层粘连蛋白结合蛋白gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba血清2型影响锌获取和细胞因子反应gydF4y2Ba

猪链球菌gydF4y2Ba血清2型是一种重要的猪致病菌，给世界范围内的养猪业造成了巨大的经济损失。关于感染的发病机制的知识gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba仍然鲜为人知。之前已经描述过gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba具有至少一种具有层粘连蛋白和锌(Zn)双重结合特性的脂蛋白，在文献中被描述为层粘连蛋白结合蛋白(Lmb，如本研究)，脂蛋白103,CDS 0330或AdcAII。在目前的研究中，Lmb在感染的发病机制中所起的作用gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba解剖血清2型。使用等基因突变体，结果表明Lmb在层粘连蛋白结合活性中不起重要作用gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba即使暴露在细菌表面也是如此。此外，这种脂蛋白的存在不会影响细菌对猪呼吸道上皮细胞和脑内皮细胞的粘附和侵袭，也不会增加猪呼吸道上皮细胞和脑内皮细胞的易感性gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba吞噬作用。另一方面，在体外树突状细胞实验中，Lmb显示出作为细胞因子激活剂的重要作用。最后，这种脂蛋白在从宿主环境中获取锌的过程中起着关键作用，从而使细菌能够在体内生长。Lmb缺陷突变体的毒力显著降低可能与细菌存活率降低(由于无法从周围环境中获取锌)和细胞因子激活降低有关。gydF4y2Ba

猪链球菌gydF4y2Ba是造成重大经济损失的最重要的猪病原体之一，可引起猝死、脑膜炎和关节炎等临床表现[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。此外,gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba是导致人类脑膜炎和感染性休克的人畜共患病原体[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。虽然近年来对该病原体引起的感染的发病机制的认识有所提高，但我们对其毒力因子和感染的发病机制的认识仍然不完整[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。一组表面蛋白质被认为对毒力很重要，尽管其中大多数只得到部分证实[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

细菌通过粘膜附着到宿主细胞上的病原体一样gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba通常与发病的第一步有关，导致定植和感染[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。细菌的粘附和细胞的侵袭对于成功感染宿主至关重要。事实上，细菌已经进化出了几种粘附素，这些粘附素可以识别并附着在宿主细胞表面成分上，包括细胞外基质蛋白，如纤维连接蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。几种层粘连蛋白结合蛋白(laminin-binding protein, Lmbs)在细菌表面表达已被描述为不同致病性链球菌。Lmb首次被发现于gydF4y2Ba链球菌agalactiaegydF4y2Ba(或B组)gydF4y2Ba链球菌gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，在其他链球菌中也报道了该脂蛋白的同源物，如gydF4y2Ba酿脓链球菌gydF4y2Ba或A组gydF4y2Ba链球菌gydF4y2Ba(命名为Lbp或Lsp) [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),gydF4y2Ba链球菌引起的肺炎gydF4y2Ba(称为adcai，见下文)[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。大多数研究表明，重组Lmbs可以结合纯化的层粘连蛋白，这是一种大的(900 kDa)，高度糖基化的多结构域蛋白，存在于所有人体组织中[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。此外，在gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba。gydF4y2BaagalactiaegydF4y2Ba，缺乏Lmb的突变体对人层粘连蛋白的粘附性降低，对人脑微血管内皮细胞的侵袭减少[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。Lsp-negativegydF4y2Ba年代gydF4y2Ba。gydF4y2Ba化脓性链球菌gydF4y2Ba突变体在体外对上皮细胞的粘附和侵袭方面显示出缺陷，并且在小鼠皮下溃疡模型中也被高度减弱[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

