溶血素的功能李斯特菌与生物膜的形成有关:转录组学分析

李steriolysin O (LLO)是大肠杆菌的主要毒力蛋白单核细胞增多性李斯特氏菌(LM)，帮助LM逃离溶酶体。我们之前发现细胞免疫反应由L.ivanovii(LI)较LM弱。我们推测这可能与ivanolysin O (ILO)的功能有关。在此，我们构建了溶血素基因缺失株LIΔ国际劳工组织，以及一个改良的菌株LIΔ国际劳工组织：：他，其中国际劳工组织由他。原核转录组测序在LI上进行，LIΔ国际劳工组织、LIΔ国际劳工组织：：他。比较三株株间转录组差异，分析三株株间差异显著的基因和通路。原核转录组测序结果显示国际劳工组织到核糖体、群体感应和磷酸转移酶系统(PTS)通路等。李Δ国际劳工组织与LI相比，显示出衰减的生物膜形成能力。补充后生物膜形成明显恢复甚至增加他。昏过去之后国际劳工组织，部分毒力基因的相对表达水平，包括sigB，prfA，学报，smcL,virR，与LI相比上调。后补充他，这些基因与LIΔ相比下调国际劳工组织。在单糖或双糖培养基中培养时，这种变化的趋势和程度不完全一致。研究结果证实了溶血素与植物的一些重要生物学特性有关李斯特菌，包括生物膜形成和毒力基因表达水平。这是首次在转录组水平上对ILO功能进行全面研究，并首次证明了两者之间的关系李斯特菌溶血素和生物膜的形成。

单核细胞增多性李斯特氏菌(LM)是一种革兰氏阳性、不出芽的矮个子细菌。它广泛分布于自然环境中，包括污水和土壤[1］．它于1926年在兔子和豚鼠中爆发时首次被发现[2］．LM也是引起人类李斯特菌病的一种重要的食源性病原体，可通过形成生物膜在食品工业中持续存在[3.，4］．LM也是一种细胞内寄生虫，可在宿主体内诱导细胞免疫反应[5］．这种细菌最初被用作研究细胞免疫机制的模式生物[6］．由于LM可以诱导有效的细胞免疫反应，其作为疫苗载体的价值已被探索。在一项涉及减毒LM菌株的研究中，敲除木豆而且dat人类的基因和插入CD24基因导致皮下接种的Hepa1-6-CD24细胞来源的肿瘤消退，并增加小鼠的无肿瘤生存[7］．

LM的主要毒力因子是李斯特菌溶素O (LLO)，其编码由他(8］．该基因位于LM-first致病性岛(LIPI-1) [9］．LLO与LM独特的细胞内生活方式有关，LM逃脱细胞内吞噬囊泡的能力对诱导细胞免疫很重要[10］．LLO失活导致小鼠溶血活性丧失，吞噬体逃逸受阻，毒性降低[11，12，13］．在一项研究中，研究人员观察了动物的逃跑能力他- - - - - -扫描电子显微镜观察吞噬囊泡中灭活的lm [14］．研究结果表明，LLO是细菌从内化囊泡中逃逸所必需的毒力因子。

李斯特菌ivanovii(LI)是该属中唯一的致病菌李斯特菌LM以外的。黎氏菌几乎只感染反刍动物，人类感染很罕见[15］．1955年在保加利亚首次从患有先天性李斯特菌病的羔羊身上分离出来[16］．LI具有与LM相似的特性，如细胞内寄生和细胞间直接传递，并可进入抗原提呈细胞，如巨噬细胞中增殖[17］．本课课组构建了几种重组LI载体疫苗，并证明它们都能诱导抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞免疫反应[18］．然而，我们也发现LI载体疫苗诱导的细胞免疫反应弱于相应的LM载体疫苗，表明LI的免疫原性不如LM。

