肝片吸虫绵羊的primoinfection和reinfection在早期和晚期在肝脏和肝淋巴结中驱动不同的Th1/Th2/Treg免疫反应

在原感染和再感染绵羊的肝脏和肝淋巴结(HLN)中，定量测定了促炎(IL-1β， IFN-γ， TNF-α)和调节(IL-10, TGF-β， IL-4)细胞因子以及转录因子FoxP3的表达肝片吸虫早期(感染后4、8和16天[dpi])和晚期(100 dpi)阶段。在原蛋白感染后的早期，肝脏产生Th2免疫反应f .属的植物诱导IFN-γ下调，随后是Th1/Th2/Treg反应，尽管晚期以Th1/Th2免疫介质的表达为特征。相反，在再次感染的绵羊中，在早期阶段发现了强大的Th1/Th2/Treg混合免疫反应，而在晚期，我们观察到Th2/Treg免疫反应克服了Th1免疫介质的表达。然而，与肝脏相比，HLN显示出完全不同的Th1/Th2/Treg表达谱。Primoinfections与f .属的植物在HLN中诱导早期Th1/Th2/Treg混合环境，在晚期建立Th2免疫反应。然而，再感染的绵羊在早期表现出与肝脏中Th1/Th2/Treg相反的IL-4表达的Th2免疫反应，而在后期，再感染绵羊的HLN表现出混合的Th1/Th2/Treg免疫反应。这是首次发表免疫介质在再感染绵羊肝脏和HLN中的表达属的植物。自然宿主对靶器官的免疫反应的研究直接暗示了疾病的发展f .属的植物对更好地了解片膜硬化的免疫发病机制至关重要，是开发有效疫苗的关键因素。

片吸虫病，又称肝吸虫病，是由片吸虫属吸虫引起的。肝片吸虫是感染牲畜的寄生虫分布最大的地区之一，在许多国家每年造成巨大的经济损失[1，2，3.］．此外，片状吸虫病是一种人畜共患病，在全世界具有重大的经济和公共卫生重要性，世界卫生组织认为它是一种重新出现的被忽视的热带病。食源性吸虫病在亚洲和拉丁美洲地区最为流行，因为在这些地区，人们往往不遵守基本卫生措施，而食用生蔬菜或被囊蚴污染的水[4，5］．片状膜硬化的治疗以化学药物的使用为基础，其中最常用的是三氯苯咪唑。然而，它的持续和频繁的用于牲畜治疗已经导致抗药性的出现f .属的植物［6，7］．此外，在许多国家，公众对食品中存在药物代谢物的关注日益增加[8］．在这种令人担忧的情况下，应大力考虑寻找新配方、新化合物和重新利用药物作为片状吸虫病的有效治疗方法。在未来疫苗可能是一种有效的治疗f .属的植物。它们被强调为最合适的选择，因为除了足以控制吸虫外，它们没有显示出药物治疗的缺点[9，10，11］．

自20世纪90年代以来，大量的疫苗试验f .属的植物在文献中有描述，尽管其中只有少数在反刍动物身上进行过[5］．这些配方中使用的候选疫苗，无论是单分子还是组合，在反刍动物中显示出不同的保护水平，范围从0到89.6% [11］．迄今为止，基于使用几种重组抗原(多价疫苗)的疫苗接种显示出有希望的结果和良好的保护水平[12，13，14，15］．疫苗接种f .属的植物这似乎是合适的，但疫苗的保护水平和可靠性还有待提高。这与两个主要方面有关:确定宿主对寄生虫的免疫反应的特征，以及可以在接种疫苗的动物中提供高度保护的寄生虫分子的鉴定[5］．最近，-组学研究f .属的植物对于发现潜在的候选疫苗分子至关重要，这些分子隐含在寄生虫的主要生物学和发育过程中，对宿主-寄生虫相互作用至关重要。此外，深入了解这种肝吸虫的免疫发病机制以及宿主-寄生虫在感染早期和晚期的分子相互作用可能是开发有效配方的决定性因素[5，7］．