尽管许多研究主要集中在其作为粘附素的功能上，但Lmbs(或同源蛋白)也可能参与锌(Zn)的摄取。事实上，来自不同链球菌的Lmb同源物的晶体结构分析表明，两个球状结构域形成一个口袋，有利于锌结合的四面体几何结构[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。锌在任何正常代谢条件下都是至关重要的，但在感染期间，这种元素对细菌病原体尤为重要[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。事实上，宿主和病原体都在争夺同样的基本金属，而这些金属在感染部位的浓度非常低[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。在一些致病性链球菌中，一个或多个锌获取脂蛋白的缺失导致锌限制条件下的生长减慢，以及毒力、粘附和生物膜形成的降低，强调了定植和感染过程中锌代谢的重要性。gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba，在不同的菌株中发现了Lmb的同源物[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]而一种肢体缺陷突变体在小鼠感染模型中被证明是无毒的[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。此外，参与锌获取的脂蛋白也被描述和报道是至关重要的gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba毒性(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。然而，它似乎是一些混淆在文献中涉及的蛋白质粘连蛋白和锌摄取。最初，报道了所谓的锌结合脂蛋白103作为毒力因子的关键作用，但没有提到它作为层粘连蛋白结合蛋白的可能作用[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。后来，Zhang等人描述了一种层粘连蛋白结合蛋白gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba(称为CDS 0330) [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，但没有提及该蛋白与Aranda等人先前描述的锌结合脂蛋白蛋白103相同gydF4y2Ba。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。有趣的是，两个研究小组都独立地报告了这种蛋白质对小鼠感染模型的保护作用[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。最近，Zheng等人报道gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba具有两种锌结合蛋白AdcA和AdcAII。事实上，AdcAII对应于先前描述的脂蛋白103和CDS 0330 [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba];同样，没有提到这种蛋白质的潜在层粘连蛋白结合能力[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在本研究中，我们进一步剖析了Lmb/AdcAII/脂蛋白103/CDS 0330作为层粘连蛋白结合蛋白和锌摄取蛋白在引起的感染发病机制中的作用gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba血清型2。gydF4y2Ba

细菌菌株和生长条件gydF4y2Ba

本研究使用的菌株和质粒列于表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。经典的gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba在整个研究中使用了血清2型毒力强的欧洲参考P1/7菌株(野生型)，包括构建等基因缺陷突变体[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba菌株在Todd Hewitt肉汤(THB;Becton Dickinson，密西沙加，安大略省，加拿大)，如前所述[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株，本研究中使用的不同质粒也列在表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。对于体外细胞培养试验，按照前面描述的方法制备细菌[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]并在细胞培养基中重悬。需要时，将抗生素(Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada)以以下浓度添加到培养基中gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba大观霉素(Spc) 100 μg/mL;为gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba卡那霉素(Km)和大观霉素50 μg/mL，氨苄西林(Ap) 100 μg/mL。gydF4y2Ba

DNA操作gydF4y2Ba

提取基因组DNAgydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba使用InstaGene Matrix溶液(BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)进行野生型菌株的鉴定。重组质粒的微型制备使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)。根据制造商的建议使用限制性内切酶和dna修饰酶(Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada)。寡核苷酸引物(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)从Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA)获得，并使用iProof校对DNA聚合酶(BioRad Laboratories, Mississauga, ON, Canada)或Taq DNA聚合酶(Qiagen)进行pcr。扩增产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，使用ABI 310自动DNA测序仪和ABI PRISM染料终止循环测序试剂盒(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)测序。gydF4y2Ba

层粘连蛋白结合缺陷/非包封双突变体的构建gydF4y2Ba

精确的帧内删除gydF4y2BacpsGgydF4y2BaP1/7菌株的基因gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]是使用先前描述的重叠延伸剪接pcr构建的[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。重叠PCR产物克隆到pCR2.1 (Invitrogen, Burlington, ON, Canada)中，用EcoRI提取，重新克隆到热敏gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba穿梭质粒pSET4s，用相同的酶消化，产生敲除载体p4gydF4y2BaΔcpsGgydF4y2Ba。电穿孔野生型菌株P1/7获得突变体的程序先前已描述[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。经PCR和DNA测序分析证实等位基因置换。扩增产物用QIAgen PCR纯化试剂盒(QIAgen)纯化，并按上述方法测序。gydF4y2Ba

层粘连蛋白结合缺陷突变体的互补gydF4y2Ba

利用pMX1载体生成重组质粒进行互补分析(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这个向量是gydF4y2Ba大肠杆菌-猪链球菌gydF4y2Ba穿梭克隆载体pSET2 [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，并拥有gydF4y2Ba瑞士马尔克斯gydF4y2Ba转基因表达的启动子gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba。整个gydF4y2Balmb实验室gydF4y2Ba基因从基因组DNA中扩增gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2BaP1/7菌株通过EcoRI和NcoI位点克隆到pMX1中，生成互补载体pMX1-gydF4y2Balmb实验室gydF4y2Ba。将该质粒导入gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba对MC1061进行序列验证，然后转入缺失突变体衍生而来gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2BaP1/7构造gydF4y2Balmb实验室gydF4y2Ba补充突变体。gydF4y2Ba

