h5n1禽流感病毒在猪中的传染性和传播性

2019年，比利时家禽养殖场爆发了低致病性h5n1禽流感病毒(AIV)，其特点是鸡的死亡率异常高。H1和H3亚型甲型流感病毒可感染猪并在猪群中建立。因此，h5n1动物流行病引起了人们对AIV向猪和从猪向人传播的关注。在这里，我们使用病毒滴定和/或RT-qPCR评估了该病毒在猪呼吸道外植体和猪体内的复制效率。我们还检查了从直接经鼻接种的猪到接触猪的传播。H3N1 AIV在细支气管和肺的外植体中复制到中等滴度，但在鼻黏膜或气管中不复制。在猪感染研究中，仅在接种后1至3天收集的少数肺样本中检测到传染性病毒。病毒滴度在1.7到4.8 log之间₁₀TCID₅₀。与离体实验一致，未从猪上呼吸道分离到病毒。在传播实验中，我们没有发现病毒从直接接种到接触猪的传播。血清抗体滴度仅在接种猪中观察到升高。由此可见，猪呼吸道组织外植体可作为评估aiv在猪体内复制效率的有效工具。这里检测的H3N1禽流感病毒不太可能对猪群构成风险。然而，由于不同的病毒株具有不同的基因型和表型特征，因此有必要对猪中新出现的aiv进行持续的风险评估研究。

流感是一种由流感病毒引起的鸟类和哺乳动物疾病Orthomyxoviridae家庭。流感病毒分为A、B、C和D型，其中A型流感病毒(iav)宿主范围最广。根据表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原特征，iav进一步分为亚型。几乎所有的HA (H1-16)和NA (N1-9)亚型都存在于水生野生鸟类中，而哺乳动物易受有限数量的HxNy组合的影响[1]。

野生水禽是禽流感病毒的天然宿主，它们将禽流感病毒传播给家禽。猪是H1N1、H1N2和H3N2亚型iav的天然宿主[2]，这是世界范围内猪群的地方性疾病。它们是iav生态中最重要的哺乳动物物种，iav在人与猪之间偶尔存在双向传播。此外，猪对实验中几种亚型的aiv易感[3.，4，5，6，7]和自然条件[8，9，10，11，12，13]。

猪也是潜在的“混合容器”，在其中禽流感病毒和猪病毒或人类病毒可以进行重组，即交换它们的基因片段，产生具有新基因型的病毒[3.，14，15，16]。已知的四种大流行病毒中有三种是重组病毒，至少一种起源于猪。事实上，2009年H1N1流感病毒大流行源自猪，是由两只猪、一只鸟和一只人流感病毒组成的四重重组病毒，突显了猪作为人畜共患流感病毒来源的作用[17，18]。

1957年和1968年大流行的iav分别为H2N2和H3N2亚型。这些病毒是当时流行的人类季节性流感病毒与一种提供新型HA亚型的禽流感病毒之间的重组病毒[18]。

虽然1968年重组病毒出现的宿主仍不清楚，但猪对H3亚型的aiv感染很敏感。2001年，加拿大从一头有呼吸道感染迹象的猪身上分离出一种H3N3 AIV [10]。在De Vleeschauwer等人的一项研究中，猪鼻内接种了两种不同的野鸭H3N8分离株。这些病毒由猪经鼻排出2至5天[19]。在两只猪鼻内接种鸭H3N2分离株后，也得到了类似的观察结果。在这种情况下，病毒脱落12小时至5天[20.]。在Kida等人进行的一项研究中，猪接种了38种H2 - H13亚型的aiv，其中包括8株H3分离株。这些不同亚型的大多数aiv引起生产性感染，并在鼻拭子中检测到4至7天，但8种H3病毒中有4种仍未检测到[3.]。

2019年，比利时发生了一起AIV动物流行病。该疾病是由一种H3N1病毒引起的，该病毒从野生水禽传播，并适应于家禽，随后影响了82个蛋鸡、肉鸡和火鸡农场。观察到蛋鸡的死亡率异常高，高达40%，产蛋率降低高达100% [21]。异常高致病性与纤溶酶原用于HA蛋白水解裂解有关。通常，低致病性aiv依赖于胰蛋白酶样蛋白酶裂解血凝素并随后进入宿主细胞，这限制了它们对存在这些蛋白酶的组织的趋向性。H3N1的NA能够招募纤溶酶原进行血凝素切割，促进病毒的全身传播[22]。这次h1n1疫情发生在猪群密集的地区。因此，人们担心H3N1病毒可能从家禽传播给猪，并在猪群中进一步传播。在这项研究中，我们旨在通过猪呼吸道外植体和猪的感染实验，以及猪的传播实验来评估这种溢出的潜在风险。

