法国家畜中耐粘菌素细菌的筛选

粘菌素经常被用作动物的生长因子或治疗传染性细菌疾病。欧洲药品管理局(EMA)兽医部门限制使用粘菌素作为二线治疗，以减少粘菌素耐药性。2020年，从法国南部的鸡、牛、绵羊、山羊和猪身上收集了282份粪便样本。为了追踪出现的动员性粘菌素耐药(mcr在2021年重新收集了111个样本，包括来自同一地点的猪粪便、食物和水。所有样品均在选择性露西·巴尔代·让-马克·罗兰(Lucie Bardet Jean-Marc Rolain, LBJMR)培养基中培养，采用MALDI-TOF质谱法鉴定菌落，然后进行抗生素药敏试验。采用PCR和Sanger测序筛查mcr基因。选择性培养结果显示，共有35种细菌397种，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。猪具有最高的耐粘菌素细菌流行率和丰富的内在耐粘菌素细菌，从这些样品中，一个菌株兼有两者mcr -1,mcr -3人已被隔离。第二次采集让我们确定了304种细菌，并揭示了传播mcr -1,mcr -猪体内有3个。在其他样本中，自然地，耐粘菌素的细菌更常见，然而mcr -在鸡、绵羊和山羊样本中发现的1个变异基因最为丰富，在牛样本中发现的1个变异基因呈阳性mcr -3基因。动物是耐粘菌素细菌的潜在宿主，这种细菌因动物而异。需要采取干预措施和替代方案，以减少粘菌素耐药性的出现并避免人畜共患传播。

粘菌素(polymyxin E)是一种阳离子多肽抗生素，用作最后一线治疗药物，用于治疗细菌感染，特别是耐碳青霉烯的革兰氏阴性细菌[1]。

黏菌素作为一种生长因子在兽药中已经使用了几十年[2]。因此，粘菌素耐药性的高度传播与生态系统中通过选择压力使用粘菌素有关[3.]。欧洲医药管理局建议限制粘菌素的使用，因为它在流行病学研究中对排除粘菌素耐药性起着至关重要的作用[4]。

粘菌素耐药是由不同的机制介导的，包括染色体突变、携带动员粘菌素耐药的移动遗传元件(MGEs) (mcr)基因(转座子、整合子、质粒)、外排泵，甚至囊泡[5]。首先，据报道粘菌素耐药是由于染色体基因突变介导的调控修饰(mgrB，pmrAB，phoPQ) [6]。然后，在2015年，中国研究人员报告了第一个质粒介导的粘菌素耐药性mcr -这种基因已经传播到其他20个国家[7]。mcr基因散布在世界各地不同的生态系统中[8，9]。自2015年以来，已经发现了几种移动粘菌素耐药基因的变体，从mcr -2mcr -10 [10，11，12，13，14，15，16，17，18]。最近，在2022年，子变种mcr基因已被宏基因组分析发现[8]。通常情况下,mcr基因通过inc2、incchi2、IncX4、IncP、IncF和IncY等质粒运输，这些质粒具有很高的传播潜力[19]。

相比之下，一项回顾性研究发现mcr -1基因大肠杆菌上世纪80年代，粘菌素首次在中国用于食用动物，从家禽中分离出来。一种假设是，这是由于多粘菌素E在畜牧业中的使用[20.]。几项研究表明，传播mcr -1是由人畜共患传播引起的，特别是在人类使用粘菌素被禁止之后[21]。应该指出的是，动物与人类有直接和间接的接触，无论是为了食物还是作为伴侣。环境、动物、人类和生态系统之间的接触使人类容易受到抗生素耐药因素的人畜共患传播，这些因素包括具有内在耐药的细菌或通过MGEs获得的耐药细菌[22，23，24]。

