过表达人朊蛋白转基因小鼠慢性消耗性疾病的二次传代实验

慢性消耗性疾病(CWD)是鹿、麋鹿、驯鹿和驼鹿等动物的一种朊病毒疾病。人类食用鳕鱼很常见，因此评估CWD向人类传播的潜在风险至关重要。在之前的研究中，我们通过脑内接种检测了CWD在过表达人朊蛋白的转基因小鼠(tg66和tgRM)中的传播。传统的朊病毒检测方法筛选的小鼠均为阴性。然而，在通过超灵敏RT-QuIC试验筛选的88只小鼠中，我们发现了4只tg66小鼠产生不一致的RT-QuIC阳性反应。这些数据可能是假阳性反应、残留输入接种或提示CWD跨物种传播给人类的亚临床感染。需要进一步的实验来了解该模型中朊病毒播种活性的性质。在这篇论文中，用具有弱朊病毒播种活性的小鼠的大脑进行的二次传代实验表明，它们对其他受体tg66小鼠没有传染性。清除实验表明，输入的CWD朊病毒在无法复制朊病毒蛋白的tg66小鼠和PrPKO小鼠体内的播散活性在180天后消失，说明在后期时间点检测到的弱阳性播散活性不可能是残留接种。在连续两次传代后，CWD朊病毒在tg66中未能引起疾病，这表明强大的物种屏障阻止了表达人类朊病毒蛋白的小鼠感染CWD。

慢性消耗性疾病(CWD)是一种朊病毒疾病，或传染性海绵状脑病(TSE)，在鹿、麋鹿、驼鹿和驯鹿等鹿科动物中引起致命的神经变性疾病。CWD最初是在1960年代后期在科罗拉多州和怀俄明州的圈养鹿中被描述的，现在在北美的野生和养殖鹿中都很普遍[1，2]。韩国、挪威和芬兰也报告了CWD，但这些地区报告的患病率要低得多[3.]。在这一点上，从流行地区根除CWD是极不可能的，因为CWD等错误折叠的朊病毒在环境中非常稳定[4，5]，而传播给其他鹿所需的感染剂量极低[6]。随着CWD继续在北美和其他国家蔓延，食用受CWD感染的肉类和子宫颈制品的人数将会增加。幸运的是，到目前为止，并没有经证实的CWD向人类传播的报告[7]。然而，了解CWD对人类健康构成的相对风险对于保护和教育消费者及其衍生产品仍然很重要。

关于CWD能否感染人类的研究主要集中在三个方面:流行病学研究、体外转化模型和体内传播模型[7]。一些流行病学研究已经完成，还有一些正在进行中。这些研究的重点是寻找CWD向人类传播的证据。这类证据的形式可能是发现居住在CWD流行地区的鹿肉消费者中朊病毒疾病的增加，或在高危人群中发现朊病毒疾病发病年龄的任何异常。幸运的是，迄今为止还没有关于鹿肉消费者中朊病毒疾病总体发病率上升的报告，也没有关于不明原因的年轻人患朊病毒疾病发病率上升的报告。

体外和体内模型也已开发出来，以测试宫颈CWD对人类传播屏障的强度。体外研究表明存在一个强大的屏障，但在所有研究中并不是绝对的[7]。体内研究使用非人类灵长类动物模型和转基因小鼠来评估CWD物种屏障。松鼠猴易患CWD，食蟹猕猴则不然。8，9，10，11]。猕猴在遗传上总体上与人类更接近，而且传统上容易感染大多数对人类有益的朊病毒疾病，因此猕猴对CWD感染具有抵抗力的观察结果令人鼓舞。表达人朊病毒蛋白的转基因小鼠已被证明是研究朊病毒疾病传播的一个很好的工具。迄今为止，包括我们在内的八个小组已经测试了表达人类朊蛋白的小鼠对CWD感染的易感性[12，13，14，15，16，17，18，19]。七个小组报告没有强有力的证据表明CWD会传播给人源化小鼠[12，13，14，15，16，17，18]。Hannaoui等人最近发表的一篇文章报道了传播的生物测定证据，但朊病毒感染的初步分类在很大程度上是基于临床症状，而不是一致的朊病毒感染的生化确认[19]。

