fabp4介导的脂滴形成gydF4y2Ba链球菌uberisgydF4y2Ba-感染的巨噬细胞支持宿主防御gydF4y2Ba

泡沫巨噬细胞含有突出的细胞质脂滴(ld)在多种传染病中被发现。然而，他们在gydF4y2Ba链球菌uberisgydF4y2Ba-诱发性乳腺炎尚不清楚。在此，我们报告gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染增强了巨噬细胞的脂肪酸合成途径，导致LD水平急剧升高，同时炎症反应明显增强。这一过程是由脂肪酸结合蛋白4 (FABP4)介导的，FABP4是脂肪酸结合蛋白家族的一种亚型，在代谢和炎症中起关键作用。此外，FABP4 siRNA抑制剂细胞模型显示，LDs沉积减少，mRNA表达减少gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba，gydF4y2BaIl1bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba白细胞介素6gydF4y2Ba在基因沉默后显著下调。结果，巨噬细胞中的细菌负荷增加。综上所述，这些数据表明巨噬细胞LD的形成是宿主驱动的免疫反应的组成部分gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba。FABP4通过ld促进炎症，这应该被认为是药物开发治疗感染的新靶点。gydF4y2Ba

牛乳腺炎是乳业中最重要的经济传染病[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。这种情况是由特定病原体引起的感染引起的乳腺组织炎症。牛乳腺炎病因复杂，其多因素性质使其难以控制[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba链球菌uberisgydF4y2Ba是世界公认的乳腺炎最重要的环境致病菌之一。这种细菌大量存在于环境和奶牛的解剖部位[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。有相当一部分是由亚临床和临床乳腺内感染引起的gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba在泌乳和非泌乳奶牛中[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。最近的数据表明，发病率gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba全球感染正在增加[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

脂滴(ld)最初被描述为脂肪细胞中的脂肪储存细胞器，但越来越多地认识到脂质代谢的动态参与者[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，在糖尿病等疾病中起着重要作用[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]和癌症[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]和免疫调节，特别是宿主和病原体之间的相互作用[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。寄生虫(如锥虫)[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba),gydF4y2Ba恶性疟原虫gydF4y2Ba［gydF4y2Ba11gydF4y2Ba])，细菌(如gydF4y2Ba分枝杆菌gydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),gydF4y2Ba衣原体gydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba])，以及病毒(如gydF4y2Ba丙型肝炎gydF4y2Ba［gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),gydF4y2Ba登革热gydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2Ba])在其生命周期中诱导和靶向ld。目前的观点是，ld通过为微生物提供有效生长的底物来支持感染。病原体需要宿主来源的脂质来支持它们的生命周期;ld提供了这些脂质的来源。因此，ld具有提供有效的宿主防御细胞内病原体的潜力。甘油三酯(TG)的合成对于炎性巨噬细胞的最佳激活至关重要，因为其抑制作用可以阻止LD的发展，对炎症介质(包括IL-1β、IL-6和PGE2)的产生以及吞噬能力有显著影响[j]。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。Dias等人指出，LDs在sars - cov -2感染单核细胞中调节炎症介质的产生具有重要功能[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。我们的实验室之前发现gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染显著增加乳腺上皮细胞的ld，而这些ld似乎支持病原体感染[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。巨噬细胞是乳腺组织中最重要的免疫细胞，LD水平对病原体侵袭的影响及其具体机制尚不清楚。gydF4y2Ba

脂肪酸结合蛋白4 (FABP4)是脂肪酸结合蛋白家族的一个亚型，是脂质代谢和炎症的关键递质[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。FABP4在前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中被认为是一种强烈上调的胞质蛋白[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。其丰度与游离脂肪酸呈正相关，高水平的FABP4可直接损伤内皮细胞。相反，受损的内皮细胞由于甘油三酯、胆固醇等脂质代谢紊乱的沉积，可促进FABP4水平的升高[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。在巨噬细胞中很容易检测到FABP4的表达，特别是在炎症激活时[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。Dou等研究结果表明，在体外和体内，外源性FABP4干扰脂肪细胞分化，诱导p38/ hsl介导的脂肪分解和p38/NF-κ b介导的脂肪细胞炎症[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。因此，FABP4在调节炎症和脂质代谢中起关键作用。Xu的研究结果表明FABP4通过促进炎症和脂质代谢参与肾间质纤维化[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。然而，FABP4在感染过程中的具体作用尚不清楚。gydF4y2Ba