在过去十年中，世界各地广泛报道了许多细菌对粘菌素的耐药性[25]。然而，法国缺乏关于动物中对至关重要的抗菌素具有耐药性的细菌流行情况的信息。最近，Dufreche提供了法国兽医抗生素消费量的统计估计(422吨抗生素)[26]。目前的研究旨在筛选从鸡、牛、山羊、绵羊和猪等家畜中分离出来的耐粘菌素细菌。此外，本研究是在法国抗菌素耐药菌株监测网络的背景下进行的。

样本收集和伦理授权声明

在2019年至2020年期间，从法国四个不同的县收集了粪便样本。为了获得新鲜的粪便，在兽医的协助下收集了粪便。使用无菌棉签和木制医用抹刀收集每只动物的粪便样本。兽医报告说，法国的动物在卫生、食品消费和限制抗生素使用方面都处于标准规则之下。采用无菌试管和无菌抹刀采集5种动物标本282份:来自德罗姆县的鸡;山羊来自Bouches-du Rhône;克鲁塞河的牛羊;来自沃克卢兹的猪。山羊的样品被制成颗粒，但在分析前用无菌水压碎。作为对猪粪便和食物样本进行流行病学监测的一部分，在首次采集一年后(即2021年)又采集了111个猪样本。 All the collected samples were stored at —80 °C for later use. The number of samples taken for each animal is presented in detail in Figure1。

2014年9月4日的第13 205 107号县级授权(Bouches-du-Rhône)授权ihu - m - - - - - 感染将未经处理的第1、2和3类动物副产品用于研究和诊断目的。2011年12月8日的另一项命令根据法规(EC) No 1069/2009和法规(EU) No 142/2011的适用，制定了有关动物副产品和衍生产品的卫生规则。

粘菌素耐药菌的筛选与鉴定

所有样品均悬浮于Tryptic Soy Broth培养基(TSB)中进行细菌富集，然后在Lucie Bardet Jean-Marc Rolain培养基(LBJMR)中进行培养。LBJMR培养基含有添加葡萄糖作为发酵底物的紫色琼脂。该培养基作为选择性培养基，含有4µg/mL硫酸粘菌素盐和50µg/mL万古霉素。在平板琼脂中肠杆菌科呈黄色，与2至3毫米大小的紫色琼脂形成对比。Enterococci菌株呈圆形，尺寸较小，0.1-1 mm [27]。菌株组根据革兰氏阴性菌(GNB)和革兰氏阳性菌(GPB)进行区分。GPB是天然耐粘菌素细菌，而(GNB)要么对粘菌素具有天然抗性，要么通过不同的机制获得耐药性。

从选择性琼脂板上选择不同形态的菌落。然后使用Microflex LS光谱仪(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)鉴定分离的细菌。分数在2.3 ~ 3.0范围内，分离菌株得到有效鉴定。这种鉴定依赖于Culturomics、BDAL和Timone数据库。对鉴定分数较低的脂肪质细菌进行蛋白质提取，提高鉴定分数。

抗菌药敏试验(AST)

所有在LBJMR培养基上生长的非天然粘菌素耐药GNB分离株均按照现行(DD)测试方法(Kirby-Bauer程序)进行AST检测。最小抑制浓度(MIC)经CLSI和EUCAST指南确认[28]。AST用确定浊度的细菌悬浮液在NaCl (0.5 McFarland;1.5 × 10⁸细胞/毫升)。抗生素试验包括16种抗生素:阿莫西林(AMX)、阿莫西林-克拉维酸(AMC)、头孢吡肟(FEP)、哌拉西林/他唑巴坦(TPZ)、头孢丙素(KF)、头孢曲松(CRO)、厄他培南(ETP)、亚胺培南(IMP)、磷霉素(FF)、呋喃妥英(F)、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑(SXT)、阿米卡星(AK)、环丙沙星(CIP)、多西环素(DO)、粘菌素(CT)、庆大霉素(GT) (Bio-Rad, Marne-la-Coquette，法国)。使用Multi-Experiment Viewer (MeV 4.9.0)对耐药表型进行分层聚类。