我们最近的研究发现，我们测试的95%表达人类朊病毒蛋白的小鼠没有CWD传播的证据，但使用超灵敏RT-QuIC试验筛选的88只小鼠中有4只的朊病毒播种活性确实高于基线值[18]。在最初的发表中，我们将这些小鼠归类为不确定的，因为它们既不是阴性的，也不是令人信服的阳性[18]。我们不确定检测到的弱朊病毒种子活性是由于亚临床朊病毒感染、宫颈残余CWD接种、假阳性反应还是正常朊病毒蛋白的自发转化/聚集。在本文中，我们做了额外的实验来更好地了解弱播种活动的来源。在tg66和tg33小鼠中进行了二次传代实验，以确定弱播种活性是否代表真正的传染性，并为CWD适应人类倾向提供额外的时间。还进行了CWD清除实验，以更好地了解接种后输入CWD在大脑中持续多长时间。我们的研究结果表明，在我们最初的实验中观察到的播种活性可能没有输入接种物，并且弱阳性小鼠的大脑物质在第二次传代到表达人类朊病毒蛋白的转基因小鼠时没有传染性，这表明宫颈CWD与人类之间存在很强的物种屏障。

实验小鼠

所有的小鼠都被安置在洛基山实验室(RML)，在一个AAALAC认可的设施中，遵守实验动物护理和使用指南(实验动物研究委员会研究所)提供的指南。实验遵循RML动物护理和使用委员会批准的协议# 2018-052。表达人PrP的tg66转基因小鼠的世代已有描述[9]。Tg66小鼠最初由Richard Rubenstein制造，Robert Rohwer提供给RML。Tg66小鼠具有FVB/N遗传背景，是编码人类朊病毒蛋白M129的转基因纯合子。Tg66小鼠过度表达人PrP的水平比正常生理水平高8 - 16倍，并被证明易患vCJD、sCJD和小鼠适应的22L痒病[9，20.]。Tg66小鼠不表达任何小鼠PrPC。Tg33小鼠表达骡鹿朊病毒蛋白的水平为生理水平的1-2倍，其结构先前已被描述[21]。Tg33小鼠也不表达任何小鼠PrPC。本研究中使用的PrPKO小鼠先前被描述为C57BL10/SnJ-Prnp-/- [22，23不表达任何朊病毒蛋白。自这些论文发表以来，已经进行了额外的育种、回交和单核苷酸多态性(SNP)基因分型，以减少新霉素盒破坏Prnp基因周围129/Ola侧基因的数量，从47.4 mB减少到大约19.1 mB。

接种剂、接种剂及实验设计为第二代实验

为了确定CWD是否在tg66小鼠亚群中引起亚临床感染，我们在两株受体转基因小鼠(tg66和tg33)中进行了二次传代实验。将9只tg66“供体”小鼠脑接种到每品系7-12只的受体小鼠组中(表2)1）.先前根据RT-QuIC数据将选择用于第二次传代的4只供体小鼠大脑归类为不确定，5只供体小鼠先前归类为阴性。用磷酸盐缓冲平衡盐水加2%胎牛血清将供体脑匀浆稀释至1% w/v浓度，并将30µL的体积接种于麻醉的受体小鼠左脑半球。接种后，观察小鼠出现如下临床症状。在安乐死时，收集大脑进行RT-QuIC分析。

接种剂、接种剂及清除实验设计

为了更好地了解接种后CWD的清除动力学，我们用两种不同的CWD脑匀浆疫苗(WTD-1和Elk-2)在脑内接种了三种不同的转基因小鼠菌株[18]。每只小鼠接种WTD-1或Elk-2接种1.2 × 10次⁵或6.0 × 10⁴LD₅₀分别注射一次。三种小鼠品系分别为:1;过表达人朊蛋白2的Tg66小鼠。Tg33小鼠表达的鹿朊蛋白水平略高于骡鹿，对CWD感染高度敏感。PrPKO小鼠没有朊病毒蛋白表达，不能扩增朊病毒。Tg33小鼠为阳性对照，PrPKO小鼠为无复制对照和无PrP表达的基线清除率。Tg66小鼠代表我们在原始传播论文中使用的实验小鼠模型[18]。