在此，我们报告gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染引起巨噬细胞中LD水平的激增，并伴有炎症的急剧增加，通过脂肪酸合成途径调节LD水平可以有效地控制炎症和细胞内细菌负荷，这可能有助于破译抗微生物防御的分子机制，可以用于开发新的抗感染药物。gydF4y2Ba

链球菌uberisgydF4y2Ba(菌株0140J)接种于Todd-Hewitt肉汤(THB)中，在37°C的轨道振动器中孵育至对数相生长(OD)gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.4 - -0.6)。RAW264.7细胞以1 × 10的密度接种gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba然后在含有10%胎牛血清的Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(DMEM) (FBS, Gibco, USA)中于37°C培养。在达到70-80%的融合度后，用或不加40µM BMS309403 (FABP4抑制剂:Selleck Chemicals, Houston, TX, USA)处理24小时，360µM油酸(Sigma-Aldrich, USA)处理24小时，或10µM C75(脂肪酸合成酶抑制剂:Sigma-Aldrich, USA)处理24小时，均在37°C下，或用50 nM si转染gydF4y2BaFabp4gydF4y2Ba用Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen)在37℃下孵育24小时。转染试剂和siRNA (sigydF4y2BaFabp4gydF4y2Ba)购自广州瑞博生物科技有限公司(中国广东广州)。si的序列gydF4y2BaFabp4gydF4y2BaCCACACCAGTCTCCTCAAT。的干扰gydF4y2BaFabp4gydF4y2Ba通过qPCR和Western blotting对基因进行鉴定(图2)gydF4y2Ba7gydF4y2BaA和B)在细胞模型中。处理过的细胞感染了gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba根据不同的试验条件，在37℃下接种3 h，感染倍数(MOI)为10。分别收集上清液和细胞，在- 80℃保存待用。其他试剂和材料在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。油酸和C75对RAW264.7细胞活力的影响见附录gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

RNA提取及定量实时聚合酶链反应(qPCR)gydF4y2Ba

总RNA采用TRIzol试剂(TaKaRa，大连，中国)提取。利用逆转录酶和Oligo (dT) 18引物(TaKaRa)获得相应的cDNA。将cDNA的等分物与25µL SYBR混合gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba绿色PCR Master Mix (TaKaRa)和10 pmol每个特定的正向和反向引物。所有混合系统在ABI Prism 7300序列检测系统(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)中进行分析。采用Michael W. Pfaffl [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。所有引物序列(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)由中国北京津科公司合成。gydF4y2Ba

总蛋白提取和Western blottinggydF4y2Ba

Western blotting检测细胞内蛋白水平。用抗β-肌动蛋白抗体(Bioworld, USA)作为上样对照。细胞在冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，并在含有PMSF (Beyotime，南通，中国)的RIPA缓冲液(Beyotime，南通，中国)中冰上孵育30分钟。在5000 ×离心下收集上清gydF4y2BaggydF4y2Ba用Bicinchoninic Acid Assay Kit (Beyotime，中国南通)测定蛋白浓度，用分光光度计(Tecan, Männedorf，瑞士)检测蛋白浓度。蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，美国)。在室温(约10-25℃)下，用Tris缓冲盐水中稀释的5%脱脂乳(TBST)阻断膜4小时，并与合适的一抗在4℃下杂交过夜。一抗在TBST中稀释如下:β-actin(1:10 000)和FABP4(1:10 000)。在室温(约10-25℃)下，用辣根过氧化物酶(HRP)联抗兔IgG (CST, Massachusetts, USA, 1:10 000)二抗孵育1小时，前后分别用TBST洗涤3次膜。信号使用ECL Western Blot分析系统(Tanon, Shanghai, China)检测。使用ImageJ软件(NIH, USA)对波段进行定量分析。gydF4y2Ba