选取直径小于15 mm的窄抑制区(ZOI)菌株，采用其他互补试验，即e -test法(biomacimrieux)和UMIC试验(Biocentric Bandol，法国)确定最小抑制浓度[29]。此外，如果细菌对三种以上不同种类的抗生素耐药，则认为菌株具有多重耐药(MDR)。

粘菌素耐药基因的筛选

所有细菌都含有黏菌素MIC_上校≥2 μg/mL及天然耐药菌进行多项生物分子试验筛选以下内容mcr基因:mcr -1，mcr -2mcr -3.mcr -4，mcr -5和mcr -8 (30.]。值得注意的是，天然耐粘菌素的细菌可以携带mcr基因，比如变形杆菌［31]。

细菌DNA首先使用EZ1脱氧血液组织试剂盒(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)提取[32]。DNA纯度的吸光度测量范围为260至280 nm(分光光度计ND-100, Nanodrop Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)。的mcr然后用实时反应检测基因。qPCR使用CFX96 TM Real-time system/C。每个qPCR包含一个阳性对照模板大肠杆菌和肺炎克雷伯菌携带mcr基因是一个积极的控制因素大肠杆菌ATCC 25922为阴性对照。real-time PCR的循环阈值≤30时为阳性。qPCR结果经ST-PCR和Sanger测序与blast和比对分析证实mcr同源性≥90%的基因序列。

基因组测序和生物信息学分析

使用下一代测序工具(NGS)进行感兴趣的全基因组测序。使用Illumina MiSeq测序仪(Illumina, San Diego, CA, USA)和Oxford Nanopore GridION测序获得超深度和最佳质量的读取[33，34]。测序后的基因组使用Spades 3.5.0软件进行组装[35]，基因组注释使用Prokka [36]。抗生素耐药基因的研究使用不同的数据库，包括Resfinder [37]， arg-annot [38]，卡片[39]和质粒查找器[40]。

描述性和比较统计分析

所有耐粘菌素细菌按革兰氏数(GNB/GPB)分成2个群体。GNB粘菌素耐药群体通过两种不同的机制分离为自然和获得性粘菌素耐药菌。每个标准由细菌种类的数值表示。结果值以在各相关动物种群中的相对频率(百分比)表示。

动物中耐粘菌素细菌的筛选

在LBJRM选择性培养基上培养可以在家畜中分离出多种耐粘菌素的细菌。2019年至2020年期间，从鸡、牛、山羊、绵羊和猪的第一轮样本收集结果显示，从LBJMR琼脂板上分离出397株细菌，由35种不同的细菌组成。

在目前的研究中，对于鸡肉样本，96% (n113株分离株中为GNB。优势菌株是天然耐粘菌素的:75%的GNB是p .奇异君子兰和p .寻常的。鸡标本中获得性耐粘菌素GNB为:12% (n= 13)大肠杆菌， 4% (n= 5)假单胞菌fragi， 4% (n= 5)p . lundensis， 2% (n= 2)Ewingella美国1% (n= 1)枸橼酸杆菌属freundii。

从牛粪便中分离出101株耐粘菌素细菌，其中GNB和GPB分别占73%和27%。66%的GNB为天然耐粘菌素细菌，其中7二氧化铪alvei和42p .寻常的。获得性粘菌素耐药GNB占1% (n= 1)无色菌insolitus， 1% (n= 1)c . braakii， 1% (n= 1)c . freundii， 1% (n= 1)肠杆菌属下水道， 20% (n= 15)大肠杆菌， 4% (n= 3)p . putida4% (n= 3)鼠疫entercolitica。

从山羊样品中分离鉴定出37株耐粘菌素细菌。其中95%为GNB, 3%为天然耐粘菌素菌株(n= 1)布鲁氏菌grignonense60% (n= 21)h . alvei。相比之下，这些GNB的获得性粘菌素耐药性为28% (n= 10)大肠杆菌， 3% (n= 1)p . abietaniphila6% (n= 2)p . putida。

