的。SS2在Todd-Hewitt Broth (THB, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)中生长至中对数相(600 nm (OD)的光密度)₆₀₀)为0.4-0.8)，温度为37℃。然后，用PBS洗涤三次，并在DMEM中重悬，除非另有说明。

为获得敲除vimentin的猪气管上皮细胞(VIM KO STEC)，将含有重组lentiCRISPR质粒的慢病毒感染STEC，采用Western blot和免疫荧光法检测其单克隆[17]。VIM KO STEC和STEC在高糖Dulbecco修饰Eagle培养基(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)中培养，添加10%热灭活胎牛血清(FBS, Gibco)， 5% CO2, 37℃。细胞用胰蛋白酶消化传代或实验。

动物实验

4 ~ 6周龄野生型C57BL/6J (VIM)^+/+)和蛋白敲除(VIM)^−−/)小鼠购自GemPharmatech(中国南京)。所有小鼠均饲养于南京农业大学实验动物中心屏障环境中。在小鼠鼻内感染模型中，SS2可在感染后24小时穿透气管上皮引起全身感染[17，23]。基于此模型，6个VIM^+/+老鼠或六个VIM^−−/将小鼠随机分为两组，分别鼻内接种PBS或SS2 (1 × 10)⁹CFU) 24小时。

组织病理学分析

组织病理学分析，将小鼠肺固定包埋于石蜡中制成石蜡块，切片后进行苏木精和伊红(H&E)染色或中性粒细胞免疫组化。

支气管肺泡灌洗液(BALF)分析

采用24g支气管肺泡针导管定量测定小鼠半壁淋巴细胞中性粒细胞。从气管插入导管，注射500 μL无菌PBS获得灌洗液。该过程重复3次。离心收集灌洗液中的细胞小球，室温下用氯化铵钾(ACK)红细胞裂解缓冲液处理3min。离心后，1 × 10⁶细胞与FITC抗小鼠CD11b和APC抗小鼠Ly-6G (r-1)抗体(Proteintech，武汉，中国)在4℃下孵育1小时。PBS洗涤后，使用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman, Indianapolis, IN, USA)计数。数据通过FlowJo V10软件(Tree Star Inc.， San Carlos, CA, USA)进行分析。

RT-qPCR

全肺VIM匀浆^+/+小鼠和VIM^−−/用TRIzol (Vazyme Biotech Co.， China)裂解SS2感染2 h的小鼠、STEC和VIM KO STEC，按照制造商提供的方案提取总RNA。利用Vazyme Biotech Co.的HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+ gDNA wiper)合成cDNA。cDNA用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech Co.)在7300 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)上扩增。qPCR所用引物序列如表所示1。表达式归一化为GAPDH与未感染细胞相比，使用2^−ΔΔCt方法(24]。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

使用商用ELISA试剂盒(Fankewei, Shanghai, China)根据制造商的说明，测定ss2感染小鼠全肺匀浆中小鼠IL-6、TNF-α和KC蛋白的浓度。每个独立实验进行三次分析。

SS2对产志贺毒素大肠杆菌细胞膜波形蛋白的影响

用SS2 (MOI 50:1)感染六孔板中的合流产志在大肠杆菌，然后在37°C 5% CO中孵育₂在指定的时间。采用膜和胞质蛋白提取试剂盒(KeyGEN Biotech，南京，中国)分离产志异大肠杆菌的膜蛋白。将提取的蛋白变性，然后进行SDS-PAGE。

西方的屁股

不同处理的STEC或VIM KO STEC用冷PBS洗涤，用RIPA(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂)(KeyGEN Biotech，南京，中国)在冰上裂解5分钟。将RIPA裂解缓冲液(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂)加入100 mg肺组织片段中，提取小鼠肺组织蛋白。使用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)测定蛋白浓度。SDS-PAGE分离后，将聚丙烯酰胺凝胶上的目标蛋白条带剪切，采用半干转移法转移到PVDF膜(Millipore, Darmstadt, Germany)上。用3%牛血清白蛋白(BSA)在TBST中阻断膜2小时。然后，将膜与适当的一抗在4°C下孵育过夜，然后在室温(RT)下孵育相应的二抗1小时。使用ECL Femto-Detect™Western Blotting Substrate (Engibody Biotechnology)检测免疫印迹，并在ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-rad)上成像。

所用抗体信息如下:抗vimentin兔多克隆抗体(1:2000;猫。编号10366-1-AP)购自Proteintech;NF-κB p65 (L8F6)小鼠单克隆抗体(mAb) (1:2000;猫。编号6956T)购自Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA);phospho-NF-κB p65 (Ser536)兔多克隆抗体(1:1000;猫。不。TA2006)购自Abmart(中国上海); anti-GAPDH mouse mAb (1:5000; Cat. No. AT0002), anti-beta actin mouse mAb (1:5000; Cat. No. AT0001), HRP-conjugated goat anti-rabbit (1:5000; Cat. No. AT0097) and goat anti-mouse IgG antibody (1:5000; Cat. No. AT0098) were purchased from Engibody Biotechnology (Milwaukee, WI, USA).

免疫荧光染色

不同处理后，用PBS洗涤三次盖盖上生长的产志异大肠杆菌。细胞在冷甲醇中固定20分钟，用3% BSA封闭2小时。细胞用抗vimentin兔多克隆抗体(1:400,Proteintech，中国武汉)在4°C下孵育过夜，然后用DyLight 488偶联的山羊抗兔IgG抗体(1:400,Abbkine，中国武汉)在RT下孵育1小时。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI, Beyotime，中国南京)染色。盖片使用延长金抗褪色试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)固定，并用荧光显微镜(Axio Observer 7;LD Plan-NEOFLUAR 40 × /0.6;德国蔡司)。

WFA的功效

采用2.5 μM或5 μM WFA (MCE, China)预处理STEC 1 h，然后以50:1的MOI感染SS2 2 h。采用免疫荧光、RT-qPCR或Western blot检测vimentin分布、促炎因子、趋化因子转录或NF-κB活化情况。

统计分析

采用GraphPad Prism 7软件(La Jolla, CA, USA)进行统计分析。所示数据为三个独立实验的平均值±标准差(SD)。根据正态性检验，两组之间的差异由一个未配对确定t以及。采用单因素方差分析加Dunnett多重比较检验或双因素方差分析加Sidak多重比较检验确定两组以上的差异。差异被认为是显著的当P< 0.05。

Vimentin促进ss2诱导的肺部炎症和损伤

为了探讨肺炎症反应是否需要波形蛋白，野生型C57/BL6J (Vim^+/+vimentin基因敲除C57/BL6J (Vim^−−/)小鼠鼻内攻毒1 × 10⁹CFU SS2, H&E染色观察肺炎症及损伤情况。组织病理学检查显示，感染Vim的肺部^+/+与Vim相比，小鼠有更多的支气管周围炎症细胞积聚和更严重的肺泡损伤，表现为间质水肿、肺泡塌陷和出血^−−/老鼠(图1A和B)。

我们试图确定Vim^−−/小鼠显示促炎细胞因子的转录减少il - 6，肿瘤坏死因子-α和趋化因子KC通过RT-qPCR检测。如图所示1C-E，转录水平白细胞介素- 6（il - 6），肿瘤坏死因子（肿瘤坏死因子-α),keratinocyte-derived趋化因子（KCss2感染Vim肺中的IL-8同源物^−−/明显低于Vim的肺^+/+老鼠。酶联免疫吸附试验(ELISA)显示，ss2感染Vim制备的全肺匀浆中IL-6、TNF-α和KC蛋白含量显著增加^+/+老鼠(图1F-H)。综上所述，这些结果表明，静脉蛋白的缺失可以预防小鼠的肺损伤和炎症。

波形蛋白缺乏抑制气道上皮中性粒细胞的募集

中性粒细胞一直被认为在SS2感染引起的炎症反应中起主要作用[25，26]。我们想知道ss2感染的Vim肺中募集的中性粒细胞数量是否有差异^+/+和Vim^−−/老鼠。SS2感染后，肺中中性粒细胞标记物Ly-6G的免疫组化显示Vim肺中大量中性粒细胞积聚^+/+而相对较少的中性粒细胞被招募到Vim的肺部^−−/老鼠(图2A).为了进一步量化中性粒细胞向肺的募集，我们对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行了系统的流式细胞分析。Vim^+/+SS2刺激小鼠BALF中性粒细胞明显高于SS2刺激小鼠Vim中性粒细胞^−−/老鼠(图2B)。

为了探究vimentin是否在气管上皮细胞产生细胞因子中起作用，我们用SS2感染VIM KO STEC和STEC 2 h，观察SS2的转录水平il - 6，肿瘤坏死因子-α,引发RT-qPCR检测。转录水平il - 6，肿瘤坏死因子-α,引发VIM KO中STEC含量明显低于STEC(图2)2一部);然而，转录il - 6，肿瘤坏死因子-α,引发仍然在VIM KO STEC中被诱导，这表明vimentin是参与气道炎症的一个因素。这些数据表明上皮细胞的波形蛋白促进细胞因子的产生。

猪气管上皮细胞对SS2感染的反应中的波形蛋白重组

采用Western blot和RT-qPCR检测SS2感染STEC后vimentin的表达。结果表明，vimentin的总蛋白水平和vimentin的转录水平波形蛋白在感染期间(1-4 hpi)，基因在所有时间点都没有改变1，2）.

波形蛋白的分布参与了各种致病菌的感染[27，28，29]。为了可视化波形蛋白在气管上皮细胞中的定位，我们对未感染和ss2感染的STEC进行了免疫荧光染色。我们观察到，在未感染的STEC中，波形蛋白存在于整个细胞质中，而在ss2感染的STEC中，波形蛋白失去了其均匀的中间纤维结构，聚集在细胞膜的一侧(图2)3.A).为了表征vimentin在细胞膜中的分布，我们分析了ss2感染STEC细胞膜中vimentin的时间依赖性表达。如图所示3.B，与未感染的对照组相比，SS2感染显著增加了产志贺毒素大肠杆菌膜上的波形蛋白表达。上述结果表明，SS2可诱导肠毒素蛋白在STEC细胞膜上聚集。

在产志毒素大肠杆菌中，需要适当定位vimentin来转录il - 6，肿瘤坏死因子-α,引发

接下来，我们探讨了在STEC中，是否需要波形蛋白重组来产生由SS2诱导的炎症细胞因子或趋化因子。我们使用vimentin抑制剂withaferin A (WFA)来干扰vimentin中间丝的组装。WFA是一种天然甾体内酯，可与vimentin的保守α-螺旋线圈2B结构域共价结合，抑制其组装[30.]。用不同浓度的WFA处理未感染的产志贺毒素大肠杆菌，以探索破坏产志贺毒素大肠杆菌中弧菌蛋白所需的WFA浓度。如图所示4A, 2.5 μM的WFA足以导致对照细胞内均匀分布的波形蛋白网络呈核周分布，而5 μM的WFA则导致波形蛋白丝完全塌陷。接下来，我们检测了2.5 μM WFA对基因转录水平的影响il - 6，肿瘤坏死因子-α,引发ss2感染的产志贺毒素大肠杆菌WFA预处理可显著降低il - 6，肿瘤坏死因子-α,引发与dmso预处理的细胞相比，SS2感染后产志在大肠杆菌中的表达(图2)4罪犯)。总之，这些观察结果表明，适当的波形蛋白定位对于产志在大肠杆菌中ss2诱导的细胞因子产生至关重要。

vimentin的重组有助于转录NOD2和NF-κB蛋白磷酸化

研究表明，vimentin与NOD2相互作用[22]， NOD2激活核因子NF-κB，导致炎症相关疾病[31]。我们测定了vimentin对转录的影响NOD2在ss2感染的产志贺毒素大肠杆菌和小鼠肺中如图所示5一个,NOD2与VIM KO STEC相比，ss2感染STEC的转录物水平显著增加。类似地,NOD2ss2感染Vim的转录水平^+/+明显高于ss2感染Vim的小鼠^−−/老鼠(图5B).这些实验表明，vimentin是影响NOD2转录的重要因素。

为了进一步阐明vimentin在激活NF-κB中的作用，我们比较了SS2感染对STEC和VIM KO STEC中NF-κB蛋白p65磷酸化水平的影响。我们观察到，ss2感染的STEC磷酸化p65蛋白水平升高(图2)5C).接下来，我们发现失败增加了NOD2使用2.5 μM WFA破坏vimentin细丝后，在STEC中转录和磷酸化p65蛋白(图2)5D, E)。综上所述，这些结果表明vimentin参与了气道上皮NOD2/NF-κB通路的激活。

SS2可通过猪呼吸道引起全身感染[17]。过度炎症和气道上皮屏障通透性增加是SS2感染期间的主要病理生理事件[32]。考虑到SS2穿透vimentin缺失小鼠气管上皮并进入各组织的能力明显降低[17]，我们假设vimentin参与了ss2诱导的过度炎症反应。本研究发现，在SS2感染小鼠和STEC后，vimentin导致肺损伤、中性粒细胞数量、促炎细胞因子和趋化因子的表达。我们进一步的研究表明，为了在气道上皮中产生中性粒细胞趋化因子，波形蛋白的适当分布是一个独特的要求。在STEC中敲除Vimentin和药理学破坏Vimentin纤维未能增加NOD2和磷酸化p65蛋白的表达。这些结果证实了vimentin通过NOD2/NF-κB信号通路在ss2诱导的气道炎症和全身性感染中起核心作用。

我们最近的研究发现，波形蛋白通过与SS2的自溶素相互作用促进细菌渗透气管上皮[17]。在这里，我们进一步证明了vimentin促进了中性粒细胞趋化因子的表达和ss2感染气道上皮的肺损伤。气道上皮和免疫细胞产生的细胞因子负责将中性粒细胞募集到感染部位[35]。我们认为气道上皮内的波形蛋白与免疫细胞的募集有关。vimentin参与细胞因子的转录这一事实支持了这一观点il - 6，肿瘤坏死因子-α和趋化因子引发在STEC。在小鼠感染模型中，肺中性粒细胞的减少可能部分与气道上皮趋化因子的产生减少有关。据报道，Vimentin也可调节细胞迁移[36，37]。vimentin缺失小鼠肺中性粒细胞减少的另一个可能机制可能是中性粒细胞迁移能力降低。将需要进一步调查，以确定所涉及的这些机制的确切贡献。

由于vimentin缺失小鼠表现出较少的肺病理损伤，我们推测不能产生细胞因子导致了这种保护。Vimentin参与了ss2感染小鼠肺部促炎因子IL-6、TNF-α和趋化因子KC的转录和产生。近年来，vimentin的动态作用也得到越来越多的证实。除了作为细胞骨架蛋白维持细胞形态外，波形蛋白的免疫功能也越来越得到证实。Vimentin与NLRP3炎性小体的组分相互作用，是巨噬细胞中炎性小体激活所必需的[38]。磷酸化的vimentin激活TGF-β信号，导致肺腺癌转移和PDL1表达，免疫抑制[j]39]。活化的人巨噬细胞分泌的胞外波形蛋白促进了细菌的杀伤和氧化代谢物的产生[40]。考虑到过度的炎症反应导致屏障渗漏[18，41]，波形蛋白在SS2引起的气道炎症中的作用可能与其作为自溶素受体的作用协同，增加气道上皮的通透性，从而促进SS2引起的全身感染。

在气道中，巨噬细胞和树突状细胞(DC)等组织常驻免疫细胞防御空气传播的病原体，并产生促炎细胞因子，进而招募树突状细胞、单核细胞衍生的巨噬细胞和中性粒细胞[42]。虽然这些专业免疫细胞在炎症反应中起主要作用，但气道上皮细胞也通过释放各种炎症介质和细胞因子/生长因子积极参与协调先天和适应性免疫反应[43，44]。与小鼠感染模型结果一致，产志毒素大肠杆菌中的vimentin参与了il - 6，肿瘤坏死因子-α,引发。上皮细胞因子的产生减少可能是Vim气道中性粒细胞募集不良的原因^−−/使小鼠免于肺部炎症和损伤。值得注意的是，与未感染的细胞相比，VIM KO STEC中促炎细胞因子的转录仍然增加，这表明vimentin只是气道上皮中影响促炎细胞因子的一个因素。

作为一种主要的细胞骨架蛋白，vimentin历来被认为是一种调节细胞力学、运动和细胞内信号传导的细胞质蛋白[45]。越来越多的证据表明，细胞表面维门蛋白与宿主-病原体相互作用有关，从而促进病毒或致病菌(如SARS-CoV-2)的粘附、进入或运输。单核细胞增多性李斯特氏菌脑膜炎大肠杆菌K1 [27，29，46]。有趣的是，我们发现vimentin聚集在ss2感染的STEC细胞膜上。vimentin簇与气道上皮促炎细胞因子的产生有关，这与vimentin在脑内皮细胞趋化因子产生中的作用类似[47]。

呼吸道病原体引起气道上皮炎症的潜在机制似乎不同[13，48，49，50]。在本研究中，vimentin促进了NOD2产志贺毒素大肠杆菌和小鼠肺部据报道，vimentin与NOD2结合[22]，而NOD2是随后rip2依赖的NF-κB信号激活所必需的，这是一种经典的炎症相关途径[51，52，53]。研究人员发现，由于在STEC中缺失vimentin或破坏vimentin细丝无法激活NF-κB信号传导，因此vimentin参与了NF-κB蛋白p65的磷酸化。研究表明，vimentin通过调节NLRP3炎性小体来调节肺部炎症[38]并作为各种信号分子的支架来调节信号通路[21，30.]。vimentin对气道炎症的确切作用将是未来研究的主题。我们的研究结果揭示了vimentin在SS2感染过程中通过NOD2/NF-κB信号通路促进过度炎症和肺损伤的分子机制，并进一步支持了人脑微血管内皮细胞vimentin参与B组脑膜炎发病机制的研究链球菌(GBS)(38)。由各种细菌和病毒引起的气道过度炎症和随后的全身性感染在世界范围内造成了广泛的死亡率和发病率，严重威胁着公众健康[54，55]。我们的研究揭示了vimentin可能在其他药物引起的气道炎症中发挥同样的作用，为开发vimentin作为气道感染的潜在治疗靶点提供了理论基础。

本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章(及其附加信息文件)中。

猪链球菌：

猪链球菌

SS2:

猪链球菌血清型2

STSLS:

链球菌中毒性休克样综合征

il - 6:

白细胞介素- 6

肿瘤坏死因子-α:

肿瘤坏死因子

余:

keratinocyte-derived趋化因子

STEC:

猪气管上皮细胞

Vim ko stec:

Vimentin敲除猪气管上皮细胞

NOD2:

核苷酸寡聚结构域蛋白2

如果:

中间丝

那有:

Todd-Hewitt肉汤

OD₆₀₀：

600 nm光密度

DMEM:

Dulbecco改良Eagle培养基

VIM^+/+老鼠:

野生型C57BL/6J小鼠

VIM^−/−老鼠:

Vimentin敲除小鼠

):

苏木精和伊红

BALF:

支气管肺泡灌洗液

ELISA:

酶联免疫吸附试验

BSA:

牛血清白蛋白

RT:

室温

DAPI:

4, 6-Diamidino-2-phenylindole

SD:

标准偏差

我们感谢王庆(中国安徽农业大学)的有益讨论。

国家重点研发计划项目(2021YFD1800400)、国家自然科学基金项目(31872480)、江苏省农业科技创新基金项目(CX(19)2020)、江苏省高等学校重点学科发展项目(PAPD)资助。

作者及单位

1. 南京农业大学动物医学院，动物卫生与食品安全教育部国际联合研究实验室，南京

   孟宇，林少杰，牛凯，马哲，林慧星，范宏杰

2. 扬州大学江苏省重大动物传染病与人畜共患病防控协同创新中心，扬州

   Hongjie风扇

贡献

YM和HF设计了研究研究。YM, SL和KN进行了实验。YM和ZM分析数据。YM写了手稿。HL和HF对稿件进行了修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Hongjie风扇。

伦理批准并同意参与

所有动物实验均经中国南京农业大学实验动物福利与伦理委员会(njau . no . 20220306028)批准，并按照中国动物福利委员会的指导方针进行。所有的努力都是为了尽量减少动物的痛苦。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

执行编辑:马塞洛·戈特沙尔克

出版商的注意

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