LM的细胞内寄生及其诱导细胞免疫反应的能力主要与LLO有关。Ivanolysin O (ILO)，由国际劳工组织，可在体外替代LLO [8]，表明劳工组织的职能与劳工处类似。然而，在大多数研究中，通过用ILO代替LLO来间接分析ILO的功能。对劳工组织职能的直接审查尚未有报告。在一项研究中，研究人员构建了一种重组菌株LMΔ他：：国际劳工组织，通过替换他与国际劳工组织在细菌基因组中[17］．重组LM菌株可以在小鼠肝脏中增殖，但不能在脾脏中增殖，这表明ILO和LLO的功能并不完全相同。ILO介导的脾脏细菌增殖弱于LLO, ILO激活免疫反应的能力弱于LLO。另一项研究[17证实了ILO在帮助细菌逃离吞噬囊泡进入宿主细胞方面的能力弱于LLO。基于这些发现，我们推测LI的免疫原性较LM弱的原因可能与ILO的功能有关。与更深入的LM和LLO研究相比，截至2022年7月，关于LI和ILO的研究相对较少，PubMed中使用“ivanolysin O”搜索词的结果只有10个。

深入探讨国际劳工组织的职能，将丰富对国际劳工组织的认识。本研究旨在更深入地解释ILO的功能，为优化LI的免疫原性提供理论依据，对LI疫苗载体的应用有价值。在本研究中，我们构建了一株溶血素基因缺失的LI株LIΔ国际劳工组织以及一株溶血素基因修饰的LI, LIΔ国际劳工组织：：他，其中国际劳工组织由他。进行原核转录组测序，分析3株株间存在显著差异的基因和通路。

细菌

LM 10403和LI PAM55由沈浩博士(宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院微生物学系)提供。质粒pCW619, pCW620(其中含有lacZ)和pCW621(它的端口是他)是我们小组建造的。质粒pCW620电穿孔进入LI和菌株LIΔ国际劳工组织：：lacZ由同源重组[19］．质粒pCW619和pCW621电穿孔到LIΔ国际劳工组织：：lacZ构建菌株LIΔ国际劳工组织和李Δ国际劳工组织：：他,分别。目标质粒pCW619、pCW620和pCW621以及重组菌株的示意图见附加文件1。

LLO和ILO的生物信息学分析

序列克隆软件用于比较LLO蛋白编码基因的核苷酸序列他(GenBank: DQ054589.1)和ILO蛋白编码基因国际劳工组织(基因库:X60461.1)。使用DNASTAR软件和Expasy Translate工具预测翻译和开放阅读框，使用DNAMAN软件比较氨基酸序列。使用ProtParam和Compute pI/Mw工具预测pI、Mw、不稳定性指数和脂肪族指数。二级结构预测使用Predict Protein, SOPMA和PSIPRED软件。三级构造采用Swiss-Model进行预测，并采用PDBsum Generate进行分析。亲水性和疏水性用ProtScale进行预测。跨膜结构预测使用TMHMM Server v. 2.0。用CDD预测功能域。有关数据库、生物信息学分析软件和网站的信息见表1。

LI的原核转录组测序，LIΔ国际劳工组织，和李Δ国际劳工组织：：他菌株

使用TRIzol试剂(Invitrogen Life Technologies, USA)分离总RNA。测序文库在上海个人生物科技有限公司的NextSeq 500平台(Illumina, USA)上测序。通过转录组测序分析得到的DEGs通过RT-qPCR进行验证。RT-qPCR反应体系和条件按照生产商说明书(SsoFast EvaGreen Supermix, Bio-Rad，中国)进行。以16s rRNA万能引物作为内参，用2计算各基因相对转录水平^——ΔΔCt方法。

对所有组和样本中所有差异表达基因(DEGs)的并集进行双向聚类分析。根据不同样本中同一基因的转录水平和同一样本中不同基因的表达模式进行聚类分析。采用欧几里得方法计算距离，采用层次聚类方法(完全链接)进行聚类。