从绵羊样本中分离出13种耐粘菌素细菌，其中11种大肠杆菌, 1b . grignonense，和1h . alvei。

至于猪，53% (n133株分离细菌中，GPB和47% (n= 62)为GNB。90%的GNB自然耐粘菌素，43% (n= 27)Providencia heimbachae， 47% (n= 29)p .寻常的，p . hauseri，p .奇异君子兰和p . penneri。获得性粘菌素耐药性仅为6大肠杆菌是孤立的。动物中已鉴定细菌的流行病学结果如图所示2。

事实上，从2021年第二次采集的猪样本中分离出304种耐粘菌素细菌。在分离的细菌中，94%为GPB。60% (n= 176)为属属种乳酸菌在三种样品(食物、水和粪便)中发现。值得注意的是，用作生长因子的益生菌含有的生物量为乳酸菌这就解释了这种细菌在猪体内的繁殖。在下列种类的细菌中发现食物和粪便之间的双重交联l . reuterii，l .杆菌，l . rahmnosus，金黄色葡萄球菌，芽孢杆菌clausii，粪肠球菌，戊糖片球菌，p . acidilactici,Cryptobacterium curtu。此外，在水和粪便之间检测到交联l . agilis，l .粘膜，唾液l .，大肠hirae，粪大肠,p . pentosaceus。相比之下，细菌的三重交联被观察到p . pentosaceus。在一个粪便样本中，一个分枝杆菌icosiumassiliensis（n= 1)。关于GNB 13大肠杆菌和6h . alvei被确定。数字3.举例说明猪(粪便、饲料和水中)中耐粘菌素细菌的筛选。

抗生素耐药性表型

采用E-test检测获得性粘菌素耐药菌。所有被测细菌的最小抑制浓度MIC≥2，因此对粘菌素具有耐药性。进行了一系列抗生素谱试验，以确定动物中粘菌素耐药细菌中最常见的抗生素耐药表型。

从LBJMR培养基中分离得到的细菌均对粘菌素耐药，且抑菌带直径(ZOI)≤15 mm，其中86%的细菌对阿莫西林耐药，64%的细菌对阿莫西林-克拉维酸耐药大肠杆菌，p . lundensis，p . heimbachae，p . putida，p . fragi，答:insolitus，c . brakii和y enterocolitica。34%的分离株对哌拉西林/他唑巴坦耐药，包括1株c . freundii, 1大肠下水道, 1大肠杆菌， ２e .美国, 13p . heimbachae， ５p . fragi, 1p . lundensis和1p . putida。

对于头孢菌素家族，8%的细菌对头孢吡肟耐药，其中1大肠杆菌， ５p . heimbachae, 1p . putida和2p . lundensis。17%的患者对头孢丙素耐药，12%的患者对头孢曲松耐药。有趣的是，在本研究中观察到对碳青霉烯类的耐药性。事实上，23%的细菌对厄他培南有抗药性，其中22种p . heimbachae， ２大肠杆菌，和1大肠泄殖腔。根据本研究，5%的菌株对磷霉素和呋喃妥因耐药，其中3株耐药大肠杆菌, 1p . putida, 1p . lundensis和1p . heimbachae。此外，不到34%的测试细菌对环丙沙星、阿米卡星、强力霉素和庆大霉素耐药。所有抗生素耐药表型结果如图所示4。

粘菌素耐药性筛选mcr基因

在这项研究中，mcr -在几乎所有动物样本中都检测到1。的检测mcr通过三种多相方法对基因进行了确认。所有携带细菌的RT-PCR检测的CT值mcr所有筛选结果均经标准pcr、Sanger测序和序列分析证实，核苷酸同源率%≥90，与不同的基因有差异mcr基因变异。