脂滴染色计数gydF4y2Ba

用BODIPY 473 /503染色RAW264.7细胞评价脂滴，便于流式细胞术定量中性脂含量[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。简单地说，用3ml PBS快速冲洗细胞以去除培养基。用2µM BODIPY在37°C黑暗中孵育15分钟后，在PBS中洗涤3次并分离细胞。细胞在400 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟，在PBS中重悬，并立即使用FACSCanto流式细胞仪(BD, New Jersey, USA)进行流式细胞术分析。使用CellQuest Pro采集和Flow Jo软件分析每个样品的10,000个细胞。gydF4y2Ba

BODIPY染色和显微镜gydF4y2Ba

盖片用3ml PBS洗涤3次，在室温下用4%甲醛固定15分钟。37℃，2µM BODIPY孵育15 min后，再用PBS洗涤3次。然后在室温下用10µM DOPY孵育10分钟，在PBS中洗涤3次，孵育5分钟。最后，用抗荧光猝灭封印剂淹没平板，用激光共聚焦显微镜拍照[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

生化参数评估gydF4y2Ba

RAW264.7细胞蛋白样品采用冷裂解缓冲液提取，BCA蛋白测定试剂盒检测。细胞裂解物中总胆固醇(TC)、甘油三酯(tg)和非酯化脂肪酸(NEFAs)的水平根据制造商的说明使用商业试剂盒进行测量。gydF4y2Ba

相关酶活性检测gydF4y2Ba

乳酸脱氢酶(LDH)和β-gydF4y2BaNgydF4y2BaRAW264.7细胞中-乙酰氨基葡萄糖酶(NAG)根据制造商的说明，用商业试剂盒测定。gydF4y2Ba

活菌计数试验gydF4y2Ba

在THB琼脂上列举活菌为菌落形成单位(CFU)。37℃孵育12 h后，用涂布板法计数cfu。RAW264.7电池，含或不含油酸，C75, BMS309403和sigydF4y2Bafabp4gydF4y2Ba在含10%胎牛血清的DMEM中孵育，以80%的合流度在6孔板中镀。感染后gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba在指数中相(OD)作用3 hgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.4 - -0.6),gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba-用含有100 mg/mL庆大霉素的PBS洗涤感染细胞3次(每次15 min, 37°C)，然后用不含庆大霉素的PBS洗涤。1.4 g成球10 min，收集细胞和上清液，用无菌三倍蒸馏水裂解等量细胞，37℃孵育12 h后用涂布板法计数cfu [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

细菌负荷的流式细胞分析gydF4y2Ba

链球菌uberisgydF4y2Ba在37°C的THB培养基中生长，直到达到ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba0.6。将培养基稀释至ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.3，新鲜培养基含有0.1 mM FITC-d-Lys (Shengguang, Xiamen, China)。稀释后的细菌在37℃下进一步孵育至ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba达到0.4-0.6。将细菌离心，用THB培养基洗涤3次，在细胞培养基中重悬。然后将细胞在20µmol FITC-d-Lys(一种化学生物学方法，可以在细胞壁合成过程中快速和共价结合并检测荧光衍生的肽聚糖成分)中在37℃下孵育3小时，在PBS中洗涤3次，并用胰蛋白酶分离。然后将细胞在400 ×下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟，在PBS中重悬，并立即使用FACSCanto仪器进行流式细胞术分析;使用CellQuest Pro采集软件和FlowJo软件分析1万个细胞/样品。gydF4y2Ba

免疫荧光染色gydF4y2Ba

填充细胞的载玻片用PBS洗涤3次，用4%甲醛固定15分钟，再用PBS洗涤3次，用0.5% PBST渗透细胞膜20分钟。再用PBS洗涤3次，然后用5%山羊血清在室温下封片2小时。再次用PBS洗涤3次，用稀释的一抗(1:100)在4℃下孵育过夜。PBS洗涤3次后，加入二抗(1:10 000)，室温孵育2小时。再用PBS和10 μM DAPI洗涤3次，洗涤10分钟。PBS洗涤3次后，用抗荧光猝灭封印剂浸泡，激光共聚焦显微镜拍照。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。样本数和重复次数在图例中显示。所有数据采用非配对t检验或单因素方差分析，如图图例所示。所有数据都表示为平均值±标准差(SD)或平均值的标准误差(SEM)。对于所有的实验，gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05为显著性。gydF4y2Ba

巨噬细胞中ld的积累与gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染gydF4y2Ba

宿主ld与多种病原体感染有关[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。荧光染料BODIPY493/503用于细胞内ld的特异性染色。通过激光共聚焦显微镜，我们发现巨噬细胞的ld在gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaA).此外，流式细胞术定量分析证实gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba巨噬细胞(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba1gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