差异通路的表型分析

群体感应途径-生物膜形成

生物膜按照前面描述的方法培养[18]，略有改动。1毫升BHI肉汤培养液(兰桥，中国)含有1 × 10⁷CFU/mL LM, LI, LIΔ国际劳工组织、LIΔ国际劳工组织：：他分别添加到24孔PVC板(美国康宁公司)的每孔中，在37℃下培养1、2、3和4天。去除培养基，用PBS冲洗孔两次，风干得到生物膜。立即或在37℃下加入0.1 mg/mL蛋白酶K (Solarbio, China) 3小时后进行结晶紫染色。结晶紫染色如下。每孔加入甲醇(1ml)固定15分钟。除去甲醇，加入1ml 0.1%结晶紫(Solarbio, China) 10分钟。除去结晶紫，每孔用PBS洗涤三次，干燥，并在1ml 33%醋酸中重悬。将上清液转移到新板上，使用微孔板阅读器(美国赛默飞世尔科学公司)测量595 nm处的光密度。

除结晶紫染色外，还测定了生物膜中的活菌。每孔加入1毫升PBS，使用Elmasonic P仪(Elma，德国)在37千赫工作5分钟进行超声处理。将20微升悬浮液添加到BHI (Landbridge，中国)培养皿中，在37°C培养48小时。计数菌落，以CFU表示活菌数。

1毫升BHI肉汤培养液(兰桥，中国)含1 × 10⁷CFU/mL LM, LI, LIΔ国际劳工组织、LIΔ国际劳工组织：：他被添加到24孔PVC板(康宁，美国)的每孔中，每孔中放置无菌载玻片。在37°C孵育3天后，取出载玻片，用去离子水洗涤两次。

将载玻片置于2.5%戊二醛溶液中12 h，分别用浓度梯度为30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液脱水10 min，取出临界点干燥。玻片被喷金，然后用扫描电镜观察(Inspect F, FEI，荷兰)。

200微升细胞膜染色工作液(LIVE/DEAD BacLight™细菌活力试剂盒;Invitrogen, USA)被添加到幻灯片中。活菌用细胞9染色标记，死菌用PI染色标记。载玻片在37°C黑暗中孵育15分钟，用去离子水洗涤三次，取出，放在玻片上。载玻片安装后，采用A1R模型进行LSCM观察⁺显微镜(尼康，日本)。利用NIS Elements和ImageJ软件对生物膜厚度和荧光强度进行成像和计算。

PTS途径-毒力基因转录

李,李Δ国际劳工组织、LIΔ国际劳工组织：：他分别接种到以0.5%葡萄糖或0.5%纤维素为唯一碳源的TSB培养基(aladdin, China)中，37°C孵育。将细菌培养到600 nm 0.4-0.5的光密度。然后，使用RNAprep pure Cell/Bacteria Kit (Tigen，中国)提取细菌RNA。使用TransScript One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix (Transgen, China)将RNA逆转录为cDNA。

统计分析

数据使用SPSS 21.0 (IBM，美国)进行处理。正态分布以均数±标准差表示。参数检验采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