在鸡的粪便样本中mcr3例检测到-1基因大肠杆菌隔离。关于牛，mcr -3基因在3例中被发现大肠杆菌隔离。对于山羊样本，mcr -其中4例检测到1个基因大肠杆菌而在绵羊样本中，该基因从6大肠杆菌隔离。在猪样本中，一种非典型n= 1大肠杆菌窝藏两mcr变体都mcr -1.1和mcr -3.5被分离出来，我们最近描述了它的基因组特征[41］_。相比之下，一年之后mcr基因与猪样本一起传播大肠杆菌被隔离，藏匿着不同的变种mcr基因，包括7mcr -1, - 1mcr -3，和一个的共存mcr -1/ mcr -3.这些菌株都是耐多药菌株，对三种以上的抗生素家族具有多种抗生素耐药基因(图2)5)。此外，总体分离携带mcr基因MIC≥4 mg/L, qPCR CT值小于30。

在这项研究中，大肠杆菌含有粘菌素抗性的菌株mcr所有动物的基因都很丰富。因此,大肠杆菌是动物，特别是农场动物体内的致病菌之一[42]。所有大肠杆菌菌株可诱发和引起与新生儿腹泻、断奶后腹泻(PWD)等症状相关的院内疾病，以及其他病理，包括疾病(OD)、败血症、多浆液炎、乳腺炎和尿路感染[43]。在法国，是抗粘菌素的大肠杆菌来自携带MCR的病猪-我已经被报道了[44]。此外，粘菌素耐药性在沙门氏菌与从不同国家的健康动物(包括猪、牛和家禽)中分离出的内在耐粘菌素细菌的比例相比，SPP往往较低[2]。先前的一项研究报告了GNB粘菌素耐药菌株在法国西部占主导地位[45]。自从发现了第一个携带mcr -1基因从中国猪中分离出来后，粘菌素耐药基因传播到世界各地，动物肠道成为粘菌素耐药的来源[qh]7]。此外，发现的mcr -2基因在比利时被发现，随后粘菌素耐药性在整个欧洲传播[10]。然而，尽管描述移动粘菌素耐药基因的研究越来越多，但发现自然耐药的相对频率高于获得性耐药。获得性粘菌素耐药GNB的粪便携带率较低，为1.4%，而高粘菌素耐药菌的粪便携带率为23% [45]。最近的一项关于猪的粘菌素抗性基因的研究发生在2009年和2013年mcr -79个猪样本中有70个检测到1个基因[4]。事实上mcr -1,mcr-3被发现于大肠杆菌还带着bla_CTX-M-55，分别用IncF18和IncF46质粒从健康的法国奶牛中分离出来[46]。在2005年至2014年期间，这种现象同时发生mcr -1基因和广谱β-内酰胺酶(ESBL)在法国腹泻小牛粪便中被报道具有潜在的人畜共患传播[47]。此外，粘菌素耐药性在世界范围内的出现并不一定与粘菌素的使用有关。粘菌素耐药性的传播通常是由于粘菌素耐药基因通过MGEs从动物传播给人类[48]。然而，粘菌素选择压力在粘菌素耐药性中起主要作用，因为长期使用这种抗生素作为生长促进剂和抗碳青霉烯耐药细菌的抗生素，导致各种传染病[2]。有时，当涉及耐多药细菌时，几种抗生素的重组是必要的k .肺炎据报道在法国携带了mcr的基因,bla_OXA-48,和bla_CTX-M-15［49]。许多综述总结了世界各地动物中粘菌素耐药性的现状。在五大洲的30多个国家中，最普遍的粘菌素耐药基因主要是mcr -1在西欧和南欧(西班牙、葡萄牙、德国和意大利)[50]。2013年，欧洲国家估计，对粘菌素的耐药性百分比大肠杆菌从健康动物消化道微生物群中分离的菌株仍< 1% [51]。沙门氏菌spp和大肠杆菌从意大利家禽中分离出来的一种具有高粘菌素耐药性的散发病例[52]。来自丹麦的动物性食品中的粘菌素耐药性很低，因为他们的农场严格使用粘菌素[53]。在意大利，火鸡的流行程度更高mcr -1大肠杆菌(21.9%)，而肉鸡(2%)和蛋鸡(9%)[52]。在2012年至2016年期间，三倍的同时发生mcr据报道，在比利时健康的猪、牛和家禽粪便中存在这种基因[54]。大肠杆菌据报道，在西班牙从猪和白鹳中分离出一种mcrIncX4, IncHI2，和inc2的载波[55]。