的能力f .属的植物成功的感染与它所拥有的具有免疫调节特性的分子的多样性有关。这使得慢性成为由寄生虫诱导的调节环境的后果之一，也是生产有效疫苗的主要障碍[16，17］．的能力f .属的植物下调Th1促炎免疫反应和上调Th2抗炎免疫反应在绵羊感染的早期阶段已被描述[18，19，20.，21，22］．这种情况意味着IFN-γ表达下调和IL-4表达上调，导致Th1促炎免疫反应的抑制和Th2非保护性免疫反应的促进。这种Th2免疫失衡是通过调节细胞因子和调节和/或抑制炎症反应的细胞介导的。IL-10和TGF-β等细胞因子的表达诱导调节环境已被证明是寄生虫和微生物延长生存的常用策略[23，24，25］．FoxP3调节细胞的表达在这种调节环境下增加。FoxP3在受感染宿主中的扩增促进了寄生虫的存活和组织损伤的调节，这在以前已经有过描述[20.，26，27，28］．

本研究的目的是评价用qRT-PCR定量测定原感染和再感染绵羊肝脏和肝淋巴结(HLN)中促炎因子(IL-1β、IFN-γ、TNF-α)和调节因子(IL-10、TGF-β、IL-4)以及转录因子和FoxP3的表达f .属的植物在感染的早期和晚期。对促炎和调节介质的基因表达进行量化，对于理解片状膜硬化的分子、遗传和功能机制至关重要。因此，我们小组最近发表的一项研究已经建立了绵羊中适合感染的内参基因的关系f .属的植物此外，还验证了与促炎介质(如IL-1β和TNF-α)以及IL-10、TGF-β和FoxP3等调控因子相关的其他基因[29］．迄今为止，已发表的关于片膜病中免疫介质基因表达的研究包括反刍动物的初次感染，以及其他包括小鼠模型的再感染[30.］．因此，这是第一个包括肝脏免疫反应的概况和HLN在羊再感染f .属的植物包括早期和晚期，这可以在某种程度上模拟野外发生在牲畜身上的自然感染，与primoninfection相比。

实验设计

44只9个月大的美利奴羊，来自一个无肝吸虫农场，用于这项研究。采用粪便沉降寄生虫卵计数技术每月对动物进行检测，所有病例均为阴性结果。还考虑到没有其他传染病和/或寄生虫病的临床症状。选取4只绵羊作为未感染对照(UC)。40只羊被单剂量的200个意大利菌囊蚴口服感染f .属的植物(Ridgeway Research Ltd, UK)，随后被分为两组(n= 20)。再感染组由20只绵羊组成，在给药9周后，这些绵羊接受了与第一次剂量相同的口服第二剂量。原体感染组由20只经口感染的绵羊组成，与再感染组的第二剂量平行接受一次剂量和200个囊蚴。在给再感染组注射第二剂，给原感染组注射第一剂后，分别在感染后4、8和16天(早期)和100 dpi(晚期)分批处死两组绵羊，每组5只。根据之前看到的细胞因子表达的效应大小来计算各组的大小[20.］．所有动物均静脉注射恩布曲胺(200 mg)和碘化美贝溴铵(50 mg) 7ml安乐死。实验过程中未见不良反应或临床症状。该实验由科尔多瓦大学生物伦理委员会(代码1118号)批准，并根据欧洲(2010/63/UE, Decision 2020/569/UE)和西班牙(L32/2007和RD 1386/2018)关于动物实验的指令进行。

样品采集与处理

在安乐死后，立即对绵羊进行尸检，并从肝淋巴结(HLN)和左肝叶中提取样本。这些样品用焦碳酸二乙酯(DEPC- Applichem, Panreac, Gatersleben-Germany)生物分子水清洗，在液氮中快速冷冻，在液氮中用研锤和杵逐个破坏，并在−80°C保存。

RNA提取和cDNA合成

总RNA从300mg接地组织(肝脏或HLN)均质1.5 mL TRIzol中分离^®试剂(Ambion, life technologies, Carlsbad, CA, USA)使用灭菌IKA^®用RNeasy提取T10碱性均质剂和RNA^®迷你套件(Qiagen, Hilden，德国)根据制造商的指导方针。该方案包括用无rnase的DNase (Qiagen, Hilden，德国)孵育15分钟，最后在65°C孵育10分钟使RNA变性。用分光光度法测定RNA纯度和浓度。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)来确定RNA完整性数(RIN，其值范围从0降解RNA到10完整RNA。只有RNA的RIN值为> 8.5，比A₂₆₀/一个₂₈₀qRT-PCR实验采用约2和free的gDNA。

cDNA分别从每个样品中提取1 μg总RNA，使用iScript™cDNA Synthesis kit (BioRad, Hercules, CA, USA)生成。

引物设计

本课题组设计的引物被用于定量以下基因转录物的表达:HSP90、IL-1β、IL-4、IFN-γ、FoxP3、IL-10、TGF-β和TNF-α [20.，29］．所有引物对都产生了预测大小的扩增子(表1）.