美国uberisgydF4y2Ba增加巨噬细胞的脂肪酸合成gydF4y2Ba

ld水平与脂质代谢密切相关。我们实验室之前的研究结果表明gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染改变乳腺上皮细胞脂肪酸合成途径[j]gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]和老鼠[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。我们试图确认细菌是否对巨噬细胞有类似的作用。通过测量参与脂肪酸合成的多个基因的mRNA水平，我们发现gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba不同程度地显著增加了它们的表达(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba2gydF4y2BaA). LD水平不仅与脂肪酸合成有关，还与脂肪酸氧化和外源脂肪酸的吸收有关。gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染显著降低了脂肪酸氧化途径相关基因的表达水平(gydF4y2BaAcox1gydF4y2Ba和gydF4y2BaEhhadhgydF4y2Ba） （gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)并显著上调gydF4y2BaCd36gydF4y2Ba(与外源脂肪酸的吸收有关)(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba2gydF4y2BaC)进一步验证gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba导致巨噬细胞脂肪酸合成增加，我们检测了细胞内NEFAs水平(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaD)，甘油三酯(TGs)(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaE)和总胆固醇(TC)(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaF).虽然TC没有表现出明显的变化(gydF4y2BaPgydF4y2Ba> 0.05)， NEFA和TG含量显著升高(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba。因此，在巨噬细胞中引起的LD增加gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba可能与脂肪酸合成增加有关。gydF4y2Ba

调节脂质代谢影响巨噬细胞的ldgydF4y2Ba

为了进一步验证巨噬细胞ld与脂质代谢之间的关系，我们使用脂肪酸合成酶(FASN)特异性抑制剂C75阻断脂肪酸的从头合成，并加入油酸刺激ld的形成。共聚焦显微镜(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA)和流式细胞术(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB和C)数据表明，C75预处理改善了由gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，而油酸显著提高LD水平(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。C75预处理降低NEFA(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD)和TG(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaE)巨噬细胞(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，而油酸显著提高了两者(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。TC含量(图1gydF4y2Ba3.gydF4y2BaF)，各组间无显著变化(gydF4y2BaPgydF4y2Ba> 0.05)。综上所述，这些结果进一步证明脂肪酸合成与LD水平密切相关，并且在巨噬细胞中，LD含量可以通过影响脂肪酸代谢途径来调节。gydF4y2Ba

增加的ld降低了gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba巨噬细胞负荷gydF4y2Ba

ld不仅是储存中性脂肪的细胞器，而且在病原体和宿主之间的相互作用中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。本研究发现C75和油酸显著影响巨噬细胞细菌负荷，同时调节巨噬细胞LD水平。细胞内内容物涂布计数(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2BaA)表明C75显著增加了gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba殖民地(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，而油酸显著降低了细菌数量(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。为了验证这一结论，我们使用FITC-D-Lys荧光染料进行染色gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba。定量流式细胞术显示，C75能显著提高细胞荧光强度(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba4gydF4y2BaB)，而油酸则引起相反的趋势(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba4gydF4y2BaC)。这些结果表明，促进LD的形成可以有效地减少细胞内细菌负荷，反之亦然。gydF4y2Ba

ld升高导致巨噬细胞过度炎症和细胞损伤gydF4y2Ba

越来越多的研究表明，ld不仅在脂质稳态中起着重要的调节作用，而且通过不同的途径参与炎症反应[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。我们探讨了ld是否通过影响炎症介质的表达来发挥抗菌作用。通过检测巨噬细胞中多种细胞因子的mRNA水平，我们发现gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染引起的表达急剧增加gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个),gydF4y2BaIl1bgydF4y2Ba(图gydF4y2Ba5gydF4y2BaB)和gydF4y2Ba白细胞介素6gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba5gydF4y2BaC)。gydF4y2BaIl1bgydF4y2Ba增长了近4000倍(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。C75预处理显著降低mRNA水平(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，而添加油酸可提高炎性细胞因子水平(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。这些结果通过另外2个炎症相关基因的检测得到证实(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2BaD).在感染过程中，病原体触发先天免疫反应。过度的炎症会导致体内平衡失调。通过检测细胞损伤标志物NAG的酶活性(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2BaE)和LDH(图gydF4y2Ba5gydF4y2BaF)，我们发现C75有效地降低了它们的活性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，而油酸预处理加重了gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。因此，由gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba参与巨噬细胞的炎症反应。gydF4y2Ba