LLO和ILO的生物信息学分析

序列之间的同源性他而且国际劳工组织为76.64%，翻译氨基酸序列同源性为78.03%。表中列出了LLO和ILO的等电点(pI)、分子量(Mw)、不稳定性指数和脂肪族指数2。LLO和ILO都是稳定的。天冬酰胺是最常见的氨基酸成分(10.4%)(其他文件2A, B). LLO(附加文件)的二级结构2C)和国际劳工组织(附加文件2D) PredictProtein软件预测显示两者都是混合结构蛋白。LLO(附加文件)的二级结构2E)和国际劳工组织(附加文件2F)由SOPMA软件预测，在LLO中，的比例α-螺旋，延伸链，β-turn和随机线圈分别为25.90%、24.57%、6.99%和42.53%。ILO的比例分别为26.14%、24.62%、6.25%和42.99%。LLO的二级结构(图1A)和国际劳工组织(图1B) PSIPRED软件预测的主要随机线圈，延伸链和α-螺旋，其中随机线圈所占比例最高。Swiss-Model软件预测了LLO和ILO的三级结构(图1C).得到两种LLO蛋白预测模型。模型a(图1C，面板a)显示其参考模板蛋白为4cdb1。a (SWISS-MODEL模板库)，剩余基础结构的模型周长为39-526，序列相似度为0.61，模板覆盖率为0.92。模型b(图1C，面板b)显示其参考模板蛋白为5ly6.1。a (SWISS-MODEL模板库)，剩余基础结构的模型周长为58-527，序列相似度为0.42，模板覆盖率为0.89。对于两种ILO蛋白预测模型，模型c(图1C，面板C)显示其参考模板蛋白为4cdb1。一个（SWISS-MODEL Template Library), the model circumference of residual infrastructure was 38–525, the sequence similarity was 0.56, and the template coverage was 0.92. Model d (Figure1C, d)显示其参考模板蛋白为5ly6.1。a (SWISS-MODEL模板库)，剩余基础结构的模型周长为56-525，序列相似度为0.43，模板覆盖率为0.89。每个模型的Ramachandran图(图1D)证实了预测模型的合理性，尤其是模型a和模型c. Ramachandran图(PDB ID: W678)(图1D，对应模型a的面板a)显示，100%的氨基酸残基位于合理区域，其中最有利区域91.8%，额外允许区域8.0%，慷慨允许区域0.2%。拉曼图(PDB ID: W685)1D，对应模型c的面板c)显示，100%的氨基酸残基位于合理区域，其中最有利区域91.1%，额外允许区域8.7%，慷慨允许区域0.2%。ProtScale软件预测了LLO的亲水性和疏水性(附加文件)2G)和国际劳工组织(附加文件2H);它们都是亲水的。TMHMM Server v. 2.0软件预测了LLO的跨膜结构(附加文件2I)和国际劳工组织(附加文件2J);结果表明，没有一种蛋白被预测为跨膜蛋白，而更有可能是细胞外蛋白。CDD软件预测LLO(附加文件2K)和国际劳工组织(附加文件2LLO和ILO都是硫醇激活的细胞溶解素家族蛋白(结构域ID: 13651282)，都包含两个功能域:thiol_cytolysin (pfam01289)和thiol_cytolys_C (pfam17440)。第一种是硫醇活化的溶细胞素，后者是硫醇活化的溶细胞素β三明治域。

转录组测序和分析

聚类结果显示，基因在LI、LIΔ中有差异表达国际劳工组织、LIΔ国际劳工组织：：他。LI中大多数基因表现出相反的趋势，LIΔ国际劳工组织、LIΔ国际劳工组织：：他(图2A).火山图显示LIΔ国际劳工组织与LI相比有156个上调基因和152个下调基因(图2B);李Δ国际劳工组织：：他与LIΔ相比，有97个上调基因和230个下调基因国际劳工组织(图2C);李Δ国际劳工组织：：他有60个上调基因和172个下调基因(图2D)。

基因本体(GO)富集分析显示，与LI相比，在LIΔ中具有显著性的前5个条目国际劳工组织核糖体、核糖体、细胞内核蛋白复合体、核蛋白复合体的结构组成和结构分子活性(图3.A)与LIΔ相比国际劳工组织，在LIΔ中有显著意义的前5项国际劳工组织：：他分别为胞浆部分、胞浆核糖体部分、胞内细胞器部分、rRNA结合和核糖体亚基(图3.B).与LI相比，在LIΔ中具有显著性的前五项国际劳工组织：：他为细胞质部分、核糖体结构组成、核糖体、细胞内核蛋白复合体、核蛋白复合体(图3.C)。

京都基因与基因组百科(KEGG)富集分析显示，与LI相比，核糖体、磷酸转移酶系统(PTS)和群体感应(quorum sensing)是LIΔ中富集最多的途径国际劳工组织(图3.D)与LIΔ相比国际劳工组织、核糖体、PTS和群体感应是LIΔ中最显著富集的通路国际劳工组织：：他(图3.E).与LI相比，在LIΔ中，原核生物的核糖体和碳固定途径以及丁酸盐代谢是最显著富集的途径国际劳工组织：：他(图3.F)。