用异氟醚麻醉每只小鼠，用27号针将30µL 1% CWD脑匀浆接种于左半球脑内。接种CWD后，各组小鼠分别在7、28、90、180、360和675 dpi(每个时间点每个菌株N = 4-7)的不同时间点实施安乐死，并取脑左半球，RT-QuIC筛选测定朊病毒播种活性。Tg33小鼠仅在180天的时间点进行测试，因为它们在300天左右发展为绝症，并且预计在180天之后将继续提供强有力的RT-QuIC阳性结果。5只tg33小鼠(288-572日龄)、9只tg66小鼠(257-735日龄)和5只PrPKO小鼠(127日龄)的正常未感染对照组织。

临床观察

清除研究和二次传代实验中的所有小鼠由动物护理人员每天观察一次，由朊病毒研究者每周观察3-5次，以评估总体健康状况和观察与朊病毒感染一致的神经体征。在这两项研究中，没有被指定为早期时间点的小鼠几乎观察了它们的整个自然寿命。当小鼠出现需要人道终点的情况(如癌症、皮炎、呼吸困难、慢性眼部病变)或体重减轻和/或与神经系统疾病相符的神经系统体征时，对其实施安乐死。很少有老鼠出现神经系统疾病或消瘦的迹象，而出现症状的老鼠被分散在几组中1）.在清除研究中，没有出现临床和/或年龄相关问题需要安乐死的小鼠在第675天被选择性安乐死，在接种后第665至700天被选择性安乐死。在安乐死之后，大脑被移除，沿着中线切成两半，冷冻起来供以后的诊断分析使用。关于第二代实验中每只小鼠的dpi、临床状态和RT-QuIC结果的详细信息可在附加文件中找到1．

RT-QuIC

RT-QuIC反应采用重组仓鼠90-231 (Ha rPrP)进行。KO2234)作为衬底[18，24]。简单地说，大脑均质，稀释至10%，在2000 rcf下离心1分钟。上清液用0.1% SDS(十二烷基硫酸钠，Sigma)/PBS/N2 (Gibco)连续稀释至10³脑组织浓度。大脑样本只在10岁时进行了测试³随着脑匀浆浓度的升高，稀释可导致测定的抑制[24，25]。将2µL的样品体积加入到含有98µL RT-QuIC反应混合物的黑色96孔透明底板(Nunc)的反应孔中，得到最终浓度为0.002% SDS、10 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、300 mM NaCl、0.1 mg/mL rPrPsen底物、10 μM硫黄素T (ThT)、1 mM乙二胺四乙酸四钠盐(EDTA)。然后用封板膜(Nunc)封板，在50°C下在BMG FLUOstar Omega板读卡器中孵育，在指定的孵育时间内重复震荡1分钟(700转/分双轨道)和休息1分钟。ThT荧光测量(450±10 nm激发和480±10 nm发射);每45分钟取一次平板底部读数。

每次运行的平板阅读器增益是一致的，每次反应中硫黄素T和SDS的浓度也是一致的。我们的平板阅读器上的最大荧光读数是26万个单位。对于所有运行，增益设置为1600。同一阳性对照小鼠的4个重复孔在每个板(tg33 #NM462)上以10³稀释)。此外，以10的速度下了4-12口阴性对照井³在每个盘子上。为了与我们最初的论文一致[18我们使用25小时的截止时间进行分析。如果单个孔在25小时时间点的荧光水平大于阳性对照孔平均荧光值的10%，则认为它们是阳性的。与基线阴性对照井相比，荧光从基线增加到相当于阳性对照样品10%值的水平，通常比基线荧光水平高20-40个标准差。如果≥50%的单个分析孔呈阳性，则单个小鼠为阳性。

对于清除实验，在第7、28和90天的时间点收集的每个脑，用4口独立的井进行筛选，每口井进行10次测试³脑匀浆稀释。在180、360和675 dpi采集的脑在至少两个单独的板上筛选，在不同的日子，每个脑总共8-16个孔。每个样品的阳性孔百分比如图所示1．第二次传代实验tg33和tg66小鼠的大脑以每只小鼠4-12个孔进行筛选(附加文件)1）.