病毒

A/chicken/Belgium/136/2019 H3N1 (chB19)是从一只有神经系统症状的公鸡的气管中分离出来的胚胎鸡蛋中分离出来的。病毒在有胚的鸡蛋中传代一次。全基因组序列由Oxford Nanopore Technologies MinION测序(登录号:OP765329, OP765352, OP765398, OP417305, OP765492, OP765503, OP765504, OP765508)确定。在MEGA X(10.1.7版本)中进行的序列分析显示，NA的茎部缺失和NA的突变与纤溶酶原募集有关[21，22]。

猪呼吸道外植体感染实验以北美猪适应型iav的代表病毒A/swine/Missouri/A01410819/2014 H3N1 (swMO14)为阳性对照。该病毒是从美国农业部(USDA)获得的，并在Madin Darby犬肾(MDCK)细胞中传代一次。

动物

在离体和体内实验中，分别从一个高健康、iav阴性的商业农场购买了2头和26头4周龄的猪。在实验开始前，将猪饲养在hepa过滤动物单元中，可自由进食和饮水7天。为确认其流感阴性状态，对血清样本进行了A/sw/Belgium/1/98 (H1N1)、A/sw/Gent/172/08 (H3N2)、A/sw/Gent/7625/99 (H1N2)和大流行A/California/04/09 (pH1N1)病毒株的血凝抑制(HI)试验。

猪呼吸道外植体中chB19的体外复制

为了评估chB19在猪呼吸道组织中的复制能力，进行了猪呼吸道外植体离体接种。收集鼻(NE)、气管(TE)、支气管(BE)和肺(LE)外植体，如前所述[23]来自两只4周龄iav阴性猪。在颈静脉注射过量20%戊巴比妥钠，随后出血，使猪安乐死。

简单地说，就是把鼻子锯掉，切开鼻腔。将鼻黏膜与鼻中隔和鼻甲分离，切成25毫米的正方形²。气管被一个垂直的切口分成两部分。气管粘膜与下层软骨分离。将粘膜置于2 mL NTE培养基(青霉素100 U/mL、链霉素0.1 mL/mL、庆大霉素0.1 mg/mL、RPMI + GlutaMAX和DMEM + GlutaMAX按1:1比例)中，置于气液界面的钢网上。

将肺分为左右肺叶。左肺叶的肺组织与支气管机械分离。切取长3mm、直径2mm的支气管切片，置于玻璃培养管中，培养管中加入1ml BE培养基(100u /mL青霉素、0.1 mL/mL链霉素、1µg/mL卡那霉素、0.02 M/ 100ml HEPES、MEM + GlutaMAX)。将试管置于慢速旋转装置上(0.5转/分钟)。

右肺充入1%低胶凝温度琼脂糖，置于4℃，直至琼脂糖凝固。然后将肺切成25mm²1 mL LE培养基(青霉素100 U/mL、链霉素0.1 mL/mL、庆大霉素0.1 mg/mL、胰岛素2.5µg/mL、视黄醇0.5µg/mL、氢化可的松0.5µg/mL、D-MEM + GlutaMAX)。

所有外植体在37℃孵育。培养后24小时(hpc)， NE、TE和LE转移到24孔板上，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。将外植体分别浸泡在600µL含10的培养基中，分三次接种⁶TCID₅₀chB19或swMO14在37℃下加热1小时。之后，用PBS洗涤3次，转移到培养板上。在玻璃培养管中接种并随后洗涤BE。在接种后1、24和48 h (hpi)收集用于病毒滴定的上清样品，并在- 70°C保存直至使用。

在96孔板上对MDCK细胞进行病毒滴定，然后进行免疫过氧化物酶单层测定(IPMA)。将上清样品按1:10顺序稀释，每次稀释50µL加入有MDCK细胞的孔中。培养皿在37℃和5% CO下孵育₂5天。将细胞用4%多聚甲醛固定15 min，用小鼠抗流感核蛋白HB-65单克隆抗体(1:50稀释)孵育2 h，再用山羊抗小鼠辣根过氧化物酶偶联抗体(DAKO;1:1000稀释)。用过氧化氢和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)观察感染细胞，光镜下观察可见感染孔数。病毒滴度，用log表示₁₀TCID₅₀/mL的计算方法由Reed和Muench [24]。

猪感染实验

为了确定chB19的复制效率，将12头猪经鼻接种。接种量为10⁷开斋节₅₀在3ml PBS中加入chB19，用15mm套管连接注射器，每个鼻孔1.5 mL经鼻给药。作为阴性对照的两头猪被安置在一个单独的单位，没有接种。