基于KEGG通路富集分析结果，我们选择了与细菌毒力相关的群体感应和PTS通路进行进一步研究。与LI相比，LIΔ中AgrA、AgrB和AgrC的蛋白表达水平均下调国际劳工组织(附加文件3.A)与LIΔ相比国际劳工组织，在LIΔ中，AgrB蛋白表达水平上调国际劳工组织：：他(附加文件3.B)在LIΔ国际劳工组织：：他， AgrA、AgrB和AgrC的蛋白表达水平恢复到与LI相当的水平(附加文件3.C)。

与LI相比，LIΔ中CelA、CelB、ManX、GfrB、GfrC、GfrD和FruA/B的蛋白表达水平下调国际劳工组织；LIΔ中GatA、GatB和GatC蛋白表达水平上调国际劳工组织(图4）.

与LIΔ相比国际劳工组织LIΔ中，CelA、CelB、ManX、GfrB、GfrC、GfrD和FruA/B蛋白表达水平上调国际劳工组织：：他；LIΔ中GatB蛋白表达水平下调国际劳工组织：：他(图。5）.

与LI相比，LIΔ中CelA、CelB、CelC、ManX和GatC的蛋白表达水平上调国际劳工组织：：他(图6）.

群体感应和PTS通路相关基因使用RT-qPCR进行验证(附加文件4a - b)。这些结果与转录组测序结果一致。

差异通路的表型分析

生物膜

半定量晶紫染色法(图7A)和可行计数方法(图7B)测定各菌株在不同时间点的生物膜形成能力。4株菌株的生物膜生长均在第3天达到峰值。半定量结晶紫染色显示，溶血素基因缺失菌株的生物膜形成能力低于野生型菌株，而修饰菌株恢复到野生型菌株水平的能力。但生物膜中包裹的活细菌数量没有差异。这表明生物膜的差异不是由活细菌的数量引起的，而是源于构成生物膜的其他生物分子，如DNA、RNA、肽聚糖、胞外多糖、蛋白质和磷脂。利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察各菌株形成生物膜的能力(图7C).缺失菌株分布稀疏，观察到大量死亡菌。通过LSCM测定各菌株的生物膜体积(图7D). LIΔ的生物膜总体积和活菌体积国际劳工组织：：他组均高于其他3个品系组，但差异无统计学意义。但缺失菌株的死菌量高于其他3个菌株。经蛋白酶K处理后，各菌株的生物膜均被完全降解(图7E). LSCM还用于构建每个菌株生物膜的三维(3D)图(图7F).缺失菌株分布稀疏，死菌数量多，而野生型和改良菌株分布紧密，死菌数量少。利用LSCM测定各菌株的生物膜厚度(图7G). 4个菌株中，缺失菌株的生物膜厚度低于野生型菌株，而修饰菌株的生物膜厚度最高。第3天利用扫描电镜观察各菌株生物膜的形成情况(图7H)。

通过扫描电镜可以直观地观察生物膜的微观特征。从图片(×5000)可以看出不同菌株形成的生物膜微观结构明显不同。后国际劳工组织敲除后，载玻片上细菌细胞和胞外多糖积累较少，补充溶血素后形成致密的生物膜。

毒力因子基因转录水平

用单糖(葡萄糖)和双糖(纤维素二糖)作为单碳源培养细菌。在葡萄糖存在时，与LI相比，缺失菌株毒力基因的转录水平除prfA，均显著上调，差异有统计学意义。后他与LI组相比，添加LI组的毒力基因转录水平下调幅度更大(图8A).在纤维素二糖存在时，毒力基因的转录水平除virR，与LI相比显著上调。除了smcL而且virR后，毒力基因转录水平下调他但仍高于LI组(图8B)。

本研究通过预测LLO和ILO的基本性质和结构，比较LI的转录组分析结果(LIΔ)，揭示了LLO和ILO之间的功能差异国际劳工组织、LIΔ国际劳工组织：：他，这可以弥补劳工组织职能方面的差距和数据的缺乏。

采用ProtParam和Compute pI/Mw在线软件包进行pI计算。LLO (pH = 7.63)的pI呈弱碱性，ILO (pH = 5.93)的pI呈弱酸性。巨噬细胞溶酶体腔的pH值为酸性(pH = 4.5-5.0)。LLO的pI远高于溶酶体腔的pH，而ILO的pI几乎等于溶酶体腔的pH。据报道，LLO在中性pH下表现出非常弱的溶细胞活性，但在pH < 6时表现出很强的活性。也就是说，LLO在接近其pI的环境中表现出较弱的膜穿孔活性[21］．这是由于在LLO的跨膜结构域中存在pH传感器。没有明确的研究表明，国际劳工组织有类似的成分。即使有，在pH值接近pI的环境中，这种pH传感器的效果也是有限的。此外，LLO比ILO在溶酶体中解离更多的阳离子。我们推测这些游离阳离子在溶酶体中也具有一定的质子海绵效应。阳离子材料已被证明具有质子海绵效应[22］．明显的pI差异可能是ILO帮助细菌逃离溶酶体的能力弱于LLO的原因之一。TMHMM软件预测显示，LLO和ILO均不具有跨膜结构，不是跨膜蛋白。相反，它们是分泌蛋白。丘吉尔等人的评论。[23]也表明LLO是LM进入宿主细胞质所必需的分泌蛋白。

转录组测序显示敲除国际劳工组织和恢复他影响核糖体、quorum和PTS通路。其中，群体感应途径是最有趣的途径之一，生物膜形成是群体感应途径中最重要的表型之一。生物膜是生长在表面的微生物群落[24］．生物膜的形成包括五个阶段:初始细菌定植、细胞外基质分泌、早期形成、成熟分离和扩散[25］．生物膜的形成并不是一个简单而统一的过程，而是一个连续而动态的过程，并受到细菌群体感应系统的调节和控制[26］．革兰氏阳性菌群体感应系统在调节和控制生物膜形成中的作用首次在金黄色葡萄球菌。群体感应系统依赖于辅助基因调节(Agr)系统[27]，由一个仲裁感应模块和一个双组件系统组成[28］．删除阿格拉会损害LM早期生物膜的形成[29]和删除agrD减少LM的生物膜形成[30.］．Agr系统中的因子对细菌粘附、免疫逃逸、毒素和入侵相关蛋白酶的产生很重要[31］．在本研究中，与LI相比，后国际劳工组织基因敲除阿格拉，agrB,agrC均下调，LIΔ国际劳工组织降低了。然而，恢复之后他，agrB上调至与LI相当的水平。LIΔ的生物膜形成能力国际劳工组织：：他比李的还要强。有趣的是，表达水平agrD在本研究中没有变化，表明国际劳工组织敲除与互补他可能对表达水平没有影响agrD。预测的调控机制国际劳工组织在quorum sensing pathway中的敲除在图中明确9。