细菌表面疏水性测定gydF4y2Ba

的相对表面疏水性gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba通过吸附量测定野生型、Lmb和Lmb/非包封突变株gydF4y2BangydF4y2Ba-如前所述的十六烷[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

微滴板层粘连蛋白结合试验gydF4y2Ba

按先前描述的方法进行层粘连蛋白结合试验[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。简单地说，Maxisorp™平板微滴96孔板(Nunc, VWR, Mississauga, ON, Canada)在0.1 M碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)中涂覆5 μg/mL来自Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)的人胎盘层联蛋白，在4°C下孵育过夜。用含有0.05% (v/v) Tween 20 (PBST, pH 7.3)的PBS洗涤板，每孔加入200 μL 3% (w/v)的PBST脱脂干乳，防止非特异性细菌结合。37℃下1小时后，用PBST洗涤孔。加入野生型或突变菌株的甲醛杀菌悬浮液(浓度相当于10gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCFU/mL)， 37℃孵育2 h。所有未结合的细菌随后通过PBST洗涤井去除。gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba2型血清特异性兔抗血清稀释1/5000的PBST制备如前所述[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]被添加到每口井中。该抗血清同样识别包膜和非包膜血清2型gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba如前所述[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。37℃孵育1小时，洗孔，加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.， West Grove, PA, USA)(用PBST稀释1/8000)。用二抗在37℃下孵育1 h。洗涤后，按照制造商的说明使用3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(Zymed, San Francisco, CA, USA)作为酶底物。加入25 μL的H使反应停止gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba(1 N)，在450 nm处读取。未涂覆的井作为背景对照。酪蛋白包被的孔作为非特异性粘附的对照gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba到蛋白质包膜孔。每个实验至少重复3次。gydF4y2Ba

猪气管上皮细胞和脑微血管内皮细胞的细菌粘附和侵袭试验gydF4y2Ba

使用新生猪气管上皮细胞系(NPTr)和猪脑微血管内皮细胞系(PBMEC)进行培养，直到如前所述的融合[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。细胞感染1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaCFU/井(感染多重性(MOI) = 10)的不同gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba在37℃、5% CO中培养2小时gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。粘附试验(定量细胞相关细菌总数(表面粘附和细胞内细菌))和侵袭试验(使用抗生素保护试验)按先前描述进行[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

猪链球菌gydF4y2Ba全身感染毒力小鼠模型gydF4y2Ba

采用C57BL/ 6j感染小鼠模型。这些研究是严格按照蒙特利尔大学动物福利委员会的指导方针和政策的建议和批准进行的，包括通过使用人道终点来最大限度地减少动物的痛苦，当动物受到严重影响时(死亡率不是终点测量)，安乐死在整个研究中都适用。实验选用36周龄雌性C57BL/6 J (Jackson Research Laboratories, Bar Harbor, ME, USA)，每组15只。早期固定相细菌在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次，并在THB中重悬[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。适当稀释细菌培养物，并在THB琼脂(THA)上镀以准确测定细菌浓度。小鼠接种1 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba每日至少监测健康和行为3次，直至感染后72 h，此后监测2次，直至实验结束(感染后12天)，观察是否出现脓毒症的临床症状，如抑郁、眼睛肿胀、毛糙、虚弱和嗜睡。对于菌血症研究，在感染后12小时、24小时和48小时从存活小鼠的尾静脉采集血液样本，并按先前描述的方法进行镀膜[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

血浆(全身)促炎介质的测定gydF4y2Ba

另外，每组8只小鼠腹腔模拟感染(THB)或1 × 10感染gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba野生型CFU或gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba感染后12小时，在安乐死和EDTA抗凝(Sigma-Aldrich)治疗后，通过心内穿刺收集突变株和血液样本。gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。10 000 ×离心后收集血浆上清gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下保存10分钟，保存于- 80°C。选择感染后12小时的时间点，在没有小鼠明显死亡的情况下获得最大的促炎介质产生[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。采用夹心法测定血浆白细胞介素(IL)-6和C-X-C基序趋化因子配体(CXCL) 1的浓度。ELISA使用来自R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)的配对抗体，根据制造商的建议。gydF4y2Ba