实时PCR绝对定量细胞因子转录

采用50 ng cDNA模板、0.3 μM引物和SsoAdvanced™Universal SYBR进行实时PCR反应，重复3次^®Green supermix (BioRad, Hercules, CA, USA)套件，根据制造商的指导方针。使用MyiQ™2双色实时PCR检测系统(BioRad, Hercules, CA, USA)。循环条件包括在95°C下激活铂Taq 2分钟，然后熔化(15秒，95°C)，退火和延伸(30秒，68°C)，循环40次。40个循环后，进行熔化曲线分析(60-95°C)以验证扩增子的特异性。重复PCR反应产生了高重复性的结果，SEM <平均值的10%(阈值周期数据<1%)。在20 ~ 2 × 10范围内，所有目标均扩增出相同的最佳PCR效率(100%)和较高的线性度(r > 0.99)⁵总RNA输入的pg。每次实验都引入一个已知A170基因转录本数量的IRC (inter-run calibrator) RNA样本，以保证反转录的质量，并检测和去除运行间变异。建立绝对校准曲线，并根据标准曲线的线性回归计算转录分子数。

统计分析

软件IBM^®SPSS^®统计版本21.0。用于统计学研究。每μg总RNA的mRNA分子数用平均值和平均值的标准误差(SEM)表示。进行Kolmogorov-Smirnov检验和saphiroo - will检验，检验数据分布是否服从正态分布。由于数据不呈正态分布，故采用非参数Mann-Whitney U检验。将各感染组(原感染或再感染)与UC组进行比较。此外，在每个时间点对原感染组和再感染组进行比较。P数值< 0.01被认为具有统计学意义P值< 0.05为有统计学意义。

肝脏细胞因子基因表达

促炎细胞因子(IL-1β， IFN-γ， TNF-α)在肝脏中的表达如图所示1。各组细胞因子表达的显著增减情况见表2。在原虫感染的动物中，IL-1β的表达显著增加(P与UC相比，在16 dpi和100 dpi时均< 0.01)。在再感染组，该细胞因子在4 ~ 16 dpi范围内过度表达(P< 0.01)，在100dpi (P< 0.05)。此外，显著差异(P在4、8、16 dpi时，原感染组与再感染组的差异均< 0.01)。primo感染组IFN-γ表达明显下调(P与UC相比，在4 dpi时< 0.01)，在以下时间点或早期或晚期均未观察到变化。然而，该细胞因子在再感染组的表达明显增加(P在4、8和16 dpi时，与UC组和primoinfection组相比均< 0.01)。TNF-α表达显著增加(P与UC相比，primo感染组在8 dpi至100 dpi之间均有< 0.01的表达，同时在再次感染组中有过表达(P与UC组相比，在4至16 dpi观察< 0.01)。显著差异(P原感染组和再感染组之间< 0.01)仅在4 dpi处显示。