据我们所知，这是第一份关于两者之间直接相关性的报告李斯特菌溶血素和生物膜的形成。

PTS通路由酶I (EI)、磷酸组氨酸载体蛋白(HPr/NPr)、酶II (EII)复合物和其他组分组成[32]，存在于各种细菌中。该途径主要参与糖的运输和磷酸化。在LM中，PTS通过影响细菌对碳资源的利用来影响毒力基因调控因子PrfA，从而影响毒力基因的表达。李斯特菌含有多种功能不同的毒力因子，其中与环境耐受相关的毒力因子受PrfA和SigB的调控。黏附侵袭相关毒力因子鞘磷脂酶C (smcL)位于LI特有的致病性岛(LIPI-2) [16］．这种毒力因子介导初级吞噬体膜的破坏，促进细菌细胞内增殖，其产物与溶血活性和溶解噬菌体的能力有关[33］．细胞内感染相关毒力因子包括PrfA、LLO和肌动蛋白组装诱导蛋白A (ActA)。它们与锌金属蛋白酶前体(Mpl)一起形成第一致病性岛(LIPI-1)，也称为prfa依赖的毒力基因簇[34］．双组分系统反应调节剂VirR是继PrfA之后第二重要的毒性调节剂[35］．一项研究[36]发现LM突变体缺乏CelC1而且CelR， PTS通路中与双糖代谢相关的基因，或缺乏CelA基因，表现出低纤维素糖的消耗。删除CelC1或CelR阻止了双糖引起的毒力基因的抑制，但这不适用于葡萄糖和果糖。本研究的转录组测序分析表明CelA而且CelB都被调低了国际劳工组织淘汰后上调他互补。这些基因的转录表达的这种变化会影响重要的细菌毒力基因的表达。因此，我们检测了5个毒力基因的转录水平(sigB，prfA，学报，smcL,virR)在以葡萄糖或纤维二糖为单一碳源的培养基中生长。在葡萄糖存在的情况下，毒力基因的表达水平上调国际劳工组织与LI相比，基因敲除后下调甚至低于LI他。以纤维二糖作为单一碳源也得到了类似的结果。后国际劳工组织敲除后，大部分毒力基因表达水平上调，但仍高于LI。我们的结果与Cao等人的实验结果不完全一致。[36］．我们观察到的下调CelA而且CelB后国际劳工组织敲除不仅下调了纤维素二糖诱导的毒力基因的抑制，而且下调了葡萄糖诱导的抑制。值得注意的是，我们的转录组测序结果并没有揭示这一点国际劳工组织敲除改变了PTS通路中糖代谢相关基因的表达水平。这种变化的具体机制以及是否由PTS通路介导仍有待评估。

转录组测序分析显示，敲除蛋白后，群体感应和PTS通路发生显著改变国际劳工组织和恢复他。这两种途径在调节细菌毒力方面发挥重要作用，这与细菌感染宿主和宿主对病原体的免疫反应密切相关。必须在细胞和动物水平上对这三种菌株进行免疫评估。需要进一步的研究来确定LIΔ国际劳工组织：：他能比LI引发更多的免疫反应，是否LIΔ国际劳工组织：：他比LI更有效。在本研究中，我们只检测了与群体感应途径相关的生物膜形成能力和与PTS途径相关的毒力基因的表达。原核转录组测序结果有待进一步研究。此外，本研究仅对参考菌株及其衍生菌株进行了研究。认为野生菌株可能表现出不同于参考菌株的生物膜形成能力，具有更高的适应性和持久性。因此，后续的研究应包括更多的野生菌株。在巨噬细胞或小鼠感染该菌株后，必须进行转录组测序，以揭示ILO和LLO在体内和肿瘤微环境中的免疫调节机制。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

我们感谢上海个人生物技术有限公司转录组测序和分析，以及四川大学公共卫生与预防医学省级实验教学中心的支持。

国家自然科学基金项目(No. 31570924)和四川省科技厅重点项目(No. 2021YFQ0060 & No. 2021YFS0005)资助。

作者指出

1. 李瑞丹，梁倩和田思成是本文的共同第一作者

作者及隶属关系

1. 四川大学华西公共卫生学院华西第四医院公共卫生检验科，四川成都610061

   李瑞丹，梁倩，田思成，张云文，刘思静，欧倩，王川

2. 深圳市生化联盟生物科技集团有限公司，广东深圳518057

   李瑞丹，梁倩，陈兆彬

贡献

CW和ZBC构思并设计了研究。RDL、QL、SCT、YWZ、SJL、QO进行实验，采集、解释和分析数据。RDL和CW撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Zhaobin陈或川王。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

处理编辑:Marcelo Gottschalk

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