接种后1 ~ 6天，每天对2头猪实施安乐死，如上所述。实验结束时，对2头阴性对照猪实施安乐死。

尸检时，大体病理检查如前所述[25]。

采集呼吸道样本进行病毒检测:鼻黏膜(呼吸和嗅觉部分)、鼻咽部、软腭、扁桃体、气管(近端和远端)、左右两半肺的顶叶、心叶和膈叶。收集了根尖叶和心叶的样本。

取大鼠鼻黏膜、呼吸部、气管近端及右心肺叶标本进行组织病理学分析。将组织样本置于4%福尔马林中，包埋石蜡，切成5 μm薄片，苏木精和伊红染色，由病理学家检查有无显微镜下病变。根据Balzli等人的一篇论文，对纸巾进行了评分。6]: 0 -正常组织;1 -轻度炎症，轻度浸润和水肿;2局灶性炎症，轻度细胞碎片、水肿、浸润;3 .多灶性炎症，轻度坏死和细胞碎片，中度水肿和浸润;弥漫性炎症，间质浸润，细胞碎片，坏死。

从鼻黏膜嗅部、鼻咽和软腭制备10% (w/v)组织匀浆，从所有其他样品制备20% (w/v)组织匀浆，在PBS中添加10 IU/mL青霉素和10µg/mL链霉素。匀浆保存在- 70°C，直到用于滴定试验和RNA分离。如上所述，在MDCK细胞中进行病毒滴定试验。为了进行RT-qPCR，根据制造商的说明，使用INDICAL BIOSIENCE IndiSpin病原体试剂盒从200µL组织匀质液中分离病毒RNA。

RT-qPCR使用先前发表的一组引物和靶向IAV M基因(IVA-M1-F (AGA TGA GTC TTC TAA CCG AGG TCG)的探针进行;Iva-m1.1r (tgc - aac - atc - TTC - aac - atc);iva-m1-fam (fama - tca GGC CCC CTC - aaa GCC ga-tamra) [26，27]。

每个反应混合物包含1000 nM的IVA-M1-F引物，750 nM的IVA-M1.1R和IVA-M1.2-R引物，125 nM的IVA-M1-FAM探针，12.5µL AgPath-ID一步RT-PCR缓冲液和1µL RT-PCR酶混合(Thermo Fisher Scientific)，每个dNTP 400µM, RNA 5µL，总体积为25µL。

RT-qPCR反应程序如下:45°C 10 min, 95°C 10 min, 95°C变性15 s, 56°C退火20 s, 72°C延伸30 s, 45个循环。

Ct值> 37的样本被认为是阴性的。

猪传播实验

猪中chB19的传播率评估如前所述[19]。按上述方法鼻内接种chB19猪6头，每隔2 dpi将6头接触猪与直接接种猪一起引入单位。

试验开始前7天至14 dpi，每天进行临床检查。监测以下临床体征:抑郁/嗜睡、结膜炎、流鼻涕、打喷嚏、咳嗽、呼吸急促、呼吸困难、腹式呼吸和直肠温度[28]。

收集鼻拭子以评估病毒脱落情况。从接触后0 dpi/0 d (dpc)至14 dpi/12 dpc，每天使用2个人造丝鼻拭子(每个鼻孔1个)收集每头猪的鼻分泌物。将每头猪的两份拭子合并，置于1ml运输培养基中(10%胎牛血清，100 IU/mL青霉素和100µg/mL链霉素，0.1 mg/mL庆大霉素在PBS中)，摇匀1h，在- 70℃保存，直到用于上述滴定试验。从鼻拭子样本中分离RNA，按上述方法进行RT-qPCR分析。直接接种组和接触组分别于0、16/14、23/21、30/28 dpi/dpc采集颈静脉血样进行血清学分析。

测定HI患者血清chB19抗体滴度[j]29和病毒中和试验(VN)试验。血清样品在56℃下热灭活30min。在HI检测之前，将血清与受体破坏酶(RDE)在室温下孵育18小时。然后用柠檬酸钠在56°C下灭活RDE 30分钟。血清样品用马红细胞(hRBC)预处理以去除非特异性凝集素，在PBS中稀释两倍，并与4个血凝单位chB19混合。孵育1小时后，在每个孔中加入0.5%的hRBC，观察是否存在血凝现象。