调节性细胞因子(IL-10、TGF-β、IL-4、FoxP3)在肝脏中的表达如图所示2。IL-10表达明显升高(P与UC相比，primoinfection组在8 dpi和16 dpi时均< 0.01)，在100 dpi时与UC相比无显著差异。在再感染组，IL-10明显升高(P< 0.01)在所有时间点的峰值为16 dpi。然而，即使观察到IL-10值在100 dpi时下降，与UC相比，IL-10值仍然显著升高。再感染组也有显著增加(P在4 dpi和100 dpi时，与primoinfected组相比< 0.01)。TGF-β在原虫感染绵羊中的表达显著增加(P与UC相比，在8、16和100 dpi时观察到< 0.01)。在再次感染的动物中，该细胞因子的表达显著增加(P< 0.01)。与其他时间点相比，原感染组和再感染组TGF-β基因表达在100 dpi时下降。然而，与UC相比，这些值仍然显著高于UC。4、8 dpi时，再感染动物TGF-β表达明显升高(P< 0.01)，在16 dpi (P与原菌感染组比较< 0.05)。在primoinfected组中，IL-4从4 dpi开始显著且逐渐增加(P< 0.05)至16 dpi在此时间点达到峰值，尽管在100 dpi时出现突然下降，但数值仍然显著较高(P< 0.01)。在再感染组，IL-4显示显著(P< 0.01)在4、8和16 dpi与UC相比过表达。同样，在100 dpi时有显著下降，但数值仍然显著升高(P< 0.01)。比较原感染组和再感染组之间的IL-4表达，在4 dpi时显著升高(P后者< 0.01)，但在16 dpi时IL-4表达显著升高(P前者< 0.01)。在primo感染动物的肝脏中，FoxP3在8和16 dpi时出现过表达(P< 0.01)，同时在4 dpi时，FoxP3略有下调(P< 0.05)。在再次感染的动物中，FoxP3显著(P< 0.01)在早期各时间点肝脏过表达。在100 dpi时，只有再感染组的UC值明显高于再感染组。在4 dpi时，再次感染组与原基因感染组相比，FoxP3明显过表达(P< 0.01)， 8 dpi (P< 0.05)。

细胞因子基因在肝淋巴结中的表达

促炎因子(IL-1β， IFN-γ， TNF-α)在HLN中的基因表达水平如图所示3.。各组细胞因子表达的显著增减情况见表2。与肝脏结果相反，感染HLN的绵羊表现出显著的(P< 0.01) IL-1β在4、8和16 dpi的高表达，在100 dpi时与UC相比没有变化。在再次感染的动物中，IL-1β显著(P与UC相比，< 0.01)在16和100 dpi处过表达。原虫感染组与再感染组的比较显示，在4 dpi时，原虫感染组的表达显著升高(P< 0.05)和8 dpi (P< 0.01)，而再感染组在100 dpi处表现出较高的值(P< 0.01)。所有原感染和再感染的动物在所有时间点都表现出相对于UC的IFN-γ下调。这种下调在4,8,16 dpi时尤其严重(P< 0.01)，与肝脏中IFN-γ的表达相反，在100 dpi (Pprimon感染组< 0.01)。有统计学差异(P在所有时间点，原感染组和再感染组之间< 0.01)。关于TNF-α在HLN中的表达，显著过表达(P在4 dpi和8 dpi时，与UC组相比，primoex感染绵羊出现了< 0.01)。然而，在100 dpi时，显著下调(P与UC组相比，primoinfection组的感染率< 0.01)。相反，再次感染的动物表现出显著下降(P4和16 dpi均< 0.01)，显著过表达(P与UC相比，在100dpi时< 0.01)。这些结果与TNF-α在肝脏中的表达相反。通过对原虫感染组和再感染组的比较，发现原虫感染羊在4、8和16 dpi处有过表达(P< 0.01)，而在100 dpi时表达显著升高(P再感染组< 0.01)。

调节性细胞因子(IL-10、TGF-β、IL-4、FoxP3)在HLN中的表达见图4。在原体感染组，IL-10水平逐渐显著下调(P从8 dpi开始< 0.01)，而再次感染的绵羊则显著降低(P< 0.01)在4、8和16 dpi时的UC。原体感染组显示显著减少(P在100 dpi时，与再感染组相比，< 0.01)，同时，再感染组明显降低(P在4 dpi和8 dpi时，该细胞因子的表达与原虫感染绵羊相比< 0.01)。关于TGF-β，尽管过度表达(P在8 dpi时，primo感染组出现< 0.05)，显著降低(P与在肝脏中发现的结果相反，在16和100 dpi时对UC观察到< 0.01)。此外，大幅下调(P在再感染4 ~ 16 dpi的绵羊中，该细胞因子的表达< 0.01，与肝脏的结果相反，同时，该细胞因子在肝脏中显著过表达(P在100 dpi时< 0.01)。原感染组与再感染组的比较显示:PTGF-β在原始感染动物4,8,16 dpi时的表达明显高于再感染动物，而在100 dpi时，该细胞因子的表达显著高于再感染动物(P在再感染组中< 0.01)。IL-4的表达在感染早期阶段(4,8,16 dpi)与UC组相似，在原虫感染和再感染组中，IL-4的表达在感染早期阶段(4,8,16 dpi)与肝脏相似，而在100 dpi时，只有原虫感染的动物保持过表达(P< 0.01)的细胞因子。原感染组和再感染组之间的比较显示，在4 dpi时IL-4表达较高(P再感染组< 0.01)，而先感染组在16 dpi时出现过表达(P< 0.05)和100 dpi (P< 0.01)。FoxP3表达明显增加(P在原虫感染的动物中，4、8和16 dpi均< 0.01)，但与UC动物相比，显著降低(P与UC相比，在100 dpi时发现< 0.01)。在再次感染的动物中，FoxP3值在4 dpi时显著降低(P< 0.05)，在16 dpi (P< 0.01)与肝脏结果相反，但显著增加(P在100 dpi时< 0.01)。原感染组和再感染组之间的比较显示过表达(P在原虫感染动物的感染早期阶段(4,8,16 dpi)，该细胞因子的表达< 0.01，而在100 dpi的过表达(P< 0.01)发生在再次感染的动物中。