FABP4负责LD的积累gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba挑战gydF4y2Ba

为了进一步探索巨噬细胞中ld和炎症反应调控的具体机制，我们重点研究了FABP4蛋白。FABP4不仅参与脂肪酸的合成，还参与炎症反应的激活[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。我们发现gydF4y2BaFabp4gydF4y2Ba基因和蛋白表达显著增加gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染(数据gydF4y2Ba6gydF4y2BaA和B)， C75有效下调表达(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，油酸显著提高了(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。特异性染色FABP4蛋白和脂滴，共聚焦显微镜显示(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2BaC)巨噬细胞中FABP4的表达随着ld的增加而增加。这些结果提示FABP4可能介导巨噬细胞lld的形成gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染。gydF4y2Ba

FABP4有助于LD增加，改善细菌负担gydF4y2Ba

为了进一步验证FABP4是参与调节LD水平的靶蛋白，我们使用小干扰RNA和生化抑制剂BMS309403抑制FABP4的表达。如果gydF4y2BaFabp4gydF4y2Ba和BMS309403显著降低了由gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba7gydF4y2BaA和B)。两种处理均降低了脂肪酸合成相关基因的表达水平(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba7gydF4y2BaC).流式细胞术结果(图2)gydF4y2Ba7gydF4y2BaD)和免疫荧光(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaE)结果显示，通过降低FABP4 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。细胞中炎症相关基因的表达也显著降低(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba7gydF4y2BaF和G)。相应地，抑制FABP4表达后，巨噬细胞细菌负荷显著增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba综上所述，FABP4促进了细胞内ld的合成，增加了炎症反应，从而降低了细胞内细菌负荷。gydF4y2Ba

致病性感染改变宿主代谢，常导致脂肪酸代谢失调和ld升高[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。小鼠细胞系RAW264.7是一个合理的模型，因为它已经被其他人验证，当受到gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。在这项研究中，我们发现gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染通过增加脂肪酸合成导致巨噬细胞ld急剧增加。通过调节脂质代谢促进LD合成，有效增强炎症，减少细胞内细菌负荷。减少FABP4的表达可有效降低LD水平和炎症反应，并导致细胞内细菌的增加。这一发现与表明ld在支持宿主防御病原体方面发挥重要作用的研究相一致[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。这些数据表明FABP4具有抑制作用gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba通过促进炎症和LD的增加，为预防和控制乳腺炎创造了潜在的新药物靶点。gydF4y2Ba

巨噬细胞是乳腺中最重要的免疫细胞之一。证据显示，LDs在促进免疫反应方面发挥作用[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。Bosch等人发现哺乳动物ld具有蛋白质介导的抗菌能力，这种能力在多微生物败血症和LPS的作用下得到增强[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。Knight等人的研究表明，IFN-γ驱动的hif -1α依赖的信号通路将巨噬细胞脂质重新分配到LD中，巨噬细胞LD的形成是宿主驱动的适应性免疫反应的一个组成部分gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba［gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。在此，我们发现巨噬细胞的LD增加发生在gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba油酸刺激的LD形成进一步上调炎症并减少细胞内细菌负荷。此外，脂肪酸合成酶的抑制可以降低LD水平和炎症。这些结果进一步支持了lld在宿主防御感染中的重要作用(图2)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

FABP4是脂肪酸结合蛋白家族的一员，参与脂质代谢和炎症。该分子是T细胞、树突状细胞和巨噬细胞以及实验性炎症模型中炎症过程的重要介质[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。最近的研究表明，FABP4抑制剂可以减少脂质诱导的内质网应激相关炎症，改善脂质沉积，抑制ROS和核因子κB (NF-κB)易位[qh]gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。Ge等人的研究表明，蟑螂抗原(CRA)激发的fabp4缺陷小鼠嗜酸性粒细胞减少，气道炎症明显减轻[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。我们发现FABP4的表达在gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba其表达水平与细胞内ld的变化一致。此外，通过干扰RNA或特异性抑制剂沉默其表达可有效降低巨噬细胞炎症水平，从而增加细胞内细菌的数量。这些结果表明，FABP4介导LD合成，促进细胞的炎症反应，以抵抗细胞的侵袭gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba尽管确切的机制需要进一步研究。gydF4y2Ba