自2012年以来，动物在巴西的食品生产动物(鸡、猪、牛、山羊)和伴侣动物(猫、狗、马)中也成为粘菌素耐药性的隐蔽储存库[56]。值得注意的是，鸡，作为主要的食用动物，显示出最大的出现mcr基因(20.，21，57]。到2021年，伊朗有607人死亡大肠杆菌从肉鸡、鸵鸟、牛、羊、鸽子和狗身上收集的分离株被发现携带质粒介导的粘菌素抗性基因(mcr -1,mcr -2) (58]。的人畜共患病传播mcr从宠物到人类的基因已被广泛报道[59]。粘菌素耐药基因在狗与其主人之间的传播，含有大量阳性大肠杆菌与共现bla_CTX-M和mcr基因，已在中国发现[60]。应该指出的是mcr最近在法国有报道称狗和猫的基因30.]。在瑞士的河水和蔬菜样本中也经常发现粘菌素耐药性[61和其他研究发现mcr马来西亚水中的基因[62]。一项重要的公共卫生目标是防止抗粘菌素细菌通过人畜共患传播传播。

在本研究中，我们具体报道了在动物中筛选耐粘菌素细菌。本研究的一个局限性是使用黏菌素浓度为4 μg/mL的选择性培养基，可能会阻止低黏菌素MIC(小于4 μg/mL)的细菌和宿主的生长mcr基因。此外，与获得性粘菌素耐药相比，研究样品中固有的粘菌素耐药更为丰富。我们在此报告了粘菌素耐药基因(mcr)，用于法国各种家畜的食用。粘菌素在法国被认为是最后的抗生素，家畜对粘菌素的耐药性仍然很普遍。引起粘菌素耐药性传播的因素是多因素的，但主要是通过MGEs传播的。mg携带mcr基因很容易促进这些基因从一个生态系统到另一个生态系统的传播。的人畜共患病传播mcr应进一步研究基因，以减少与粘菌素耐药性相关的健康风险。

作者感谢Idir Kacel和Ludivine Brechard的基因组测序，以及Andriamiharimamy Rajaonison的基因组快速基因组分析。我们还要感谢伊迪尔·比塔姆教授的帮助。

ihu - msamditerransame感染支持了这项工作(参考文献:msamditerransame感染10-IAHU-03)。

作者及单位

1. 法国马赛让穆兰大道19-21号，法国马赛13005，法国马赛埃克斯马赛大学药学院APHM, MEPHI

   阿法夫·哈梅、伯纳德·达乌、布塞娜·哈斯纳维、大卫·卢潘德·姆维尼比图、让-马克·罗兰和赛蒂娜·m·迪安

2. 法国马赛让穆兰大道19-21号，13005

   Afaf Hamame, Bernard Davoust, David Lupande Mwenebitu, Jean-Marc Rolain和Seydina M. Diene

3. 法国马赛让穆兰大道19-21号VITROME, 13005

   Bouthaina Hasnaoui

贡献

概念化、AH、J-MR和SMD;方法学、AH和DLM;软件、AH和SMD;验证，J-MR和SMD;形式分析、AH和BD;调查、AH和BD;资源、SMD;数据管理，J-MR;撰写原稿准备，AH;撰写评审和编辑，SMD和BD; supervision, J-MR, BD, and SMD. All authors read and approved the final manuscript.

相应的作者

对应到赛蒂娜·m·迪恩。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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