这项工作的目的是量化原始感染和再感染后表达的Th1, Th2和Treg细胞因子f .属的植物在绵羊发育的幼年和成年阶段，重点以肝脏为靶器官，而肝淋巴结(HLN)作为区域淋巴器官直接参与肝脏免疫应答。其他研究评估了促炎细胞因子和调节细胞因子在羊primov感染中的表达f .属的植物［18，20.，28]，并通过再感染大鼠Th1/Th2/Th17/Treg细胞因子的基因表达分析免疫谱[30.］．然而，这是首次量化再感染绵羊肝脏和HLN中Th1/Th2/Treg细胞因子的基因表达谱的研究。

肝脏的prim感染通过IL-4在4 dpi的表达驱动Th2免疫应答的建立，同时FoxP3在这一早期阶段下调。此外，缺乏Th1免疫应答f .属的植物在这个时间点观察到感染与IFN-γ的下调有关f .属的植物。许多研究表明，免疫抑制作用f .属的植物由于抑制IFN-γ表达下调Th1免疫应答[31，32，33，34］．然而，他们中很少有人关注早期阶段f .属的植物绵羊的感染[18，20.]和Pacheco等报道了感染的绵羊肝脏中IFN-γ的基因表达没有显著变化f .属的植物直到18dpi。Th2免疫反应的早期免疫调节f .属的植物克服Th1反应似乎是不可逆的点，允许寄生虫在肝实质内进入和迁移，造成严重的肝损伤。此外，它被认为是一种寄生虫在宿主内存活的机制，而不是导致寄生虫清除的促炎环境[9，21，35，36］．从8 dpi开始，原虫感染绵羊主要诱导Th1/Th2/Treg混合反应，IFN-γ表达无变化，同时其余促炎细胞因子和调节细胞因子以及转录因子FoxP3在感染早期上调。这种Th1/Th2/Treg环境已经被其他作者报道在感染的早期阶段f .属的植物［20.，28，37，38］．FoxP3表达的增加与早期Tregs的扩增相关，这与山羊和绵羊感染该病毒的结果一致f .属的植物或Teladorsagia circumcincta［20.，28，39，40］．