第二代不确定cwd接种tg66小鼠

将朊病毒因子依次传递到其他受体是确定物种屏障强度的有效方法。这一过程为朊病毒在新宿主体内的适应和扩增提供了额外的时间。为了确定第一代实验中接种cwd的小鼠脑组织是否存在亚临床朊病毒感染，我们对tg66和tg33小鼠进行了第二代接种。Tg66小鼠过度表达人朊病毒蛋白，并接种以确定第一次传代观察到的低水平RT-QuIC阳性是否代表真正的人类热带朊病毒传染性。接种表达鹿朊病毒蛋白的Tg33小鼠，检测残余接种量、非适应性朊病毒扩增量[26]，或者双热带朊病毒的潜在作用。

将4只RT-QuIC不确定小鼠和5只RT-QuIC阴性tg66首代小鼠的脑匀浆分别接种至tg66和tg33受体小鼠组(表2)1）.接种后，监测tg66和tg33小鼠是否出现神经症状和/或消瘦。随着小鼠年龄的增长，有几只小鼠确实表现出身体状况的下降，偶尔还伴有虚弱和轻度共济失调。根据在鹿和颈椎病小鼠中观察到的CWD，这些迹象可能与朊病毒疾病相一致，并将这些小鼠归类为TSE疑似小鼠(表1)1）.这种可疑小鼠的低发病率与之前tg66小鼠研究中观察到的情况没有显著不同[18，27这在两岁左右的老鼠身上并不完全出乎意料。很少看到每组中只有几只老鼠出现与朊病毒疾病一致的症状(表1)1和附加文件1）.重要的是，体重减轻、虚弱和步态异常是非特异性体征，它们本身不应被视为朊病毒疾病的诊断。

为了筛选小鼠确认朊病毒疾病，我们使用了RT-QuIC试验。每只tg66和tg33二代小鼠的脑匀浆在至少四个重复孔上筛选。在筛选的178 s代受体小鼠中，没有一只小鼠在筛选的孔中有超过50%的朊病毒播种活性阳性(表2)1详细结果见附加文件1）.未接种的tg66小鼠均未达到>50%孔标准阳性，但少数小鼠有阳性孔(1.3%的反应孔检测为阳性)。总的来说，第二代受体tg66小鼠在1.5%的反应孔中呈阳性(计算自附加文件)1）.如果小鼠由于朊病毒感染而表现出临床症状，我们预计RT-QuIC分析结果将是强烈的阳性结果。实际上，啮齿类动物、动物或患有临床朊病毒疾病的人的脑组织通常可以在RT-QuIC阳性丧失之前被稀释至少10万倍[18，24]。我们的结果与此相反，所有4只不确定小鼠和5只阴性小鼠的传代数据表明不存在朊病毒感染性。这一证据表明，CWD不容易适应为嗜人型朊病毒，也没有检测到任何嗜鹿型CWD的残留传染性。

脑内接种后CWD-prion清除

为了更好地了解脑内注射后CWD的清除和复制情况，我们将两种不同的CWD疫苗(WTD-1和Elk-2)接种给tg66、tg33和PrPKO小鼠，这两种疫苗在我们之前的研究中产生了弱阳性。了解接种后输入朊病毒在脑内感染或播种活性的持续时间对于区分新形成的朊病毒和残留的输入朊病毒至关重要。接种后，在几个时间点对小鼠实施安乐死，并通过RT-QuIC筛选朊病毒播种活性(图2)1和附加文件2）.在感染任一CWD源后，所有tg33小鼠在RT-QuIC测试的7、28、90和180 dpi的井中都有很强的播种活性(图2)1A, B黄色圆圈)。这是意料之中的，因为tg33小鼠表达鹿朊蛋白，易受CWD感染。相比之下，不能扩增朊病毒的PrPKO小鼠，可检测到的朊病毒播种活性从7急剧下降到180 dpi。在180、360和675 dpi时，少数PrPKO小鼠继续在低百分比的井中显示播种活性，但这些数据与未感染PrPKO小鼠的播种活性没有统计学差异(图2)1C)。

tg66小鼠对CWD种子活性的初始清除率与PrPKO小鼠的清除率相似，tg66小鼠在180 dpi处检测到的种子活性最低(图2)1A和B(粉色圆圈)。在180和360 dpi处测量的低水平播种在统计学上与未感染的tg66小鼠相当(图2)15只接种了Elk-2的tg66小鼠在最近的时间点保持在675 dpi的低水平(图2)1相比之下，接种WTD-1的tg66小鼠，在675 dpi下测试，与未感染的tg66小鼠相比，显示出更高的朊病毒播种活性(图2)1A和C)。通过使用Fisher精确t检验比较接种cwd的小鼠与未感染tg66小鼠的单孔数据，对这些小鼠进行了进一步的个体分析。通过这种分析，来自675 dpi的四只小鼠中有两只与未感染的对照组有统计学差异(图2)1一个星号)。这些结果呈弱阳性的小鼠就像我们最初研究中描述为不确定的四只小鼠一样[18]，在这种情况下，很难将其划分为正面或负面。