吞噬作用分析gydF4y2Ba

J774A。1murine macrophages (ATCC TIB-67; Rockville, MD, USA) were maintained in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (Gibco, Burlington, ON, Canada) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco) and grown at 37 °C with 5% CO_2gydF4y2Ba。刮取融合细胞培养物，以1 × 10的倍率接种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/mL，在37℃、5% CO条件下孵育3小时gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba使细胞粘附。加入1 × 10感染细胞gydF4y2Ba^7gydF4y2BaCFU/mL的细菌悬浮液在完全培养液(MOI = 100)中，在37℃、5% CO中孵育2 hgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba以及使用抗生素保护试验进行的吞噬试验[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

猪链球菌gydF4y2Ba骨髓源性树突状细胞(bmDC)的活化gydF4y2Ba

C57BL/6 J小鼠(Jackson Research Laboratories)的股骨和胫骨被用来生成bmDCs，如前所述[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。简单地说，造血骨髓干细胞在完整培养基中培养(rmi -1640，补充5%热灭活胎牛血清，10 mM HEPES, 2 mM l -谷氨酰胺和50µM 2-巯基乙醇(Gibco, Burlington, ON, Canada)，并补充来自小鼠转染的Ag8653细胞的20%粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。流式细胞术证实细胞纯度至少为90% CD11c +，如前所述[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。虽然这种培养系统不能完全排除其他先天细胞(如巨噬细胞)的存在，但它代表了bmDCs的丰富来源[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

所有实验均在没有内毒素(脂多糖)污染和无毒条件下进行(数据未显示)，后者通过乳酸脱氢酶释放和CytoTox 96进行评估gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba非放射性细胞毒性试验(Promega, Madison, WI, USA)。从P1/7开始gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变株在RPMI-1640完全培养基中不生长，热杀gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba混悬液(按先前所述制备)[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba])，以相当于2 × 10的浓度进行bmDC刺激gydF4y2Ba^9gydF4y2BaCFU /毫升。细胞以1 × 10重悬gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/mL在完全培养基中，用不同的热杀死刺激gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba菌株。在热灭活刺激后4、6、8、12、16 h收集上清液gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba，在没有细胞毒性的情况下，分泌的细胞因子水平达到最大的孵育时间(数据未显示)[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。模拟感染细胞作为阴性对照。肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-6、C-C基序趋化因子配体(CCL) 3和C-X-C基序趋化因子配体(CXCL) 1的分泌水平采用夹心ELISA法定量，采用R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)公司的配对抗体。gydF4y2Ba

细菌生长分析gydF4y2Ba

在500 μ l培养量的微管中进行细菌生长实验。细菌过夜培养(1 × 10)gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba采用CFU/mL)接种THB、天然缺锌血浆、含各种ZnSO的血浆gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba浓度(0 ~ 50 μM)和血浆中添加ZnSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba并加入适当浓度的螯合剂四-(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN, Sigma Aldrich)。37℃孵育24 h，观察其生长情况。测定不同孵育时间CFU/mL总数。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

使用Shapiro-Wilk检验验证数据的正态性。因此，在适当的情况下，进行参数检验(未配对t检验)或非参数检验(Mann-Whitney秩和检验)来评估组间的统计差异。采用Log-rank检验比较野生型感染小鼠和突变株感染小鼠的存活率。每个体外试验至少在三个独立实验中重复进行。gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05为差异有统计学意义。gydF4y2Ba

本研究中菌株的表面疏水性gydF4y2Ba

先前的研究已经证明了这两种基因的缺失gydF4y2BacpsGgydF4y2Ba或gydF4y2BacpsFgydF4y2Ba生物合成基因gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba导致非封装表型[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。一种等基因突变体gydF4y2BacpsGgydF4y2Ba编码糖基转移酶的基因从P1/7中被删除gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba构建菌株并与野生型P1/7、P1/7进行比较gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba和P1/7gydF4y2BaΔcpsF。gydF4y2BaP1/7的表面疏水性gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba低(小于6%)，与野生型P1/7相当(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。同时，正如预期的那样，删除了gydF4y2BacpsGgydF4y2Ba基因显著提高了表面疏水性，结果与P1/7相似gydF4y2BaΔcpsFgydF4y2Ba非封装突变体(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这些结果表明，Lmb对所测菌株的表面疏水性没有任何作用。gydF4y2Ba

缺乏脂蛋白对Lmb没有影响gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba-与层粘连蛋白结合gydF4y2Ba