巨噬细胞感染多种细胞内病原体时可形成LD，包括gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba。我们实验室之前的一项研究发现gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba特异性诱导LD形成，作为一种致病策略，以创造宿主脂质库，作为碳源，促进乳腺上皮细胞内细菌生长[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。在此，我们证明了LD的形成不是细菌驱动的过程gydF4y2Ba美国uberisgydF4y2Ba感染，而是由于巨噬细胞的免疫激活作为宿主防御机制的一部分而发生的。这一发现与gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba巨噬细胞LD形成是IFN-γ激活的适应性免疫反应的一部分[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。成功的先天防御对生存至关重要，宿主物种有效地与病原体共同进化，产生过多的免疫反应。作为所有真核细胞中生物体的重要营养来源，ld储存和供应必需的脂质，以产生信号分子、膜构建块和代谢能量。它们也是病原体和宿主防御的重要参与者。一方面，病原体抢夺宿主的营养物质以支持自身的细胞内生长和繁殖，另一方面，宿主进化出一种针对ld的免疫反应来对抗感染。巨噬细胞在形态和功能上与乳腺上皮细胞不同。巨噬细胞是抵抗细胞内细菌感染的主要途径。因此，我们假设LDs在巨噬细胞中进化出了不同于上皮细胞的免疫功能，主要发挥抵抗而不是促进感染的作用。gydF4y2Ba

总之，我们的研究结果为FABP4在ld中通过增加炎症来减少细菌负荷的作用提供了证据(图2)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.调节脂质代谢以对抗细菌暴露了许多治疗机会。我们强调ld构成细胞内的第一道防线。微生物和宿主细胞之间的进化策略竞争表明，调节宿主代谢可能能够限制病原体，最终控制感染。我们也需要注意到研究的不足之处。在目前的研究中，我们只使用了一种脂肪酸(油酸)，如果选择另一种脂肪酸或混合脂肪酸，结果可能会有所不同，这可能更能反映体内发生的情况。gydF4y2Ba

经费支持:国家自然科学基金资助项目[批准号:32072867,32273013];江苏省农业科技自主创新专项基金[批准号cx (20) 3157];上海市农业应用技术发展计划项目[资助号:2020-02-08-00-08-F01489];兵团重点科技项目[批准号2020AB025];江苏省研究生科研与实践创新项目(KYCX22-0781)和江苏省高校重点学科建设项目。我们感谢Howard Gelberg博士(俄勒冈州立大学)对本文的编辑。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 万志新和傅绍东对这项工作也作出了同样的贡献gydF4y2Ba

作者及单位gydF4y2Ba

1. 南京农业大学动物医学院动物生理与生物化学重点实验室，动物卫生与食品安全教育部国际联合实验室，南京210095gydF4y2Ba

   万志新，傅绍东，王正磊，徐媛媛，周媛媛，林新光，兰日国，苗金峰gydF4y2Ba

2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海，200241gydF4y2Ba

   Xiangan汉gydF4y2Ba

3. 克兰菲尔德大学水、能源与环境学院，英国贝德福德郡克兰菲尔德，mk430algydF4y2Ba

   振华罗gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

志伟:概念化、可视化、数据整理、形式分析、写作-原稿、写作-审稿编辑、项目管理、软件。SF:概念化、可视化、数据管理、形式分析、写作审查和编辑、项目管理、软件。数据管理、文审编辑、项目管理、软件。YX:数据管理、软件、写作审查和编辑。YZ:数据管理、软件、项目管理、写作审查和编辑。XL:数据管理、项目管理、软件。RL:概念化，可视化，写作-审查和编辑，项目管理，软件。ZL:可视化，写作-原稿，写作-审稿，编辑。XH:概念化、可视化、资金获取、撰写-原稿、撰写-审稿、编辑。JM:概念化、可视化、获得资金、撰写-原稿、撰写-审查和编辑。 All authors read and approved the final manuscript.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba金丰苗gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba