热不稳定性肠毒素增强了产f4肠毒素gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba通过上调细菌黏附素和STb肠毒素对猪肠上皮细胞的黏附gydF4y2Ba

作为肠产毒素分泌的重要肠毒素之一gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(ETEC)，热不稳定性肠毒素(LT)增强了细菌在体内和体外的粘附;然而，其潜在机制尚不清楚。为了解决这个问题，我们使用IPEC-J2细胞模型评估了产生lt和缺乏lt的ETEC菌株的粘附性。评估不同ETEC菌株感染IPEC-J2细胞后炎症细胞因子、趋化因子和紧密连接蛋白的表达水平。此外，在环AMP (cAMP)处理后，还评估了产生f4ac的ETEC (F4 + ETEC)菌株的粘连素和肠毒素水平。遵守gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba与野生型菌株相比，突变株的粘附性降低，而1836-2/pBR322-eltAB菌株的粘附性较1836-2亲本菌株明显增加。LT的产生上调了TNF-α、IL-6、CXCL-8和IL-10基因的表达。然而，它似乎不影响紧密连接蛋白的表达。重要的是，我们发现cAMP导致粘连素的产生和STb肠毒素的上调。此外，经cAMP处理的F4 + ETEC菌株对IPEC-J2细胞的粘附力也较强gydF4y2BaΔfaeGgydF4y2Ba，gydF4y2BaΔ警察gydF4y2Ba,gydF4y2BaΔestBgydF4y2Ba突变体减少。这些结果表明，LT增强了F4 + ETEC的粘附，其主要原因是上调了F4菌毛、鞭毛蛋白和STb肠毒素的表达，为深入了解LT和ETEC的发病机制提供了思路。gydF4y2Ba

产肠毒素的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(ETEC)是新生儿和刚断奶仔猪腹泻和死亡的重要原因[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，由于全球高达5%的幼猪死亡，每年造成超过9,000万美元的损失[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．ETEC也是发展中国家儿童(特别是5岁以下儿童)和前往这些地区旅行的成年人腹泻的主要原因[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

ETEC的主要毒力因子是粘连素和肠毒素。在导致猪腹泻的ETEC中，粘连菌毛的变体有F4 (K88)、F5 (K99)、F6 (K99)、F18和F41，此外还有几种非粘连菌毛的粘连蛋白(鞭毛、AIDA-I) [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．肠毒素包括热不稳定肠毒素(LT)和几种热稳定肠毒素(STp、STb和EAST1) [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．粘附上皮细胞最初是由粘附素介导的，这导致ETEC定植宿主小肠。随后，定植的细菌产生毒素，导致电解质的损失，最终导致水样腹泻。虽然ETEC疾病的机制已被描述，但各种毒力因素如何导致初始细菌粘附尚不清楚。gydF4y2Ba

LT是ETEC产生的两种关键肠毒素之一，是典型的agydF4y2Ba_1gydF4y2BaBgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba毒素(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．全息毒素由单个LT组成gydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}亚基和五聚体LTgydF4y2Ba_BgydF4y2Ba亚基(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．LT与霍乱毒素(CT)具有相似的结构、生物学功能和致病机制gydF4y2Ba霍乱弧菌gydF4y2Ba它是霍乱的元凶。LT的gydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}亚基表现出adp核糖化活性并具有肠毒性，而LTgydF4y2Ba_BgydF4y2Ba亚基具有膜结合功能，特异性地与宿主细胞表面的GM1神经节苷苷受体结合[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．最近，Cervin等人发现，在小肠上皮细胞中表达的聚焦聚糖是CTB的主要受体，很可能也是LT的主要受体[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．LT产生肠道毒性和引起水样腹泻的机制是众所周知的。有趣的是，除了其肠毒性外，还发现LT在体外和体内细菌粘附中发挥重要作用[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

LT在增强与猪腹泻相关的F4ac + ETEC定殖能力方面发挥作用的第一个证据之一，是在一个gnotobiotic仔猪模型中观察到的[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．另一项研究表明，内源性生产或外源添加的LT可在体外增加猪源和人源ETEC菌株的粘附性[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．粘附增强主要是由于F4ac菌毛的表达增加，F4ac菌毛是介导F4ac + ETEC最初附着于肠上皮细胞的主要粘附素。最近的一项研究发现，LT触发了人类小肠上皮细胞上癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAMs)的产生，CEACAMs作为人类ETEC菌株表达的I型菌毛的受体，增强了细菌粘附[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．此外，还发现预先注射纯化LT毒素的仔猪表现出增强的后续反应gydF4y2Ba沙门氏菌血清gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．LT青睐gydF4y2Ba美国血清gydF4y2Ba黏液蛋白4的表达减少粘附，导致肠道黏液层的破坏。越来越多的证据支持LT在介导细菌粘附中的作用;然而，LT对这一过程的潜在机制仍然知之甚少。gydF4y2Ba

本研究旨在阐明LT增强细菌粘附的确切机制。利用IPEC-J2细胞模型，我们证实LT的产生促进了F4 + ETEC与宿主细胞的粘附。此外，粘附的增强主要是由于细菌粘附素和STb肠毒素表达的上调。gydF4y2Ba

细菌菌株，质粒和细胞系gydF4y2Ba

本研究使用的菌株及质粒列于表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．野生型F4 + ETEC菌株C83902 (F4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, LTgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, STpgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba,机顶盒gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)从腹泻仔猪中分离得到gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba，gydF4y2BaΔfaeGgydF4y2Ba，gydF4y2BaΔ警察gydF4y2Ba,gydF4y2BaΔestBgydF4y2Ba突变体(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．1836 - 2 (F4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, EAST1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)是用于表达LT的非致病性ETEC场分离物[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．野生型菌株和突变体在LB肉汤或LB琼脂板上生长。补充C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba/pBR322-eltAB和1836-2/pBR322-eltAB菌株在含100µg/mL氨苄青霉素(Amp+)的LB中培养。猪小肠细胞系iec - j2 (Bio-106,957)购自Biobw，在Dulbecco添加10%热灭活胎牛血清(Gibco)的最小Eagle培养基(Gibco)中培养。gydF4y2Ba

C83902 ETEC和补充菌株C83902等基因突变体的产生gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba/ pBR322-eltABgydF4y2Ba

以野生型ETEC C83902为亲本，采用λ-Red重组法构建等基因突变体[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．使用gydF4y2BaeltABgydF4y2Ba基因为例，氯霉素(Cm)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba用引物从质粒pKD3中PCR扩增出盒式蛋白gydF4y2BaΔgydF4y2BaLT-F和gydF4y2BaΔgydF4y2BaLT-R(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．将纯化的PCR产物导入含pKD46质粒的C83902感受态细胞。初级重组C83902gydF4y2BaΔeltAB:猫gydF4y2Ba在两个Cm上都选择了菌株gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和安保gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba磅的盘子。然后通过引入质粒pCP20消除cm抗性基因，该质粒在42°C下产生FLP重组酶。C83902的成功构建gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba通过PCR和DNA测序结合gm1结合和adp核糖化活性测定等基因突变验证。gydF4y2Ba

的长篇gydF4y2BaeltABgydF4y2Ba采用引物pBR-LT-F和pBR-LT-R对ETEC株C83902全基因组DNA进行PCR扩增(见表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，然后复制到gydF4y2Ba生态gydF4y2BapBR322载体的RV位点。将重组pBR322-eltAB质粒导入等基因突变体C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba生成互补菌株C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba/ pBR322-eltAB。将重组质粒导入野生型ETEC 1836-2构建菌株1836-2/pBR322-eltAB。LT在菌株C83902中的功能表达gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba/pBR322-eltAB和1836-2/pBR322-eltAB通过gm1结合和adp核糖基化活性测定进行验证。gydF4y2Ba

GM1酶联免疫吸附试验(ELISA)gydF4y2Ba

采用GM1 ELISA法检测表达和不表达LT的菌株的GM1结合活性，如前所述[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．简单地说，400ng /well的GM1 (Sigma, MO, USA)作为抗原被包覆在96孔板(Nest，中国)的孔上。接下来，从C83902、C83902中过滤100 μ L培养基gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba, C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba/ pBR322-eltAB、1836 - 2、1836 - 2 / pBR322-eltAB或DH5α细胞添加和孵化37°C 1 h。洗后Tween20与磷酸盐(PBS) 0.05%,每个好孵化100µL anti-CT抗体(1:1000)和100µL辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白(1:5000)37°C 1 h。每个油井的光学密度(OD)然后在450海里添加三甲之后30分钟测量衬底(Beyotime,中国)在室温下。gydF4y2Ba

营测量gydF4y2Ba

将各种菌株过滤后的100 μ L培养基或混合400 μ L DMEM的LB培养基添加到含有融合单层iec - j2细胞的6孔细胞培养板的每孔中，在37℃下孵育1小时。将培养上清移至新管中。细胞在冷PBS中洗涤三次，每孔加入500µL细胞裂解液溶解细胞，0.1 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C浸泡10分钟，去除细胞碎片。接下来，根据制造商的说明，使用cAMP参数检测试剂盒(R&D Systems, USA)，采用竞争性ELISA法测定培养上清液和裂解悬液的cAMP浓度。gydF4y2Ba

细菌生长曲线测定gydF4y2Ba

Etec c83902, c83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba, C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba/pBR322-eltAB、1836-2和1836-2/pBR322-eltAB细胞在玻璃培养管中37°C、200 rpm摇床上培养过夜。第二天，在4 mL新鲜LB培养基中继代培养40 μ L过夜细菌培养物，OD在600 nm (ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba)在6小时内每小时测量一次。gydF4y2Ba

细菌粘附测定gydF4y2Ba

细菌粘附试验如前所述进行[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．简言之，野生型ETEC菌株C83902;突变体C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba, C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba/ pBR322-eltAB C83902gydF4y2BaΔfaeGgydF4y2Ba, C83902gydF4y2BaΔ警察gydF4y2Ba、C83902gydF4y2BaΔestBgydF4y2Ba将野生型ETEC菌株1836-2和1836-2/pBR322-eltAB培养至对数期，约1 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba在24孔细胞培养板(Nest)的每孔中，将细菌菌落形成单位(cfu)添加到融合的单层iec - j2细胞(感染倍数= 30:1)中。共孵育90 min后，用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤去除非粘附菌，用0.25%胰蛋白酶1 mL去除有粘附菌的IPEC-J2细胞。混合悬液，连续稀释(1:10)，并镀在LB板上。在37°C下过夜生长后，测定粘附细菌的菌落数量。gydF4y2Ba

cAMP对ETEC粘附性的影响通过ETEC C83902和C83902进行预孵育实验来测量gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba菌株首先用0、2、5或10 μ M cAMP在37℃下孵育3小时。粘附在IPEC-J2细胞上的细菌数量按上述方法测定。gydF4y2Ba

RNA提取、逆转录、实时定量PCR (qPCR)gydF4y2Ba

ETEC C83902、C83902联合感染IPEC-J2细胞gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba, C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba/pBR322-eltAB, 1836-2，或1836-2/pBR322-eltAB在37°C下放置1.5 h，然后用冷PBS洗涤四次。野生型ETEC C83902细胞用0、2、5或10µM cAMP处理3小时。使用TRIzol试剂(TIANGEN, China)从IPEC-J2细胞和各种细菌样本中提取总RNA，如前所述[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．用琼脂糖凝胶电泳法测定RNA的收率和完整性。采用Nanodrop2000分光光度计(美国Thermo Scientific公司)对260/280比值为1.8 ~ 2.1,260/230比值为1.5 ~ 2.0的样品进行分光光度计RNA质量控制。gydF4y2Ba

每个样品的总RNA(2µg)使用FastKing gDNA diselling RT SuperMix Kit (TIANGEN, China)根据制造商的说明合成第一链互补DNA。内源性内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1 (gydF4y2BaHPRT1gydF4y2Ba)作为内参基因gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,而gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba（gydF4y2Ba我gydF4y2Ba),gydF4y2BacysGgydF4y2Ba选择基因作为IPEC-J2的内参基因。引物对gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba（gydF4y2BaEgydF4y2Ba)，gydF4y2BacysGgydF4y2Ba，gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba（gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)，gydF4y2BaHPRT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaClaudin-1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOccludingydF4y2Ba，gydF4y2BaZO-1gydF4y2Ba，gydF4y2BaZO-2gydF4y2Ba，gydF4y2BaZO-3gydF4y2Ba，gydF4y2Baβ连环蛋白gydF4y2Ba，gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-αgydF4y2Ba，gydF4y2Bail - 6gydF4y2Ba，gydF4y2BaCXCL-8gydF4y2Ba，gydF4y2Bail - 10gydF4y2Ba比例导引,gydF4y2BaSTpgydF4y2Ba，gydF4y2Ba机顶盒gydF4y2Ba，gydF4y2BafaeGgydF4y2Ba，gydF4y2BaetpAgydF4y2Ba,gydF4y2Ba警察gydF4y2Ba使用Primer Express 3.0.1软件(美国赛默飞世尔科学公司)进行设计。利用聚合的cDNA进行优化反应，测定引物浓度。qPCR扩增采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Vazyme, China)，按照厂家说明书进行。对于每个样品，每孔100 ng cDNA和300 nM浓度的引物与10µL AceQ qPCR SYBR Green Master Mix混合。在7500实时系统(美国应用生物系统公司)中运行了一个两步程序。热循环条件为95°C，持续5分钟，然后进行40次循环，95°C，持续10秒，60°C，持续30秒。熔融曲线分析证实引物是基因特异性的，与引物二聚体无关。所有反应均重复4次。细菌的数据归一化到两个内参基因gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba（gydF4y2BaEgydF4y2Ba),gydF4y2BacysGgydF4y2BaIPEC-J2数据归一化为内参基因gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba（gydF4y2Ba我gydF4y2Ba),gydF4y2BaHPRT1gydF4y2Ba．结果用2gydF4y2Ba^{−ΔΔCTgydF4y2Ba}方法。qPCR检测所用的引物均列于表中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

西方墨点法gydF4y2Ba

利用全细胞裂解物western blot检测F4菌毛和鞭毛的表达。简单地说，用0、2、5或10µM cAMP预处理ETEC C83902细菌3 h;然后调整细菌培养到相同的ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba值(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 1.0)。收集上述细菌培养物各1mL，用80µL PBS和20µL 5×SDS加载缓冲液重新悬浮。整个细菌在加载缓冲液中煮沸10分钟裂解。然后，将20µL来自上述细菌培养物的全细胞裂解物在12%变性的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上电泳，然后转移到硝化纤维膜过滤器上。用小鼠抗faeg血清(1:15 000)或兔抗flic进行Western blotgydF4y2Ba_{段H19gydF4y2Ba}(1:20 000)血清为一抗，酶标山羊抗鼠/兔免疫球蛋白IgG (1:10 000, ab克隆，中国)为二抗。采用增强型化学发光(ECL)试剂盒(NCMBiotech, Suzhou, China)检测相应波段。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有统计分析均采用GraphPad Prism 7.0软件进行。数据表示为具有标准差(SD)的平均值。学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba两组间差异的统计比较采用-检验统计分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析两组以上的差异，然后进行Dunnett’s multiple comparison post hoc检验。符号*表示gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05，表示组间差异显著，**表示gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01，组间差异极显著。gydF4y2Ba

C83902的特性gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba等基因突变株1836-2/pBR322-eltABgydF4y2Ba

ETEC菌株C83902表达F4ac菌毛和LT肠毒素，是从水样腹泻猪中分离出的野生型菌株。选择该菌株作为亲本构建gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba同基因的突变。过滤培养基为缺lt的C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba突变体已失去与GM1受体结合的能力(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)。与野生型C83902菌株感染的细胞相比，IPEC-J2细胞裂解液中的cAMP水平(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaB)和培养上清液(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaC)被C83902感染的细胞gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba突变体显著减少。培养基来自补充的C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba/pBR322-eltAB菌株恢复了与GM1受体结合的能力。被补充菌株感染的IPEC-J2细胞的cAMP水平与被亲本菌株感染的细胞相似。与1836-2亲本菌株不同，1836-2/pBR322-eltAB菌株含有pBR322-eltAB质粒强结合GM1gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)并引起高cAMP产生(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba1836-2/pBR322-eltAB株感染IPEC-J2细胞裂解液和培养上清液中cAMP浓度显著高于野生型1836-2株刺激细胞的cAMP浓度。此外，所有菌株都表现出相似的生长速度，这表明LT的表达不影响细菌的生长。gydF4y2Ba

LT促进F4 + ETEC对猪上皮细胞的粘附gydF4y2Ba

研究LT对F4ac + ETEC菌株粘附性的影响，野生型ETEC C83902、C83902的粘附能力gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba缺失LT表达的突变株C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba用IPEC-J2细胞模型检测1836-2菌株中表达LT的/pBR322-eltAB、野生型ETEC 1836-2和1836-2/pBR322-eltAB。如图所示gydF4y2Ba2gydF4y2BaA, C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba与亲本株相比，突变株对IPEC-J2细胞的粘附能力显著降低(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)，而补充菌株表现出与野生型菌株相似的粘附能力。细菌CFU定量结果表明gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba突变株的粘附性比亲本株C83902低87%左右。此外，与野生型1836-2菌株相比，1836-2菌株(1836-2/pBR322-eltAB)中LT的表达显著增强了粘附性(图36-2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaB,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)。1836-2/pBR322-eltAB菌株的粘附能力大约是野生型1836-2菌株的6.5倍。这些结果表明LT促进了F4 + ETEC细菌的粘附。gydF4y2Ba

LT的表达增加了IPEC-J2细胞中炎症因子和趋化因子的表达gydF4y2Ba

通过RT-qPCR检测TNF-α、IL-6、CXCL-8和IL-10的转录水平，以确定LT在刺激炎症细胞因子和趋化因子产生中的作用。结果表明，这些细胞因子和趋化因子的产生由IPEC-J2感染gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba与野生型菌株感染的细胞相比，突变株显著减少(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)。删除gydF4y2BaeltABgydF4y2BaTNF-α、IL-6、CXCL-8、IL-10基因表达分别降低4.87±0.36-、5.79±0.28-、4.53±0.46-、3.97±0.27倍。补充的C83902感染gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba/pBR322-eltAB菌株使这些炎性细胞因子和趋化因子基因的表达恢复到野生型感染诱导的水平。1836-2/pBR322-eltAB感染细胞的TNF-α、IL-6、CXCL-8和IL-10基因表达水平明显高于亲本1836-2菌株(图3)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)。这些数据表明，感染产生LT的ETEC株的IPEC-J2细胞产生较高水平的炎症细胞因子和趋化因子主要归因于LT的分泌。gydF4y2Ba

紧密连接蛋白的表达不受LT的影响gydF4y2Ba

为评价LT对肠上皮屏障的影响，采用RT-qPCR检测IPEC-J2细胞紧密连接蛋白的表达。数据显示IPEC-J2细胞感染了gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Baclaudin-1、occludin、ZO-1、ZO-2、ZO-3、β-catenin的表达与亲本株感染的细胞相比无明显变化。同样，在感染野生型1836-2的IPEC-J2细胞和感染1836-2/pBR322-eltAB菌株的IPEC-J2细胞之间，这些连接蛋白的水平没有显著差异。这些结果表明LT似乎不影响IPEC-J2细胞中紧密连接蛋白的表达。gydF4y2Ba

cAMP增强了F4 + ETEC菌株粘连素的表达gydF4y2Ba

接下来，我们用不同浓度的cAMP(0-10µM)处理野生型C83902菌株，以评估细菌粘连素表达的潜在变化。FaeG和FliC在两种转录水平上表达均显著增加(图gydF4y2Ba4gydF4y2BaA)和蛋白质水平(图gydF4y2Ba4gydF4y2BaB).如图所示gydF4y2Ba4gydF4y2BaA, FaeG和FliC的表达在5µM cAMP处理的细胞中分别上调2.33±0.12-和2.95±0.12倍，在10µM cAMP处理的细胞中分别上调4.68±0.18-和5.51±0.23倍。这些结果表明，cAMP以浓度依赖的方式增加F4菌毛和鞭毛蛋白的表达。gydF4y2Ba

cAMP增强了STb毒素的表达gydF4y2Ba

探讨LT刺激cAMP是否影响F4 + ETEC中其他肠毒素的表达，其mRNA水平gydF4y2Ba问好gydF4y2Ba(STp)gydF4y2Bad estBgydF4y2Ba(STb)在不同浓度cAMP刺激下进行检测。结果显示，cAMP显著增强了STb肠毒素的表达(图gydF4y2Ba4gydF4y2BaA).在5和10µM cAMP处理的细胞中，STb肠毒素的表达分别上调了约1.8-和2.8倍。但STp肠毒素在各处理条件下的表达均未发生变化(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

cAMP治疗促进F4 + ETEC的粘附gydF4y2Ba

为了确定cAMP诱导的F4菌毛、鞭毛蛋白和STb肠毒素表达的增加是否可能导致ETEC粘附的增加，我们比较了野生型C83902和C83902的能力gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba突变体粘附在cAMP处理或未处理的IPEC-J2细胞上。结果表明，cAMP处理显著增加了野生型C83902和C83902gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba变异的依从性。野生型C83902经2、5和10µM cAMP处理后，粘附能力分别提高了约1.3-、2.0-和3.0倍(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．同时，提高学生的粘附能力gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba在2、5和10µM cAMP处理后，突变体分别增加了2.7-、6.0-和12.0-倍(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．这些结果表明cAMP增强ETEC粘附，可能是通过增加F4菌毛、鞭毛蛋白和STb肠毒素表达介导的。gydF4y2Ba

ΔfaeGgydF4y2Ba，gydF4y2BaΔ警察gydF4y2Ba，gydF4y2Ba而且gydF4y2BaΔestBgydF4y2Ba等基因突变体减少对IPEC-J2细胞的粘附gydF4y2Ba

如图所示gydF4y2Ba6gydF4y2Ba, C83902gydF4y2BaΔfaeGgydF4y2Ba, C83902gydF4y2BaΔ警察gydF4y2Ba、C83902gydF4y2BaΔestBgydF4y2Ba突变体相对于亲本株显著降低了粘附IPEC-J2细胞的能力。细菌集落形成单位(cfu)的定量分析表明C83902gydF4y2BaΔfaeGgydF4y2Ba与野生型C83902株相比，等基因突变株的粘附性降低了56%。的C83902gydF4y2BaΔ警察gydF4y2Ba突变体显示其粘附IPEC-J2细胞的能力降低了32%。而C83902gydF4y2BaΔestBgydF4y2Ba突变株的粘附性也比亲本株低48%。说明F4 + ETEC粘附于IPEC-J2细胞过程中，F4的毛、鞭毛和STb肠毒素均参与其中。gydF4y2Ba

LT促进肠道病原体粘附的机制尚不清楚[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．为了研究LT促进ETEC粘附的作用，我们对从腹泻仔猪和C83902分离的ETEC野生型菌株C83902 (LT+) ETEC的粘附能力进行了评估gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba利用IPEC-J2细胞模型检测到突变株(LT-)，以及不产生LT的1836-2 ETEC株及其表达LT的株1836-2/pBR322-eltAB。IPEC-J2是从新生仔猪空肠中段分离的非转化柱状上皮细胞系。IPEC-J2细胞在形态和功能上与肠上皮细胞相似，具有粘蛋白和紧密连接，产生细胞因子和趋化因子，表达toll样受体。因此，该细胞系是研究肠道病原体发病机制、复杂病原体-宿主相互作用和宿主免疫反应的理想体外模型[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．与之前的结果一致，我们发现粘附能力gydF4y2BaΔeltABgydF4y2Ba与野生型菌株相比，突变株显著受损，而补充菌株的粘附能力恢复了[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．此外，在ETEC 1836-2菌株中表达LT显著增加了对IPEC-J2细胞的粘附。我们的数据证实了LT在体外促进ETEC粘附的作用。此外，我们发现LT通过增加F4菌毛、鞭毛和STb肠毒素表达来增强ETEC粘附。gydF4y2Ba

本研究有四个重要的新贡献。首先，我们的研究结果表明，LT不仅通过增加F4绒毛(mRNA和蛋白水平)的表达，还通过增加鞭毛(mRNA和蛋白水平)和STb (mRNA水平)的表达，增强了F4 + ETEC对IPEC-J2的粘附。此外，C83902的粘附性也证实了上述结果gydF4y2BaΔfaeGgydF4y2Ba, C83902gydF4y2BaΔ警察gydF4y2Ba、C83902gydF4y2BaΔestBgydF4y2Ba与亲本株相比，突变体数量显著减少。其次，我们检测了促炎细胞因子和趋化因子，以及IPEC-J2在感染产生lt或缺乏lt的菌株后的紧密连接基因表达。我们的研究结果表明，LT的产生增加了炎症细胞因子(TNF-α， IL-6, IL-8和IL-10)的表达。虽然没有改变细胞的紧密连接，但我们不排除LT升高的炎症因子可能通过其他方式(凋亡或焦亡)破坏细胞结构，促进粘连。第三，我们用cAMP处理菌株，而不是用lt处理的IPEC-J2培养上清液。事实上，细胞上清中的成分过于复杂，不能完全排除其他因素对F4菌毛表达的影响。在体外细菌培养物中加入纯化的cAMP可以更直接地评价LT肠毒素诱导的cAMP对粘连素表达的影响。第四，病原体引起的感染是多因素的，比以前所知道的要复杂得多。我们的研究结果表明，LT, STb, F4, fimbriae和鞭毛在F4 + ETEC中是串扰。gydF4y2Ba

肠上皮细胞是激活肠道病原体感染的先天免疫的重要组成部分。前期研究表明，猪IEC感染F4 + ETEC可诱导促炎细胞因子的产生，F4菌毛和鞭毛蛋白在这一过程中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．与本研究一致的是，我们检测了产生LT或缺乏LT的F4 + ETEC感染IPEC-J2细胞后，炎症因子TNF-α、IL-6、CXCL-8和IL-10的相对基因表达，提示体外LT刺激后IPEC-J2细胞对炎症反应的调控。尽管IPEC-J2细胞比其他细胞系更接近于模拟肠道系统，但由于它只是一个同质细胞群，不能代表复杂的生理肠道系统。据报道，几种免疫相关分子在该细胞系中检测不到或表达水平非常低[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．此外，IPEC-J2是一种非转化柱状上皮细胞系。为了模拟体内条件，必须将其培养在Transwell膜插入物上，在体外形成极化功能单层和紧密连接。因此，我们得到的结果还需要在蛋白水平和分化细胞中进一步证实。gydF4y2Ba

炎症过程对组织修复和病原体的清除很重要。然而，过度炎症破坏上皮紧密连接，促进组织损伤。肠上皮在宿主抵抗ETEC感染的第一线防御中起屏障作用，紧密连接蛋白在维持肠粘膜屏障功能中起重要作用[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．为应对肠道病原体而分泌的促炎细胞因子也可能破坏上皮紧密连接，并有助于增加细菌粘附。因此，我们进一步研究了增强的ETEC粘附是否会破坏lt诱导的IPEC-J2细胞的紧密连接，从而增加炎症细胞因子和趋化因子的产生。然而，先前的研究报道，ETEC感染会通过降低紧密连接蛋白的表达来破坏粘膜屏障的紧密连接结构[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．然而，LT的分泌似乎不影响紧密连接蛋白的表达，这表明LT增强的细菌粘附不是通过破坏肠粘膜屏障来实现的。gydF4y2Ba

然后我们检测了F4绒毛受体的表达，这可能也有助于粘附的增加。高分子量肠黏蛋白型唾液糖蛋白(IMTGPs)和猪氨基肽酶N (APN)是迄今为止鉴定的F4绒毛的两种受体[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．先前的研究表明LT不影响IMTGP受体的表达[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．Melkebeek等人已经证明猪APN是F4绒毛的内吞受体[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．在这项研究中，我们证明了LT的产生也不影响APN受体的表达(数据未显示)。这些结果表明，LT诱导的细菌粘附增加并非由于F4菌毛受体表达上调所致。最近，Sheikh等人证明LT可增加I型菌毛受体的表达，进而增强人ETEC菌株对人小肠上皮细胞的粘附[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．因此，我们不排除LT通过增加其他菌毛受体的表达来促进F4 + ETEC与IPEC-J2细胞的粘附。gydF4y2Ba

cAMP是一种重要的细胞“第二信使”，在调节细菌毒性决定因子中发挥作用。黏着素是病原体-宿主相互作用的必要条件，在ETEC发病机制中起着重要作用。因此，我们假设与LT表达相关的黏附增加可能归因于细菌黏附蛋白表达的增强。F4缘毛和鞭毛是两种已知的主要粘附素，介导F4 + ETEC与宿主细胞的粘附[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．前期研究表明cAMP刺激可增加F4、987P、I型菌毛的表达[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．与之前的结果一致，我们的结果揭示了野生型C83902和C83902的预处理gydF4y2BaΔeltABgydF4y2BacAMP突变体也能显著增加其F4绒毛和鞭毛的表达，随后粘附于IPEC-J2细胞。但本研究中用于刺激F4 + ETEC菌株的cAMP浓度高于生理相关的cAMP浓度。因此，生理浓度cAMP是否对增强F4 + ETEC毒力因子表达和粘附能力具有同样的作用，还需要进一步研究。gydF4y2Ba

毒力因子以多种方式促进病原体感染。除了液体积累，LT肠毒素在体外和体内都能增强细菌粘附。与Erume等人的研究结果相反[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，我们观察到cAMP升高的STb肠毒素增加了F4 + ETEC对IPEC-J2细胞的粘附性，而删除STb导致粘附性降低。这可能是由于体外细胞模型缺乏体内发生的液体冲洗效应。既往研究表明STb肠毒素可改变粘膜紧密连接蛋白的表达[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]并诱导细胞凋亡[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．因此，STb肠毒素增加的细菌粘附也可能通过破坏肠屏障的完整性来实现。有报道称，在产生这三种肠毒素的F4ac + ETEC菌株中，LT、STp和STb肠毒素的表达被共同调节[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．最近，有报道称ETEC - j2细胞分泌的热敏分子增加了ETEC对STp和STB肠毒素的分泌[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．然而，LT的产生共同调节其他毒力因子表达的确切机制尚不清楚，需要进一步研究。gydF4y2Ba

综上所述，本研究结果表明，LT可上调F4菌毛、鞭毛和STb肠毒素的表达。这可能在一定程度上有助于LT促进ETEC与肠上皮细胞的粘附。此外，在ETEC中LT和其他毒力因子的表达是共同调控的。我们的结果表明，LT在几个方面有助于ETEC的发病机制。这些发现有助于深入了解LT的功能和致病机制，并有助于制定预防ETEC感染的新策略。gydF4y2Ba

APN:gydF4y2Ba

氨肽酶NgydF4y2Ba

阵营:gydF4y2Ba

环腺苷酸gydF4y2Ba

CEACAMs:gydF4y2Ba

癌胚抗原相关细胞粘附分子gydF4y2Ba

菌落:gydF4y2Ba

菌落gydF4y2Ba

CT:gydF4y2Ba

霍乱毒素gydF4y2Ba

ELISA:gydF4y2Ba

酶联免疫吸附试验gydF4y2Ba

ETEC:gydF4y2Ba

产肠毒素大肠杆菌gydF4y2Ba

IMTGPs:gydF4y2Ba

高分子量肠黏蛋白型唾液糖蛋白gydF4y2Ba

LT:gydF4y2Ba

Heat-labile肠毒素gydF4y2Ba

OD:gydF4y2Ba

光密度gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸盐gydF4y2Ba

qPCR:gydF4y2Ba

实时定量PCRgydF4y2Ba

sds - page:gydF4y2Ba

Sodium-dodecyl-sulfate-polyacrylamide凝胶gydF4y2Ba

SD:gydF4y2Ba

标准偏差gydF4y2Ba

作者对资金支持表示感谢。gydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(No. 31800121)、江苏省科技局项目(BE2022348)、江苏省重大动物传染病与人畜共患病防治国际合作联合实验室和江苏省高校重点学科建设项目(PAPD)资助了本研究。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 段强德和庞胜美对这项工作有同样的贡献gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 扬州大学动物医学院，扬州225009gydF4y2Ba

   段强德，庞胜美，刘佳琪，吕林芬，李宝亮，梁宇轩，朱国强gydF4y2Ba

2. 江苏省重大动物传染病与人畜共患病防控协同创新中心，扬州225009gydF4y2Ba

   段强德，庞胜美，刘佳琪，吕林芬，李宝亮，梁宇轩，朱国强gydF4y2Ba

3. 江苏省重大动物传染病与人畜共患病国际防控合作联合实验室，扬州225009gydF4y2Ba

   段强德，庞胜美，朱国强gydF4y2Ba

4. 河南省农业科学院农业经济与信息研究所，河南郑州450002gydF4y2Ba

   丽丽冯gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

DQ和ZG设计实验，DQ和PS撰写稿件并进行大部分数据分析，LJ和LF进行细菌粘附实验，LB和LY进行qRT-PCR实验，FL对稿件进行修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaQiangde段gydF4y2Ba或gydF4y2Ba提供关于朱gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

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