VN测定方法如前所述[30.用100 TCID孵育两倍稀释的血清₅₀mdck生长的chB19病毒1 h后，浓度为8 × 10的MDCK细胞⁵将细胞/mL加入到病毒-血清混合物中，在37℃下孵育24 h，然后用4%多聚甲醛固定。如上所述，通过IPMA染色观察病毒阳性细胞。

统计分析

采用双因素方差分析(two-way ANOVA)分析chB19和swMO14外植体中病毒滴度的差异，以曲线下面积(AUC)为结果，并对个体猪进行调整。AUC使用假设值0 TCID计算₅₀/mL和24和48 hpi时间点的观测数据。在R(版本4.2.1)中进行分析。

A/Chicken/Belgium/136/2019 (chB19)体外复制效率低，且仅限于支气管和肺外植体

猪IAV A/swine/Missouri/A01410819/2014 (swMO14)作为阳性对照，在所有四种外植体系统中都能有效复制，病毒滴度不断增加，直到48 hpi(图1)1）.

相比之下，传染性chB19病毒在鼻腔和气管外植体中几乎检测不到，病毒滴度低于或接近检测极限。在支气管外植体中观察到chB19病毒滴度在1 ~ 24 hpi之间升高，随后在24 ~ 48 hpi之间降低。同样，肺外植体的滴度在24 hpi时达到峰值，并且在24 - 48 hpi之间没有进一步增加。在支气管和肺移植体中，chB19滴度均显著低于swMO14滴度(p< 0.0001)。

chB19在鼻内感染猪的下呼吸道复制不良且受限

为了评估chB19在猪体内的复制效率和器官亲和性，我们给12头猪鼻内接种10剂量的chB19⁷TCID₅₀。在1 ~ 6 dpi期间，每天对2只动物实施安乐死，并采集上呼吸道和下呼吸道样本进行组织病理学评估和病毒定量。安乐死后，接种了chb19的猪没有观察到明显的肺部病变。

60例上呼吸道样本的MDCK细胞中均未检测到chB19(表2)1;数字2）.相比之下，72个下呼吸道样本中有6个(8.3%)呈chb19阳性。在1 dpi时被安乐死的两头猪的4个肺样本中有2个(50%)分离出病毒，在2 dpi和3 dpi时被安乐死的两头猪的4个肺样本中有1个分离出病毒。在4、5和6 dpi时未检测到感染性病毒。

用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析组织样本是否存在病毒RNA。在10%(6/60)的上呼吸道样本中检测到相对较低量的病毒RNA(阈值周期(Ct) 32.5-36，表1）.相反，54%(39/72)的下呼吸道样本RT-qPCR阳性。

阴性对照猪的组织病理学分析显示鼻黏膜病变很小，气管无变化，右心肺叶轻度炎症(表1)2）.在12头接种了chb19的猪中，5头猪的鼻黏膜出现了轻微的病变，2头猪的气管出现了轻微的病变，所有猪的右心肺叶都出现了轻微到轻度的炎症、浸润和水肿。

综上所述，chB19在猪呼吸道中复制效率低，主要在肺中复制。

chB19不能在猪之间传播

为了确定chB19是否在猪之间传播，在6头猪鼻内接种了10⁷TCID₅₀2天后与6头naïve接触猪关在一起。

在接种chb19的猪中几乎没有观察到任何临床症状。从2 dpi开始，6只动物中有4只出现呼吸急促。1只猪在3和4 dpi时出现发热(40.5°C)。接触组4头猪在8 ~ 13 dpi出现呼吸急促。未见抑郁、呼吸困难、呼吸困难或咳嗽。

直接接种组和接触组的猪鼻拭子中均未检出传染性病毒。大多数直接接种的猪出现血清学应答(表2)3.）.然而，在VN试验中抗体滴度保持≤24，在HI试验中抗体滴度未超过检测限。在接触猪中未检测到HI或VN抗体(数据未显示)。

本研究的目的是确定禽H3N1病毒株chB19在猪中的复制和传播潜力。虽然猪对病毒敏感，但在体外复制仅限于支气管和肺组织外植体，在猪感染研究中仅限于肺。chB19未能从接种的猪传播到接触猪。观察到接种猪的抗体滴度有所增加，但仅达到较低水平。