尽管先前的研究表明纯化的LmbgydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba能结合人层粘连蛋白[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，能力gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba结合固定化人胎盘层粘连蛋白的突变体以前没有被评估过。与层粘连蛋白的结合能力gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变体与野生型菌株相当(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。研究还证实，未封装的突变菌株比野生型菌株更有效地结合层粘连蛋白，如前所述[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。有趣的是，双突变体粘着层粘连蛋白gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba/ non-encapsulated (gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba/gydF4y2BaΔcpsGgydF4y2Ba)与单个未封装的观察结果相似gydF4y2BaΔcpsFgydF4y2Ba突变体(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。综上所述，这些结果表明Lmb对两者之间的相互作用并不重要gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba和层粘连蛋白，即使在没有荚膜多糖(CPS)的情况下。gydF4y2Ba

缺乏脂蛋白Lmb并不影响猪上皮细胞和内皮细胞的粘附和侵袭gydF4y2Ba

利用生成的突变株评估Lmb蛋白在NPTr和PBMEC细胞粘附/侵袭中的作用。对于这两种细胞类型，正如预期的[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，未包封的突变菌株比野生型菌株更有效地粘附和侵袭细胞(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba模拟)。然而,gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变体同样粘附并(弱)侵入NPTr(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaA, B)和PBMEC(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaC, D)细胞。此外,gydF4y2BaΔlmb /ΔcpsGgydF4y2Ba双突变体粘附和侵袭两种细胞类型与未被包裹的相似gydF4y2BaΔcpsFgydF4y2Ba突变体。这些结果表明，即使在没有CPS的情况下，Lmb也不会在上皮细胞和内皮细胞的粘附/侵袭中发挥关键作用。gydF4y2Ba

脂蛋白Lmb的存在是完全毒力所必需的gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba

确认Lmb在gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba采用一种具有良好特征的C56BL/6小鼠感染模型[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。野生型毒株感染小鼠迅速出现以脓毒性休克为特征的全身性疾病临床症状，60%的小鼠在48小时内死亡(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA)，另一方面，只有20%的老鼠感染了gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变体屈服于疾病(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA).这些小鼠在接种细菌后出现短暂的感染迹象，如毛糙，并迅速恢复并表现出正常的行为。这些结果证实，Lmb脂蛋白是至关重要的毒力gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba血清2型菌株P1/7。gydF4y2Ba

在感染早期12 h、24 h和48 h时也评估血液细菌负荷(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB).感染后12小时，感染野生型菌株的小鼠血液细菌负荷平均升高1 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2BaCFU /毫升(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB).此外，感染野生型菌株在感染24 h和48 h后细菌负荷升高。另一方面，感染了gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变体在感染后12、24和48小时血液细菌负荷显著降低。考虑到几乎60%的野生型P1/7菌株感染的小鼠已经死亡，并且仅对存活(受影响较小)的小鼠进行活菌计数，这种差异在感染后48小时将更加明显。这些数据表明gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变株在感染小鼠的血液中表现出较低的存活能力。gydF4y2Ba

此外，感染P1/7和gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba对突变株进行评价。感染12 h后检测IL-6和CXCL1浓度。这些血浆介质的浓度明显低于对照组gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变菌株与P1/7野生型菌株相比(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

Lmb不提倡gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba小鼠巨噬细胞对吞噬的抵抗gydF4y2Ba

其中一个假说可以解释gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变体在感染小鼠的血液中存活较少，对吞噬的易感性增加。小鼠巨噬细胞体外吞噬实验表明，野生型菌株的吞噬能力低于未包被的菌株gydF4y2BaΔcpsFgydF4y2Ba突变体，如前所述[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。的gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变体的内化与野生型P1/7相似gydF4y2BaΔlmb /ΔcpsGgydF4y2Ba双突变体与未包被的突变体一样被吞噬gydF4y2BaΔcpsFgydF4y2Ba突变体。这些结果表明，脂蛋白Lmb在抗吞噬作用中不起任何作用。gydF4y2Ba

脂蛋白Lmb部分调节bmDC细胞因子的释放gydF4y2Ba

我们使用bmDCs作为先天免疫细胞模型来评估Lmb脂蛋白在细胞因子释放中的作用，因为树突状细胞在免疫过程中起着关键作用gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba发病机制和它们的炎症反应gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba已经被很好地描述了[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。bmDCs被热杀细菌激活长达16小时。在所有实验和所有孵育时间，对照模拟感染细胞的细胞因子值< 300 pg/mL(未显示)可以忽略不计。的gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba和gydF4y2BaΔlmb / cpsGgydF4y2Ba突变株诱导IL-6和TNF水平显著降低(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2BaA, C)，以及较小程度上的CXCL1(图1)gydF4y2Ba6gydF4y2BaB)，与野生型P1/7和未封装的相比gydF4y2BaΔcpsFgydF4y2Ba突变株，分别为(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。的补充gydF4y2BaΔlmb实验室:gydF4y2Ba: pMX1 -gydF4y2Balmb实验室gydF4y2Ba菌株恢复了细胞因子诱导的能力gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变到与野生型菌株相似的值(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。另一方面，Lmb的存在不影响CCL3的诱导(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2BaD).这些结果表明，Lmb脂蛋白是其中的一种gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba负责细胞因子释放的成分。gydF4y2Ba

脂蛋白Lmb对人体至关重要gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba锌饥饿条件下的生长gydF4y2Ba

考虑到Lmb作为层粘连蛋白结合蛋白的作用有限，本文对该脂蛋白的第二个特征(锌摄取)进行了评价。首先，野生型P1/7和gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba在富培养基(THB)中培养的菌株也表现出类似的良好生长速度，通过细菌数量来评估(图2)gydF4y2Ba7gydF4y2BaA).相反，当在血浆(一种模拟体内条件的劣质培养基)中培养时gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba与野生型菌株相比，突变菌株严重减少(图2)gydF4y2Ba7gydF4y2BaB)gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变体完全恢复了野生型菌株的生长水平。研究Lmb的丧失是否与锌饥饿条件下生长能力下降有关gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba分别以25µM和50µM的浓度加入到血浆中(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaC)gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba25µM和50µM ZnSO对突变体进行部分和全部恢复gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba，表明锌浓度存在剂量效应(图2)gydF4y2Ba7gydF4y2BaC).最后，螯合剂N,N,N '，N ' -四akis-(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)，一种具有细胞渗透性的高亲和力ZngydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}在锌稳态研究中，螯合剂用于降低锌的浓度(15,49,51)，将螯合剂添加到补充ZnSO的血浆中gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaC) (gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。血浆中添加20 μM TPEN，外加50µM ZnSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba损害了生长gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变株(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaD)。gydF4y2Ba

感染的发病机制由gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba仅部分为人所知，关键毒力因子的定义也存在争议[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。在感染的最初阶段，微生物与细胞外基质蛋白的相互作用可以促进细菌的定植和入侵[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。事实证明gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba能够与其中几种蛋白质相互作用，包括层粘连蛋白[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。另一方面，细菌病原体为了在宿主体内生存，它们需要有效地从周围培养基中获取和利用可用的营养物质。锌(Zn)是在宿主-病原体相互作用中起重要作用的成分之一[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。锌结合脂蛋白也被描述在gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba对细菌在感染期间的适应性和生存至关重要[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。有趣的是，其中之一gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba层粘连蛋白和锌结合蛋白是一种具有双重功能的单一脂蛋白，先前鉴定为脂蛋白103,Lmb CDS 0330或AdcAII [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。这种蛋白质(或编码它的基因)与其他链球菌具有高度的同源性[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，其中也描述了这种双重功能[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。在…的情况下gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba目前尚不清楚该蛋白的层粘连蛋白结合能力或锌结合能力(或两者)在感染过程中是否起重要作用。在目前的研究中，已经研究了这种脂蛋白(为简单起见，在本研究中称为Lmb)在感染发病机制中的更精确作用。gydF4y2Ba

根据之前的观察，一些gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba菌株能够结合层粘连蛋白[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]， Zhang等人证明gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba拥有一个gydF4y2Balmb实验室gydF4y2Ba同源基因:与…同源的基因gydF4y2Ba链球菌gydF4y2Ba，gydF4y2Ba美国agalactiaegydF4y2Ba和gydF4y2Ba肺炎链球菌gydF4y2Ba克隆和纯化的蛋白在体外明显粘附于层粘连蛋白。然而，目前尚不清楚这种脂蛋白是否主要负责结合gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba层粘连蛋白。目前使用Lmb缺陷突变体的研究结果表明，Lmb在细菌与这种细胞外基质蛋白的结合中没有发挥关键作用。尽管据报道Lmb是一种表面蛋白[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，前面已经描述了CPS的存在可能会阻止gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba通过阻碍表面蛋白质附着在层粘连蛋白上[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。因此，构建了一个不含Lmb和CPS的双突变体并进行了测试。的gydF4y2BaΔcpsFgydF4y2Ba与野生型菌株相比，未包封的突变体与层粘连蛋白的粘附程度显著提高，证实了先前的结果。然而，双子星gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba/gydF4y2BaΔcpsGgydF4y2Ba突变体与未封装的突变体粘附相似，这表明即使在没有CPS的情况下，表面表达的Lmb似乎也不起重要作用gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba粘连到层粘连蛋白上。能够结合层粘连蛋白的其他蛋白质的存在已经被描述为存在于gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba血清2型可弥补Lmb的缺失[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

Lmb在粘附/侵袭宿主细胞中的作用似乎在不同的链球菌中有所不同。例如，肢体的存在似乎对gydF4y2Ba美国agalactiaegydF4y2Ba移植物:上皮的定植并随后移入血流，对中枢神经系统有偏向性[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。Lbp来自gydF4y2Ba肺炎链球菌gydF4y2Ba也有报道称在病原体与人体微血管内皮细胞的粘附中起重要作用[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba),gydF4y2Ba化脓性链球菌ΔlmbgydF4y2Ba(或Lsp，或Lbp)突变体仅表现出粘附性降低[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]或减少粘附和侵入[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba寄主细胞。目前的研究结果表明Lmb在gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba粘附或侵入猪呼吸道上皮细胞和脑微血管内皮细胞，这与该蛋白对层粘连蛋白结合不是关键的事实相关。如前所述，其他发挥类似重叠功能的蛋白质可能会补偿并允许gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba附着于这种细胞外基质的蛋白质和宿主细胞。gydF4y2Ba

有一些关于Lmb(或同源蛋白)作为链球菌的锌结合蛋白的作用的研究[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，但……除外gydF4y2Ba肺炎链球菌gydF4y2Ba它作为一种锌结合脂蛋白起着重要的作用，但它不结合层粘连蛋白[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。如前所述，两个锌结合蛋白已经在gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba: AdcA和AdcAII [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。尽管这两种脂蛋白都可能在锌结合中发挥作用，Zhang等人报道gydF4y2BaAdcAIIgydF4y2Ba表达水平明显高于gydF4y2BaAdcAgydF4y2Ba，但只有缺乏这两种脂蛋白才会影响锌限制条件下的存活和感染小鼠模型的毒力[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。目前的研究结果只是部分地证实了这些观察结果。事实上,gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变体(对应于gydF4y2BaΔAdcAIIgydF4y2Ba在锌限制条件下(等离子体)不能生长，添加锌可以恢复这一缺陷。此外，互补突变体能够以与野生型菌株相似的水平生长。此外，也不同于Zhang等人的研究。[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，在目前的工作中gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变株的毒力明显低于野生型菌株，证实了Aranda等人先前报道的结果。[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，他们使用了来自不同背景的小鼠(BALB/c)。的关键作用gydF4y2BaΔAdcAIIgydF4y2Ba在gydF4y2Ba肺炎链球菌gydF4y2Ba(16)，而两者都有gydF4y2BaΔAdcAgydF4y2Ba和gydF4y2BaΔAdcAIIgydF4y2Ba毒力低于a组野生型菌株gydF4y2Ba链球菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。在我们的手中，存在着gydF4y2BaΔAdcAIIgydF4y2Ba对锌的摄取和毒力至关重要gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba血清型2。观察到的差异gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba研究可以用背景来解释gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba使用的菌株:目前的研究和Aranda等人的研究。[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]以毒力强的P1/7序列型(ST) 1作为野生型参考菌株，而Zhang等[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba使用了来自中国的ST7高毒毒株。之前的研究也报告了一些内部差异gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba不同背景血清2型菌株感染的发病机制[j]gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。可以假设，锌的调节可能根据菌株的毒力/表型而变化。gydF4y2Ba

毒力较低gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变可以解释为较低的存活率(较低的菌血症)在体内的研究表明。这可能与体内限制锌的条件直接相关，而不是与突变体对细菌杀灭的更高易感性相关。的确，在吞噬率上，两者之间并无差异gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba可以观察到突变株和野生型菌株。此外，诱导大量促炎介质的产生导致炎症加剧是糖尿病的一个标志gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba感染并至少部分导致宿主死亡[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。虽然目前的研究清楚地表明，小鼠感染较低的细胞因子浓度gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变体，这种效应可能是低菌血症的简单结果。然而，除此之外，体外实验结果表明，Lmb的存在还具有细胞因子激活剂的重要作用。同样，层粘连蛋白结合蛋白来自gydF4y2Ba肺炎链球菌gydF4y2Ba(Lbp)被报道能激活人脑微血管内皮细胞[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，而gydF4y2Ba美国agalactiaegydF4y2Ba在使用相同的细胞时不参与IL-8的释放[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。由于脂蛋白已被清楚地证明是负责细胞因子活化的细胞gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]，也可以假设体内细胞因子的产量较低gydF4y2BaΔlmbgydF4y2Ba突变体是低菌血症和由于缺乏这种脂蛋白而降低的激活的双重组合。gydF4y2Ba

综上所述，目前的研究结果表明，Lmb在层粘连蛋白结合活性中不起重要作用gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba血清型2。此外，这种脂蛋白的存在不会影响细菌对猪呼吸道上皮细胞和脑内皮细胞的粘附和侵袭，也不会增加猪呼吸道上皮细胞和脑内皮细胞的易感性gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba血清2型到吞噬作用。另一方面，这种脂蛋白在体外树突状细胞中被证明是细胞因子激活剂的重要作用。最后，Lmb在从宿主环境中获取锌方面起着关键作用，从而使细菌能够在体内生长。Lmb缺陷突变体的毒力显著降低，可能与细菌存活率降低有关，原因是细菌无法从周围环境中获取和利用Zn，而在缺乏这种脂蛋白的情况下，细胞因子激活降低。因为编码这种蛋白质的基因也存在于其他血清型gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba(来自基因库的数据，未显示)，确认当前研究中描述的Lmb的作用是否也适用于其他致病性血清型，将是一件有趣的事情gydF4y2Ba猪链球菌gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

记者:gydF4y2Ba

氨苄青霉素gydF4y2Ba

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层粘连蛋白结合蛋白gydF4y2Ba

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新生猪气管上皮细胞gydF4y2Ba

PBMEC:gydF4y2Ba

猪脑微血管内皮细胞gydF4y2Ba

聚合酶链反应:gydF4y2Ba

聚合酶链反应gydF4y2Ba

圣:gydF4y2Ba

序列类型gydF4y2Ba

那:gydF4y2Ba

有琼脂gydF4y2Ba

那有:gydF4y2Ba

托德休伊特肉汤gydF4y2Ba

肿瘤坏死因子:gydF4y2Ba

肿瘤坏死因子gydF4y2Ba

锌:gydF4y2Ba

锌gydF4y2Ba

TPEN:gydF4y2Ba

(Tetrakis) - 2-Pyridylmethyl乙二胺gydF4y2Ba

作者要感谢S. Lacouture提供的技术帮助和N. Fittipaldi博士对突变体构建的建设性建议。gydF4y2Ba

本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会(NSERC)资助给MG (grant # -2022-03730)和MS (grant # 2021-03020)。gydF4y2Ba

作者及单位gydF4y2Ba

1. 加拿大蒙特利尔大学兽医学院病理学与微生物学系生产动物传染病研究小组(GREMIP)和猪禽传染病研究中心(CRIPA)，圣亚辛特，QC, J2S 2M2，加拿大gydF4y2Ba

   Servane Payen, Mariela Segura和Marcelo GottschalkgydF4y2Ba

2. 西班牙巴塞罗那Autónoma大学(UAB)， Bellaterra (Cerdanyola del vall)， 08193gydF4y2Ba

   Jesús阿兰达·罗德里格斯gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

作品概念:SP, JAR, MS, MG;实验室技术:SP, JAR;数据采集、分析和解释:SP、MS、MG;稿件制备:SP, JAR, MS, MG。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba马塞洛Gottschalk以及gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

所有涉及动物的实验均按照加拿大动物保护委员会的指导方针和政策以及蒙特利尔大学动物福利委员会制定的《实验动物护理和使用指南》中的原则进行，该委员会批准了本文使用的协议和程序(许可550号RECH-1570)。本研究共使用了46只小鼠。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

本文中未提供的资料和数据可根据通信作者的要求提供。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线b施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

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