然而，原发性感染后期肝脏的免疫反应表现为混合Th1/Th2反应，包括IL-1β、TNF-α、TGF-β和IL-4等细胞因子的参与，因为在反刍动物和其他物种的急性和慢性阶段已经有报道[18，31，41，42］．treg的缺失，以及后期IL-10的缺失可能是造成严重肝损伤的原因f .属的植物。与早期的Th2相反f .属的植物在初次感染后，在再次感染的绵羊中，从4 dpi观察到一个强大的混合Th1/Th2/Treg免疫反应，并在感染早期建立，其特征是促炎细胞因子(IL-1β， IFN-γ和TNF-α)和调节介质(IL-10, TGF-β， IL-4和FoxP3)的表达。在再感染的早期阶段产生的混合Th1/Th2/Treg免疫反应可能是先前接触的结果f .属的植物诱导早期的促炎和调节免疫反应。有趣的是，与原物感染后的结果相反，IFN-γ在再感染的早期上调。有研究表明，后期绵羊肝脏中IFN-γ含量增加f .属的植物感染可能反映了对组织损伤和肉芽肿形成的反应，而不是对寄生幼虫的反应[18］．由于在再次感染中，成虫在进食过程中会引起肝脏损伤，因此在再次感染组中观察到的较高水平的IFN-γ可能是对成虫和迁徙吸虫引起的组织损伤的反应。以前的研究表明，再感染f .属的植物或f . gigantica虽然结果基于寄生虫学和血液学参数、肝酶测定以及增殖和抗体反应，但与牛和大鼠等其他物种相反，未能刺激绵羊产生任何耐药性或致敏性[43，44］．在这项研究中，我们通过量化促炎细胞因子和调节细胞因子以及转录因子FoxP3的表达，在再次感染中显示了强大的混合Th1/Th2/Treg免疫反应。尽管促进了调节反应，寄生虫诱导了促炎免疫反应，以避免加剧Th2反应，这可能对寄生虫有害[14，45］．类似的，肠道寄生虫Heligmosomoides polygyrusbakeri诱导IL-1β分泌，进而抑制IL-33和IL-25，从而控制过度Th2反应[46］．因此，treg的存在与再感染中IL-10的上调有关f .属的植物证实了寄生虫调节免疫反应以促进其生存的能力。因此，它是蠕虫感染中具有免疫调节剂作用的重要细胞类型[27，47］．TGF-β在感染早期再感染绵羊中相对于原蛋白感染绵羊的过表达可能与慢性病变肝脏中参与的纤维化过程有关[20.，38，48］．

然而，在再感染的后期，由寄生虫协调的Th2/Treg免疫反应更加强大，克服了Th1免疫反应，仅表现出IL-1β的上调，而与所有被研究的调节介质的过表达形成对比。这些结果与啮齿动物模型中慢性阶段再感染的结果一致[30.，49]，尽管在我们的研究中，Tregs的扩增和IL-10的表达依赖于慢性阶段绵羊肝脏的继发感染。

HLN中促炎细胞因子和调节细胞因子的表达与肝脏中不同。Meeusen和Brandon进行的一项研究，1994 [50]的结果表明，抗体分泌细胞只识别存在于淋巴结排出的器官中的寄生虫阶段的抗原，突出了研究绵羊HLN之后产生的免疫反应的重要性f .属的植物初感染和再感染的早期和晚期感染。在原感染绵羊的HLN中，Th1相关细胞因子(IL-1β和TNF-α)在感染早期过表达，而在再感染绵羊中，这两种细胞因子在感染后期高表达。这两种细胞因子在晚期再次感染的绵羊中过度表达可能与诱导促炎免疫反应有关，以防止建立加剧的Th2反应，这可能对寄生虫有害。IFN-γ在研究早期和晚期均下调。IFN-γ在HLN中的下调先前报道在早期和晚期f .属的植物感染(18，51］．肝脏和HLN中IFN-γ水平的抑制表明了这种能力f .属的植物调节细胞因子的分泌初感染和再感染绵羊的IL-10以及再感染绵羊的TGF-β也出现了这种下调。然而，在再感染后期，TGF-β有上调。调节介质IL-4和转录因子FoxP3从4 dpi开始表达，从4 dpi开始为HLN中的原核酸感染提供了混合Th1/Th2/Treg环境。然而，与肝脏结果相反，IL-4在建立Th2免疫反应的主要作用是在primo感染的晚期f .属的植物与Pacheco等人的结果一致。[18］．在这个位置，IL-10, TGF-β和FoxP3等调节免疫介质在原发性感染后期下调f .属的植物。这些结果在绵羊中证实了先前Sachdev等人在牛片状吸虫病中发表的相同的慢性模式。[47在感染后第13周，Th2细胞因子的反应减弱，尽管寄生虫存在于肝脏中，是由IL-4在慢性原虫感染绵羊的HLN中诱导的。

此外，在再次感染的绵羊中，HLN在肝脏中发现的Th1/Th2/Treg与IL-4表达相反，在早期阶段产生Th2免疫反应。甚至在原感染组和再感染组中，IFN-γ都被下调，而在再感染组中，IFN-γ则被过度表达。这一结果与Pacheco等人在HLN中观察到的IFN-γ基因表达水平从1 dpi下降一致。[18］．