我们最初的研究旨在通过使用表达人类朊蛋白的转基因小鼠(tgRM和tg66)作为实验模型，测试CWD可能跨物种传播给人类的可能性。原文的初步结论是CWD没有感染转基因小鼠，但结果并不完全清楚[18]。通过RT-QuIC(一种超灵敏的朊病毒播种检测方法)检测，4只未显示出朊病毒感染证据的tg66小鼠部分呈阳性。尽管这种部分阳性接近检测极限，并且其播种活性比临床CWD或CJD个体的大脑低几个数量级，但这些小鼠被归类为不确定，因为我们不确定观察到的朊病毒播种活性是由于亚临床朊病毒感染，CWD阳性接种的残余输入，还是衰老的prp -过表达小鼠自发(不依赖于CWD)形成的朊病毒播种活性。或者假阳性反应。为了进一步验证这些假设，我们进行了第二次传代和CWD清除实验。

从历史上看，朊病毒的连续传代已被用于确定朊病毒的传染性，测试物种屏障的强度(传播性)，并表征新宿主中的适应性朊病毒[28，29，30.]。在我们的研究中，我们对9只接种了cwd的第一代tg66供体小鼠的脑匀浆进行了第二代传代，其中4只小鼠之前被归类为RT-QuIC不确定。我们的第二代实验使用了两种受体小鼠，tg66(人类PrP)和tg33(鹿PrP)，以便我们可以确定适应性(或非适应性)朊病毒的物种趋向性。26，31，32]。我们没有发现任何证据表明朊病毒疾病传播到任何我们的第二代tg66或tg33受体小鼠(表1)1）.在tg66小鼠体内连续两次传代后，CWD未能适应人类热带朊病毒，这表明强大的物种屏障抑制了CWD朊病毒对人类朊病毒蛋白的转化。我们最初实验中不确定的播种活性水平要么低于传播所需的水平，要么不能代表真正的传染性朊病毒。先前的研究表明，RT-QuIC比生物测定法更敏感，能够检测出亚感染水平的朊病毒[24，33，34，35]。

我们的阴性传播数据与许多其他团队一致，他们将天然来源的CWD单次传代到表达人类朊蛋白的转基因小鼠中[12，13，14，15，16，17，18]。相反，我们的数据与另外两组不同。Wang等人使用CWD种子PMCA产品作为接种剂，并报道了100%接种表达人朊蛋白的转基因小鼠的传播[36]。目前尚不清楚与自然条件相比，PMCA复制过程的代表性如何。最近的另一项研究报告了几只接种了cwd的tg650小鼠出现临床疾病[19]。值得关注的是，这些临床小鼠在朊病毒疾病的确认试验(包括免疫组织化学、免疫印迹和RT-QuIC)中没有一致的阳性结果。通常情况下，患有终末期临床朊病毒疾病的小鼠会有朊病毒积累的有力证据。

我们的清除实验结果提供了信息，并显示输入CWD朊病毒播种活性在tg66和PrPKO小鼠中迅速下降，并在180 dpi时达到可忽略不计的水平(图2)1A和B)。该数据表明，除非存在PrP，否则残余接种量不能解释在不确定的小鼠中测量的播种活性^C以某种方式延缓了接种物的清除，即使它没有转化为新的朊病毒播种活性。在PrPKO小鼠中，测量的播种活性在研究期间保持较低，从180到675 dpi，计算出的平均井阳性率为2.7%(7/256个阳性井)2）.这种低水平的阳性孔在统计学上相当于未接种PrPKO的小鼠中测量的1.8%的比率。PrPKO小鼠中朊病毒播种活性的下降并不令人惊讶，因为PrPKO小鼠缺乏朊病毒蛋白，并且无法感染朊病毒疾病，从而形成额外的朊病毒播种活性。在tg66小鼠中，由于在675 dpi处发现了额外的不确定小鼠，因此数据不太清楚。

我们在PrPKO小鼠中观察到的朊病毒清除率与Bueler等人、Prusiner等人和Sailer等人的报道相似，即在接种啮齿动物痒病朊病毒后数天至数周内迅速下降至低于生物测定检测限[37，38，39]。Race等人的研究显示，清除时间更长，他们报告仓鼠瘙痒病在PrPKO小鼠体内的传染性持续了217天，但在330天就没有了[40]。在非准许宿主中接种500天后，报告了CWD和RML痒病朊病毒的清除，但没有测试500天之前的详细时间点[26]。Beringe等人报道了使用sCJD的PrPKO小鼠中最长的朊病毒持续时间。他们的数据显示，接种后450-700天，传染性和RT-QuIC播种活性都保持不变[41]。显然，接种后朊病毒的持久性取决于接种物中朊病毒的菌株和滴度，在评估传播结果时必须考虑这些因素。

根据我们未感染的对照小鼠和93 s传代tg66小鼠的数据，RT-QuIC检测结果在不确定小鼠中解释播种活性的假阳性可能性似乎不太可能。未接种PrPKO和tg66小鼠的单孔数据分别为1/56和1/80，计算假阳性孔率分别为1.8%和1.3%。基于未感染对照小鼠的136个测试孔，我们的分析中单个孔反应的假阳性率约为1.5%。在数学上，使用1.5%的发生率和4个重复反应，我们确定正常样本具有≥50%阳性井的累积二项概率为0.132%。这种极低的概率表明，在不确定的小鼠中观察到的接近50%的阳性井率不太可能是假阳性反应的结果。除了我们未接种的对照小鼠外，在第二代实验中接种的93只tg66小鼠的计算阳性孔率也为1.5%(6孔/ 392孔测试)(附加文件)1）.整个93 s传代受体tg66小鼠未发生朊病毒疾病，大多数小鼠在> 600 dpi时被选择性安乐死。没有小鼠有足够的RT-QuIC阳性井数据来将其归类为阳性或不确定，只有非常罕见的阳性井反应(1.5%的井)(附加文件)1）.在93只高龄tg66小鼠中观察到极其罕见的阳性孔，这一额外的观察结果支持了在第一代不确定小鼠中测量的播种活性不是由于假阳性反应。

总之，我们目前的研究证实，即使在第二代传代中，接种了cwd的人源化小鼠也没有发生朊病毒疾病。我们的发现也使我们能够消除我们之前对不确定的RT-QuIC数据的大多数解释。RT-QuIC中的残留接种和假阳性反应都不是可能的解释。单次传代后亚临床感染仍有可能。然而，在第二次传播后没有发现传播的证据。目前尚不清楚这种传播失败是由于感染性水平不足，还是由于适应不良或自发转化的朊病毒无法在哺乳动物宿主的生命周期内传播感染。无论解释如何，tg66小鼠在我们的实验中似乎是CWD传播的终端宿主。尽管这一结果令人鼓舞，但人类食用受cwd感染的鱼仍需谨慎。我们在实验室的研究是有限的，几乎不可能测试所有可能不同的CWD菌株组合对抗人类朊病毒基因型的许多变异。

支持本文结论的数据集包含在本文和另外两个文件中。这些实验的脑组织匀浆可按要求从通讯作者处获得。

我们感谢dr。凯瑟琳·黑格、克莱顿·温克勒和拜伦·考希对手稿的评论;Robert Rohwer和Richard Rubenstein因tg66转基因小鼠获奖，Jeffrey Severson因多年的畜牧业获奖。

开放获取基金由美国国立卫生研究院(NIH)提供。这项研究得到了美国国立卫生研究院(NIH)的内部研究项目的支持，即国家过敏和传染病研究所。

作者及单位

1. 美国国立卫生研究院国立过敏和传染病研究所落基山实验室持续性病毒性疾病实验室，美国MT汉密尔顿南四街903号，59840

   Brent Race, Chase Baune, Katie Williams, James F. Striebel, Andrew G. Hughson和Bruce Chesebro

贡献

BR构思了这项研究，进行了动物实验，解释了结果并起草了手稿。CB和KW进行了实验和诊断分析，并帮助起草了手稿。JS帮助概念化研究并解释结果。AH提供RT-QuIC试验所需的重组蛋白和技术支持。英国广播公司帮助构思了这项研究。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到布伦特竞赛．

伦理批准并同意参与

所有的实验小鼠都被安置在洛基山实验室(RML)的aaalac认可的设施中，遵守实验动物护理和使用指南(实验动物研究委员会研究所)提供的指南。实验和住房遵循RML动物护理和使用委员会批准的协议# 2018-052。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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