只有在1 - 3 dpi时采集的猪肺样本在病毒滴定试验中呈阳性，而RT-qPCR进一步分析显示，在较晚的时间点上呼吸道组织和肺中有更多阳性样本。这可能意味着chB19在这些组织中复制，但滴度低于滴定法的检测极限。也有可能在3 dpi后猪呼吸道中存在病毒RNA片段，因为本研究中使用的RT-qPCR不能表明检测到的RNA是否来自感染性病毒。

chB19向下呼吸道的趋向性可以通过猪呼吸道的受体分布和病毒受体结合偏好来解释。虽然上呼吸道和气管主要含有sia α2,6-半乳糖，但肺部同时含有sia α2,6-和sia α2,3-半乳糖[23，31]。chB19的血凝素在226位和228位(226Q, 228G)分别含有谷氨酰胺和甘氨酸，这使得chB19更倾向于与禽类类sia α2,3-半乳糖受体结合[32，33]。1968年大流行H3N2病毒引入226Q和228G突变，降低了其在猪体内的复制效率，表明sia α2,3-半乳糖结合偏好阻碍了aiv在猪体内的复制[j]。34]。

除了受体趋向性外，病毒RNA聚合酶是猪组织中AIV复制潜力的另一个主要决定因素。一些编码聚合酶基本蛋白2的基因突变，如E627K、D701N或G560S/Q591R与T271一起，已被证明可以增加AIV聚合酶的活性，从而增加猪细胞中的病毒复制[35，36]。chB19的PB2基因缺乏这些突变可能是chB19在猪组织中复制不良的一个因素。

在H3N1动物流行病发生之前，发生了两个值得注意的NA基因突变:(1)在氨基酸位置130的糖基化位点丢失，允许纤溶酶原募集并促进鸡的系统复制[22(2) NA柄缺失。后一种情况在禽流感病毒由水禽传染给家禽后常见[37]。较短的NA茎有利于鸡体内的病毒，因为它能增强病毒的复制[38]。同时，NA的截断可以作为其他宿主(如雪貂)感染的屏障。Blumenkrantz等人制造了两种流感病毒，其中含有编码截断或全长禽流感N1和2009年H1N1大流行病毒的7个剩余基因的基因。经鼻内接种雪貂后，全长柄病毒通过呼吸道飞沫和直接接触向未接种雪貂传播，而短柄重组病毒不通过呼吸道飞沫传播。这种差异与粘液渗透和病毒粒子聚集的效率低下有关[39]。观察具有全长NA柄的chB19病毒是否具有更强的复制能力和在猪之间的传播性，将是一项有趣的研究。

chB19在体外呼吸道外植体中的复制模式与体内研究中观察到的相似。这表明，外植体可以常规地用于确定aiv感染猪的潜力，并有助于遵守3r原则(置换、还原、精化)。然而，对不同的AIV分离株进行平行猪和外植体感染实验将需要更多的证据。

本研究中使用的从家禽中分离的H3N1 AIV不会对猪群造成重大风险。然而，不能排除在猪与猪流感病毒同时感染的情况下，即使是复制能力差的H3N1病毒也会发生重组。研究表明，猪适应的内部基因可能会增加猪体内aiv的复制和传播[30.，40，41，42]。进一步研究猪适应内部基因对H3N1病毒传染性的潜在影响，将有助于了解禽流感病毒如何跨越鸟类和猪之间的物种屏障。

本研究中使用的从家禽中分离的H3N1禽流感病毒不会对猪群构成重大风险。然而，需要进行持续的风险评估研究，以确定可能在猪之间感染和传播的aiv。外植体可能是评估aiv在猪体内复制潜力的有用工具，但它们不能取代传播实验。

支持本文结论的数据附在文章中。

我们要感谢Nele Dennequin和Melanie Bauwens出色的实验室协助，Jonathan Vandenbogaerde和Anna Parys在动物实验方面的帮助，Simon Rigby在统计分析方面的建议。我们感谢杰奎琳·金和安妮·波尔曼对chB19病毒进行测序。我们感谢Xavier Saelens教授和Annebel De Vleeschauwer博士对稿件的修改。

本研究已获得欧盟地平线2020研究与创新计划的资助，资助协议编号727922,DELTA-FLU。

作者及单位

1. 根特大学兽医学院转化生理学、感染学和公共卫生系病毒学实验室，索尔兹伯里安133,9820，比利时梅尔贝克

   沃伊切赫·斯塔德耶克和克里斯蒂安·范·里斯

2. 根特大学兽医学院兽医病理学实验室，索尔兹伯里兰133,9820，比利时Merelbeke

   柯恩Chiers

贡献

KVR获得了资金并设计了这项研究。WS进行了离体和体内实验，并进行了实验室分析。WS和KVR分析数据并撰写稿件。KC进行组织病理学分析并提供组织病理学评分。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到克里斯蒂安·范·里斯。

伦理批准并同意参与

实验由根特大学兽医学院伦理与动物福利委员会授权，批准文号为EC2018-87和EC2018-91。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

负责稿件的编辑:stacphane Biacchesi。

出版商的注意

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