与原发性感染绵羊的肝脏和从HLN中获得的结果相反，在再次感染组中，早期阶段的特征是只有IL-4参与的Th2免疫反应。研究的其他促炎和调节细胞因子以及转录因子FoxP3均下调。在再感染后期，HLN表现出由TGF-β、FoxP3、TNF-α和IL-1β的表达主导的混合Th1/Th2/Treg免疫反应。这是首次发表的关于羊HLN再感染的免疫反应的工作f .属的植物在急性和慢性阶段。

综上所述，本研究结果揭示了原病毒感染和再感染绵羊细胞因子表达的一些相关差异，如肝脏中IL-4和FoxP3的表达比原病毒感染绵羊更快更严重地增加，HLN中IFN-γ的表达更严重地下降。再次感染绵羊的这些变化应被认为是促进寄生虫存活的免疫调节机制，这可能是开发针对片状吸虫病的保护性疫苗如此困难的原因之一。然而，与原体感染相比，在再次感染的绵羊中，以两种剂量给予更多的囊蚴，可能在感染的早期阶段发挥差异免疫反应的作用。自自然f .属的植物在放牧期间发生小剂量的重复感染(滴流感染)，利用再次感染的动物可能更有助于研究免疫反应f .属的植物比在迄今为止的大多数研究中使用的primo感染动物要多。

本研究中提供的数据可根据通讯作者的要求获得。

f .属的植物：

肝片吸虫

HLN:

肝淋巴结

il - 1β:

interleukin-1β

干扰素-γ:

γ干扰素

肿瘤坏死因子-α:

肿瘤坏死因子

il - 10:

白介素10

TGF -β:

转化生长因子-β

il - 4:

白介素4

具体:

叉头盒P3

存在:

实时定量逆转录PCR

RNA:

ribonucleinc酸

互补脱氧核糖核酸:

互补的脱氧核糖核酸

Th1:

T助手类型1

Th2:

T助手类型2

Treg:

调节性T细胞

RIN:

RNA完整性数

加州大学:

未受感染的控制

我们感谢Paula V. Huertas-Abril提供的技术援助。

这项工作由西班牙科学与创新部资助(项目AGL2015-67023-C2-2-R和PID2019-108782RB-C21)。目前的工作和VMH受益于安达卢西亚联邦政府的财政资金(项目P18-RTJ-1956)。

作者指出

1. María特蕾莎·鲁伊斯-坎皮略和戴安娜María巴雷罗-托雷斯作为第一作者对本工作做出了同等程度的贡献。

作者及隶属关系

1. Departamento de Anatomía y Anatomía Patológica Comparadas y Toxicología，兽医学院，UIC人畜共患病和紧急情况，大学Córdoba，圣尼达动物大厦，拉巴纳莱斯校区，Ctra。Madrid-Cádiz Km 396, 14014, Córdoba，西班牙

   María特蕾莎·鲁伊斯-坎皮略，戴安娜María巴雷罗-托雷斯，José Pérez & Verónica Molina-Hernández

2. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, university versidad de Córdoba, Edificio Severo Ochoa, Campus de Rabanales, Ctra。Madrid-Cádiz Km 396, 14014, Córdoba，西班牙

   Nieves阿布里尔

3. Sanidad动物部门(Parasitología)，兽医学院，UIC人畜共患病和急诊动物，university versidad de Córdoba, Sanidad动物大厦，Ctra Rabanales校区。Madrid-Cádiz Km 396, 14014, Córdoba，西班牙

   拉斐尔·扎夫拉，莱安德罗·布沃尼，Álvaro Martínez-Moreno &弗朗西斯科·哈维尔，Martínez-Moreno

贡献

构思并设计实验:AMM, JP和VMH。进行实验:MTR、VMH、RZ、FJMM、LB、AMM、JP。实验室工作:MTR, DMBT, NA。统计数据分析:NA, VMH。撰写并修改论文:MTR, DMBT, JP, NA, VMH, RZ, FJMM, LB, AMM。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Veronica Molina-Hernandez。

伦理批准并同意参与

该实验得到了科尔多瓦大学生物伦理委员会(No.1118)的批准，并按照欧洲(2010/63/UE, Decision 2020/569/UE)和西班牙(L32/2007和RD 1386/2018)关于动物实验的指令进行。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

处理编辑:Frank Katzer。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。

转载及权限